En metod för framställning av halvledarnanoporer i lösning för biomolekylära transloka experiment presenteras. Genom att tillämpa korta pulser av höga elektriska fält, kan nanopore diameter vara reglerbart förstoras med subnanometer precision och dess elektriska bulleregenskaper förbättrats avsevärt. Denna procedur utförs in situ med användning av standardlaboratorieutrustning under experimentella förhållanden.
Solid-state nanopores har dykt upp som ett mångsidigt verktyg för karakterisering av enskilda biomolekyler såsom nukleinsyror och proteiner 1. Men skapandet av en nanopore i ett tunt isolerande membran är fortsatt utmanande. Tillverkningsmetoder som involverar specialiserade fokuserad elektronstrålesystem kan producera väldefinierade nanoporer, men avkastningen av pålitliga och tystgående nanoporer i kommersiellt tillgängliga membran är fortsatt låg 2,3 och storlek kontroll är nontrivial 4,5. Här, tillämpning av höga elektriska fält för att finjustera storleken på nanopore samtidigt säkerställa en optimal låg-brusprestanda demonstreras. Dessa korta pulser av höga elektriska fält används för att producera en ren elektrisk signal och möjliggör utvidgning av nanoporer med subnanometer precision vid långvarig exponering. Denna metod utföres in situ i en vattenhaltig miljö med användning av standardlaboratorieutrustning, förbättra utbytet och reproducerbarhet solid-state nanopore tillverkning.
Biologisk och solid-state nanopores tillhandahålla ett sätt att känna av biomolekylära analyter vid enda molekyl nivå 1. Individuella nanoporer är vanligtvis inbäddade i tunna isolerande membran, som ger den enda kanal för jonisk ström att passera mellan två flytande reservoarer. Med hjälp av principerna för storskaliga Coulter räknare, nanopore experiment relatera förändringar i jonström att bestämma längd, storlek, laddning och konformation av laddade biomolekyler som de elektro drivs genom en nanopore i närvaro av ett yttre elektriskt fält.
Även biologiska nanoporer såsom α-hemolysin erbjuder ofta större känslighet och låg brusegenskaperna 3, är den bärande lipidbiskiktet bräcklig och av fast storlek, vilket begränsar deras användbarhet. Solid-state nanoporer, å andra sidan, är tillverkad i tunt (10-50 nm) kiselnitrid eller kiseloxidmembran och kan vara gjorda av olika sizes, lätt integreras med wafer-skala teknik 6,7, och är mer robusta, vilket möjliggör ett bredare spektrum av experimentella förhållanden. Trots dessa fördelar, halvledarteknik nanopore lider av flera praktiska nackdelar som begränsar deras användbarhet för biomolekylära studier. Även kontroll av nanopore storlek är möjligt, är det oftast dyrt och besvärligt att uppnå, som kräver specialutrustning och kompetent personal. Till exempel nanoporer borrade genom fokuserad-jonstråle har nyligen visat att krympa under specifika experimentella betingelser i ett svepelektronmikroskop (SEM) 5. Med andra metoder kan nanoporer borrade genom transmissionselektronmikroskopi (TEM) expandera eller krympa beroende på balkförhållanden och efterföljande exponering för vattenhaltiga lösningsmedel 8. I dessa fall är begränsad, svår att kontrollera och även otillförlitliga den uppnå intervallet nanopore storlekar som storleken nanoporen kan förändras till följd av kemisk behandling ellernär nedsänkt i en speciell vätska miljö 9.
Jonströmmen genom solid-state nanopores kan också drabbas av högt buller, källorna som är en intensivt undersökt ämne i nanopore litteraturen 2,3,10,11. Medan olika metoder har föreslagits för att minska elektriska störningar, är utbytet av tillförlitliga, stabila låg brusnanoporer vanligtvis lågt. Deponering av kolhaltiga rester vid borrning och bildbehandling kan ha skadliga effekter på den elektriska signalkvalitet, vilket ofta gör fullständig vätning en utmaning och orsakar bildandet av nanobubbles som kan vara svåra att ta bort 12. Dessutom igensättning av nanopore med analytmolekyler försämrar signalkvaliteten rendering porer oanvändbar för vidare experiment 13,14. Sammantaget dessa effekter kraftigt minska utbytet av funktionella nanopore enheter och öka kostnaderna i samband med solid-state nanopore forskning.
Tillämpningenning av en spänning med Ag / AgCl-elektroder för att producera höga elektriska fält i intervallet 0,15 till 0,3 V / nm uppvisar en förvånansvärt enkel lösning på dessa utmaningar. Genom den cykliska tillämpningen av korta spänningspulser, en ren, lågt brus nanopore yta idealisk för enda molekyl studier produceras. Långvarig exponering för höga elektriska fält initierar avlägsnandet av membranmaterialet som bildar por vägg, vilket resulterar i en ökning av nanopore diameter. Denna tillväxt kan justeras genom att ställa puls styrka och varaktighet. Som nuvarande spår degraderar under loppet av ett experiment på grund av igensättning av nanopore som molekyler adsorberas till nanopore ytan, kan denna process upprepas för att återställa igensatta anordningar som annars skulle ha kasse. Som sådan är utbytet av funktionella nanoporer ytterligare ökas genom förmågan att använda samma apparat flera gånger. Denna metod ger flera fördelar, eftersom det snabbt utföras i vätskan under experimentellförhållanden, kräver endast standardlaboratorieutrustning, kan automatiseras med programvara, och producerar funktionella högkvalitativa nanoporer med en avkastning på över 95%.
Kontroll av nanopore storlek är av grundläggande betydelse i biomolekylära analystillämpningar. Nanopore diameter måste vara på order av storleken på de molekyler som sonderade, de måste vara tillräckligt stor för att rymma provet men tillräckligt liten för att uppnå optimal signal-till-brus. Även kontrollen av storlek med hjälp av den metod som presenteras att tillämpa höga elektriska fält är enkelriktad i att nanopore diametrar bara ökat under hela processen, kan nanoporer med diametrar mellan 3-100 nm vara gammalmodiga, med subnanometer precision. Som 3-4 nm porer lätt kan tillverkas med hjälp av en TEM 23, gör detta för tillförlitlig tillverkning av solid-state nanopores för ett brett spektrum av applikationer från sondering ssDNA struktur för samverkan mellan skrymmande protein-ligand-komplex. Medan nanopore tillväxt över 100 nm kan vara mycket snabb och mindre exakt, kan mer moderata förstorande villkor användas för att få bättre kontroll över processen. Som such, är det viktigaste steget för att uppnå en effektiv storlek styr valet av pulsstyrka och längd för att balansera utvidgad effektivitet och precision som krävs för att uppnå en önskad pordiameter. Detta belyses ytterligare av utvidgningen av tunnare nanoporer (10-nm tjocklek), där utvidgningen observeras ett lägre partiskhet men jämförbar elektrisk fältstyrka. Beroende på den slutliga storleken, är det i allmänhet möjligt att förstora en nanopore till sub-100-nm diameter på några få minuter.
Likaså stora lågfrekventa strömsvängningar utesluter enda molekyl studier eftersom det är nästan omöjligt att skilja sloka signaler från bakgrundsljud. Ofullständig vätning 24 kan närvaron av kolhaltiga rester som återstår efter initial tillverkning 25 och adsorption av skräp på nanoporen vägg 13 försämra signalkvaliteten, vilket kräver ytterligare rengöring med starka kemiska behandlingar som ofta är inefficacious. Intressant nog är det vanligt att solid-state nanopore protokoll för att betona vikten av rengöring av nanopore i piraya-lösning eller med syrgasplasma innan montering för att underlätta vätning eller ta bort föroreningar kvar från borrning, bild-och hanteringsprocesser. Även med denna behandling är dock nanoporer gör ofta inte våt eller fortsätter att uppvisa höga ljud, och den föreslagna lösningen för misslyckade försök är att utföra extra städning som kan vara mycket tidskrävande 14. Med tillämpning av höga elektriska fält, kan dessa långa protokoll inte vara nödvändigt beroende på tillämpning. Det visade sig att de flesta enheter kan renoveras på plats med hjälp av den metod som beskrivs här, alltså minska förberedelsetid och behovet av att ta itu med starka kemikalier. De viktigaste stegen i att lindra elektriska störningar är en enkel ökning av spänning och / eller pulslängd för att helt väta porerna och ta bort löst bundet skräp.Nanopores som behandlats på detta sätt kan på ett tillförlitligt sätt kan användas i biomolekyl sloka experiment, såsom passagen av DNA och proteiner. Om dessa molekyler ansluta sig till por väggen som leder till en igensatt och högljudd elektrisk signal, kan höga elektriska fältpulser appliceras på nytt för att avlägsna hindret och återfå låg brusegenskaper för ytterligare experiment, utan att lossa på nanopore chip från fluidic cellen.
Tillämpningen av höga elektriska fält med installationen som beskrivs begränsas av kravet på en extern strömkälla som kan gälla upp till 10 V och strömförstärkare, som saknar den känslighet och låg brusegenskaperna vid hög bandbredd (> 1 kHz) för enda molekyl avkänning. Medan vanliga biomolekylära experiment förlita sig på en låg brusströmförstärkare som är begränsad till ± 1 V, är det enkelt att utforma ett system som kunde åstadkomma både hög elektrisk fältkonditionering och känslig strömmätning med en anpassar sig efter typenstabil vinst. Trots denna begränsning, är övergången från en inställning till en annan snabb och okomplicerad. I jämförelse med existerande teknik för kontroll av nanopore storlek såsom användning av SEM 5, termisk oxidation och membran omforma 8, höga elektriska fält ger en snabbare, mer exakt och mindre kostsam metod som kan utföras på laboratoriebänken med hjälp av standardutrustning och ger ett bredare utbud av nanopore storlekar. Förmågan att snabbt och reproducerbart reducerar lågfrekventa ljud gör också initial tillverkning mer tillförlitlig och förlänger livslängden på solid-state nanopores, som tidigare använts porer kan föryngras för ytterligare experiment. Totalt över 95% av nanoporer av varierande tjocklek rade med höga elektriska fält uppvisade mycket lite lågfrekvent buller egenskap, vilket gör dem lämpliga för biomolekyler avkänning. Fabrication är således enklare och mer tillförlitlig, vilket gör solid-state nanopore experiment mer gängligt för forskare och potentiellt möjliggör en väg mot kommersialisering av nanopore teknik genom mer robusta tillverkningsprocesser.
The authors have nothing to disclose.
Vi erkänner stöd av naturvetenskaplig och teknisk forskning Council of Canada, Canada Foundation for Innovation, och Ontarioforskningsfonden. Vi tackar Y. Liu om stöd nanopore tillverkning och karakterisering, L. Andrzejewski för värdefulla diskussioner och teknisk support, och A. Marziali för hjälp med nanopore mjukvara och instrumentering design.
JEM-2100F TEM | JEOL | Drilling requires 200 kV accelerating voltage | |
Axon Axopatch 200B patch-clamp amplifier | Molecular Devices | Low-noise voltage and current amplifier | |
X-Series data acquisition card | National Instruments | PCI-6351 | Interfacing with setup, apply of high electric fields |
LabVIEW 2012 software | National Instruments | Apply voltages, record current, data analysis | |
Current amplifier | Keithley | Current amplification during high electric field pulses | |
30-nm thick silicon nitride TEM membrane windows | Norcada Inc. | NT005X | Substrate in which nanopores are created |
10-nm thick silicon nitride TEM membrane windows | Norcada Inc. | NT005Z | Substrate in which nanopores are created |
Silicone elastomer O-rings | Marian Chicago | HT6135 | Punched for sealing the nanopore chip |
Ag/AgCl electrodes | In Vivo Metric | E255 | |
Nitric acid | Fisher Scientific | 52004P | Used for cleaning cells – handle with caution |
Hydrogen peroxide | Fisher Scientific | H323 | Used for piranha solution – handle with caution |
Sulfuric acid | Fisher Scientific | A300 | Used for piranha solution – handle with caution |
Potassium chloride | Fisher Scientific | P335 | |
HEPES | Fisher Scientific | BP310 | Buffering KCl solution |
Primary Faraday cage | Shielding nanopore cell, electrodes | ||
Secondary Faraday cage | Shielding headstage, electrode wires | ||
Teflon cell | To hold nanopore chip and reservoirs | ||
Hot plate | VWR | Heating piranha solution |