Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Engineering

Точная настройка размера и Минимизация шума полупроводниковых нанопор

doi: 10.3791/51081 Published: October 31, 2013

Summary

Методология подготовки полупроводниковых нанопор в растворе для биомолекулярных экспериментов транслокационных представлена. Применяя короткие импульсы сильных электрических полях, диаметр нанопор может быть контролируемо пополнился субнанометровой точностью и его электрическая шумовые характеристики значительно улучшены. Эта процедура выполняется на месте с использованием стандартного лабораторного оборудования в экспериментальных условиях.

Abstract

Полупроводниковых нанопор появились как универсальный инструмент для характеристики отдельных биомолекул, таких как нуклеиновые кислоты и белки 1. Тем не менее, создание нанопор в тонкого изоляционного мембраны остается сложной. Способы изготовления с участием специализированных систем целенаправленной электронных лучей может производить четкие нанопор, но выход надежных и малошумных нанопор в коммерчески доступных мембран остается низким 2,3 и контроль размер нетривиально 4,5. Здесь, применение сильных электрических полях для тонкой настройки размер нанопор при одновременном обеспечении оптимальной производительности с низким уровнем шума демонстрируется. Эти короткие импульсы сильного электрического поля используются для производства нетронутой электрический сигнал и позволяют для увеличения нанопор с точностью субнанометровой на длительном воздействии. Этот способ выполняется на месте в водной среде с помощью стандартного лабораторного оборудования, повышение урожайности и воспроизводимость снанопор изготовление Olid-государство.

Introduction

Биологическое и полупроводниковых нанопор обеспечивают средства зондирования биомолекулярные анализируемых на уровне одной молекулы 1. Индивидуальные нанопор, как правило, встроены в изолирующих мембран, обеспечивая только трубопровод для ионного тока, чтобы пройти между двумя жидкими водоемов. Используя принципы крупномасштабных Coulter счетчиков, нанопор эксперименты касаются изменений в ионного тока для определения длины, размер, заряд и конформации заряженных биомолекул, как они электрофореза приводом через нанопоры в присутствии внешнего электрического поля.

В то время как биологические нанопор, такие как α-гемолизина как правило, предлагают более высокую чувствительность и низким уровнем шума свойства 3, поддерживая липидный бислой является хрупким и фиксированный размер, что ограничивает их применение. Полупроводниковых нанопор, с другой стороны, изготовлены в тонкой (10-50 нм) нитрида кремния или оксида кремния мембран и может быть изготовлена ​​из различных SIZэс, легко интегрируется с пластины масштабных технологий 6,7, и являются более надежными, что позволяет использовать более широкий спектр экспериментальных условиях. Несмотря на эти преимущества, технологии твердотельных нанопор страдают от ряда практических недостатков, которые ограничивают их полезность для биомолекулярных исследований. В то время как контроль размера нанопор возможно, оно, как правило, дорого и трудоемко для достижения, требуя специального оборудования и квалифицированного персонала. Например, нанопоры, пробуренные сфокусированного ионного пучка были недавно показано, чтобы уменьшить при определенных экспериментальных условиях в сканирующем электронном микроскопе (СЭМ) 5. В других подходах, нанопор, пробуренные с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) может увеличить или уменьшить в зависимости от условий пучка и последующего воздействия водных растворителях 8. В этих случаях достижима диапазон размеров нанопор ограничен, трудно контролировать, и даже ненадежны как размер нанопор может изменить следующий химической обработки илипри погружении в определенной жидкой среде 9.

Ионный ток через полупроводниковых нанопор также могут страдать от повышенного шума, источники которых интенсивно исследуются темы в нанопор литературы 2,3,10,11. В то время как различные методы были предложены для уменьшения электрического шума, доходность надежных, стабильных малошумящих нанопор как правило, низка. Отложение углеродистых остатков в процессе бурения и обработки изображений могут иметь пагубные последствия для электрической качества сигнала, часто делая полное смачивание вызов и вызывая образование нанопузырьков, которые могут быть трудно удалить 12. Кроме того, засорение нанопор молекулами анализируемого вещества ухудшает качество сигнала рендеринга поры непригодным для дальнейшего эксперимента 13,14. В целом, эти эффекты значительно уменьшить выход функциональных устройств нанопор и увеличивает затраты, связанные с исследованиями твердотельного нанопор.

Применимостьции напряжения с Ag / AgCl электроды для получения высоких электрических полей в диапазоне 0,15-0,3 V / нм представляет собой удивительно простое решение этих проблем. Через циклического применения коротких импульсов напряжения, чистой, с низким уровнем шума нанопор поверхности идеально подходит для одиночных молекул исследований производится. Продолжительное воздействие высоких электрических полей инициирует удаление мембранного материала, образующего стенки поры, в результате чего увеличение диаметра нанопор. Этот рост может быть точно управлять, подстраивая силу и длительности импульса. Поскольку текущие следы ухудшить течение эксперимента из-за засорения нанопор как молекулы адсорбируются на поверхности нанопор, этот процесс может повторяться для восстановления забиты устройства, которые иначе были бы отброшены. Таким образом, доходность функциональных нанопор дополнительно увеличивается за счет возможности использовать то же устройство несколько раз. Этот способ имеет несколько преимуществ, как он быстро выполняется в жидкости под экспериментальныеусловия, требуется только стандартный лабораторного оборудования, могут быть автоматизированы с помощью программного обеспечения, а также производит функциональные высококачественные нанопор с выходом более 95%.

Protocol

1. Nanopore Изготовление и чистка

Примечание: После нанопор существует в изолирующей мембраны, он может быть установлен непосредственно в жидком клетки без дальнейшей обработки или очистки, как описано в пункте 2. Тем не менее, если это необходимо для удаления следов загрязнений между экспериментами, нанопор чипы могут быть очищены с использованием либо пираньи решение 3,15,16 (3:01 H 2 SO 4: H 2 O 2) или под воздействием кислорода плазмы 2. Таким образом, шаги от 1,2 до 1,9 в следующей методике являются необязательными, если предварительной очистки воздействием пираньи растворе не является необходимым.

  1. Дега фильтруется деионизированной (ДИ) воды, поместив его под вакуумом в ультразвуковом в течение 30 мин при 40 ° С
  2. Подготовка пираньи раствор в 10 мл химический стакан, осторожно добавлением 3 мл серной кислоты с последующим добавлением 1 мл перекиси водорода. Тщательно перемешать кипячением в пипетку. ВНИМАНИЕ: решение Пиранья крайне опасно. Пожалуйста, та ке все меры предосторожности.
  3. Использование кислотоупорные пинцет, осторожно вставьте нанопор содержащих мембранный чип краем вперед в пираньи решения, чтобы полностью погрузить чип и избегать его плавает на поверхности.
  4. Промыть пинцет тщательно в фильтрованной воды.
  5. Поместите стакан на горячей тарелке предустановки до 90 ° С и дайте ему очистить по крайней мере 30 мин.
  6. Осторожно снимите пираньи решение из стакана с помощью чистой стеклянной пипетки и выбросить в большим количеством воды.
  7. Используя чистую стеклянную пипетку добавить 5 мл дегазированной деионизированной воды, начиная с шага 1.1 в стакан для полоскания. Удалить воду и повторить по крайней мере 5x.
  8. Осторожно снимите чип нанопор из стакана с использованием чистых острыми наконечник пинцет. Ручка с особой осторожностью, так как нанопор мембрана очень хрупкая.
  9. Высушите чип, осторожно применяя всасывания его края с помощью аспиратора. Хранить не чип в чистой чашке Петри до готовности к использованию.
ve_title "> 2. Монтаж нанопор

  1. Очистите нанопор ячейку тефлоновую (рис. 1), поместив в 20%-ном растворе азотной кислоты и кипячения в течение 10 минут. ВНИМАНИЕ: Используйте всю необходимую средства индивидуальной защиты и обрабатывать кислоты с осторожностью.
  2. Осторожно удалите ячейку из азотной кислоты и место в кипящей дистиллированной воды в течение 10 мин.
  3. Варить ячейку в деионизированной воде в течение дополнительных 10 мин, чтобы обеспечить полное удаление азотной кислоты. Снимите стакан с горячей плите и дайте ему остыть до комнатной температуры.
  4. Извлеките ячейку из стакана и просушите отфильтрованного воздуха или N 2. Храните ячейку в чистом чашке Петри.
  5. Дега отфильтрованный раствор KCl (забуференный HEPES с рН 8), поместив под вакуумом в ультразвуком в течение 30 мин при 40 ° С
  6. Чистые две силиконовые эластомеры прокладки для каждого чипа нанопор по ультразвуком в этаноле в течение не менее 10 мин.
  7. Поместите чип нанопор на чистую эластомер прокладки бытия Carefuл для выравнивания окно мембраны с отверстием прокладки. Поместите и выровнять вторую прокладку поверх чипа.
  8. Поместите чип и прокладки на входе резервуара одной половины очищенную нанопор клетки. Соберите в клетку путем завинчивания другую половину на месте. Разобранном виде компонентов нанопор клеток показан на рисунке 1.
  9. Смочите чип нанопор с помощью пипетки этанола в клеточные резервуаров и размещение в вакуумной камере, пока несколько пузырьков не видно, чтобы выйти из бухты.
  10. Удалить этанола путем промывки резервуаров, по крайней мере 3 мл дегазации отфильтрованного раствора KCl. Позаботьтесь, чтобы удалить переполнение помощью аспиратора.

3. Nanopore Характеристика

  1. Поместите нанопор ячейку в электрически экранированной экспериментальной установки и поместить Ag / AgCl электродов в каждом резервуаре. Эта установка аналогична показанной на рисунке 2, за исключением внешнего источника питания и усилитель тока, которые являютсязаменены с низким уровнем шума усилителя резистивный обратной связи.
  2. Использование малошумящий усилитель в режиме фиксации потенциала, применять потенциалы потрясающим от -200 мВ до +200 мВ и записывать ВАХ.
  3. Установите кривую IV, чтобы получить нанопор проводимость, которая может быть использована для вычисления его диаметр в растворе 17. Если вычисленный диаметр намного меньше, чем ожидалось от изображений ТЕМ, поры, скорее всего, не полностью смачивают и / или содержит твердые частицы или загрязнения.
  4. Нанесите мВ потенциал 200 через нанопоры и запишите ионный ток на 30 сек.
  5. Выполните спектральную плотность мощности анализа (PSD) ионного тока и интегрировать для количественной оценки электрических шумовых характеристик нанопор. Если шум выше 15 пА RMS в полосе пропускания 5 кГц, то пор, вероятно, не полностью смачивают и / или содержит загрязнения и не может быть надежно использован в эксперименте.

4. Кондиционер Нанопоры Использование высоких Electric ФуLDS

Примечание: Если кривая IV генерируется выставляемый асимметрию или меньше, чем ожидалось, проводимость, или текущий след показал нестабильности и высокой уровень шума при низких частотах, необходимо обусловить нанопор с сильных электрических полях, чтобы удалить любые загрязнения на поры поверхность и / или мокрой пору. Хотя этот метод не влияет на шум высокой частоты, вызванное мембранной емкости или любой паразитной емкости, соединенной с входом усилителя тока, используемого в измерениях, низкочастотный шум (также называемый 1 / F шум) 18 может быть значительно уменьшена. Схема установки, используемой для выполнения этой кондиционирование показано на рисунке 2.

  1. Отключите электроды от усилителя патч-зажим.
  2. Подключите один из электродов к компьютерным управлением питания, способного генерировать> 6 В (> 0,2 В / нм напряженность электрического поля для 30-нм мембран, используемых здесь), а другой к электронномуxternal усилитель тока, что можно контролировать в режиме реального времени.

    Примечание: применение высоких электрических полей могут быть использованы для кондиционирования нанопор в различных мембранных материалов и толщины. Хотя оба 30-нм и 10 нм мембраны описаны здесь, описаны напряжений относятся к тем, которые используются для 30-нм мембран если не указано иное.

  3. Применение разность потенциалов 400 мВ (измерение напряжения) через нанопоры, по крайней мере, 5 сек.
  4. Рассчитать среднее значение тока из окончательного 1 сек данных, чтобы определить проводимость нанопор. Рассчитайте диаметр нанопор на основе этого проводимости, которая должна быть сделана автоматически с помощью программного обеспечения и нанопор проводимости модель выбора на основе наиболее вероятного геометрии. Он должен соответствовать диаметру измеренного по кривой IV.
  5. Нанесите 200 мс импульс 6 V (смачивание напряжения) через нанопоры производить электрическое поле 0,2 В / нм следует период измерения 5 секпри 400 мВ. Опять же, вычислить диаметр нанопор с использованием конечного 1 сек данных и сравнить с ожидаемым на основе измерений ТЕМ чтобы гарантировать, что нанопор полностью мокрой. При необходимости повторите несколько раз.
  6. При необходимости повторите применение высоких импульсов электрического поля с увеличением напряжения до текущего сигнала в течение периода измерения является стабильным и отражает предполагаемую проводимость. Не рекомендуется превышать 10 В (т.е.> 0,3 В / нм), так как это может значительно увеличить или быстро повредить нанопор.

5. Увеличение нанопор Использование сильных электрических полях

Примечание: Диаметр нанопор имеет решающее значение в определении его функциональность для конкретного биомолекулярной применения зондирования. С этой целью нанопор создана при помощи ТЭМ может быть увеличена до желаемого размера с применением высоких электрических полей, пока соответствующий диаметр не будет достигнут с той же установке, используемой для очистки и влажныйнанопор (рис. 2).

  1. Используя ту же электронную конфигурацию, как в части 4, нанесите 200-500 мВ смещения через поры, чтобы получить измерение диаметр. В то время как менее точны, чем установка кривую IV, измерение одной точки могут быть использованы для примерно оценить размер нанопор быстро.
  2. Нанесите 2 сек импульс 8 V через нанопоры, за которым следует период измерения не менее 5 сек при 400 мВ. Расчет нового диаметра, как правило, показывают очень небольшое увеличение размера нанопор (<0,1 нм).
  3. Повторите этот процесс циклически, чередуя расширения и измерений напряжений для получения на месте и измерений в реальном времени от увеличения диаметра нанопор.
  4. Если быстрее темпы роста желательно, увеличить величину приложенного напряжения постепенно до 10 В. роста, как правило, ускорить как поры увеличивает со скоростью увеличения проводимости в диапазоне от 0,03 нс / с ес & #160; 10 нс / сек, в зависимости от размера нанопор, напряженности электрического поля и свойств раствора электролита.
  5. Когда желаемый диаметр достигается, остановить применение сильных электрических полях. Это может быть сделано автоматически с помощью компьютерной программы.
  6. Снова подключите патч-зажим усилителя на электроды.
  7. Приобретать новую IV и текущие данные трассировки при 200 мВ для подтверждения диаметр нанопор и проверить текущие сигналы с низким уровнем шума, как на этапах 3.2 - 3.5 выше. При необходимости повторите кондиционирования и расширение протокола (шаги 4,1 - 5,5).

6. ДНК Транслокация

  1. До добавления биомолекулярной образец, выполнить контрольный эксперимент, чтобы гарантировать, что нет никакого загрязнения в резервуаре. Получить текущий след при приложенном потенциале +150 до +300 мВ при отсутствии любого образца, чтобы проверить, что ни блокады тока не обнаружено после 2 мин.
  2. Добавить λ ДНК (48,5 кб двухцепочечной), чтобы <EM> цис резервуар для конечной концентрации 0,5-2 нг / мкл. Рефлюкс осторожно пипеткой в ​​течение не менее 10 секунд, чтобы обеспечить равномерное распределение по всей пробы в резервуар.
  3. Для толстого нанопор 30-нм, нанесите потенциальную предвзятость +150 до +300 мВ до транс водохранилища и измерить ионный ток, проходящий через нанопоры. Для очень коротких транслокации событий, желательно, чтобы попробовать на высокой частоте (250 кГц или выше) с относительно высокой нижних частот для фильтрации (100 кГц).
  4. Мониторинг ионный ток, используя программное обеспечение для обнаружения переходного тока блокады как молекулы перемещать через нанопоры. Ионного тока следы молекулярного транслокации могут быть проанализированы, чтобы определить глубину забивания, продолжительность и частоту необходимости определения информации о выборке, представляющей интерес. И наоборот, если информация о транслокации молекул известно, эти данные могут быть использованы для исследования свойств самого нанопор.

Representative Results

Нанопор, используемые в этом исследовании, были пробурены в 30 нм или 10 нм нитрида кремния толщиной мембранных окон. В то время как протокол, описанный могут быть применены к полупроводниковых нанопор различного материала, изготовленных с использованием любого способа, они, как правило, пробуренных с использованием предварительно установленных протоколов 11,14 помощью ПЭМ. Нанопоры пробуренные с помощью ПЭМ, как правило, в пределах 4-8 нм в диаметре (рис. 2). Хотя оба 30-нм и 10-нм мембраны могут быть установлены и кондиционером с вышеприведенной схемой, смещения напряжения, описанные см., необходимые для 30-нм мембран если не указано иное. Для мембран различного размера, приложенное напряжение должны быть скорректированы, чтобы генерировать электрическое поле в диапазоне 0,15-0,3 V / нм внутри нанопор.

На рисунке 3а показаны два типовых проводимости, следы 10-нм нанопор в толстой оболочкой 30-нм до и после лечения с сильных электрических полях. По монтажа недавно гбороздчатой ​​нанопор, вероятность получения нестабильную и шумной ионной сигнал тока, демонстрируя высокую степень низкочастотной колебания, как правило, высока. Нанопор показано на рисунке 3а подчеркивает это поведение. Его проводимость значительно меньше, чем ожидалось для нанопор его размера, скорее всего из-за неполного смачивания. По заявлению высоких электрических полях 0,27 В / нм величины производимого 8 V импульсов (90 импульсов 2 продолжительности сек), нанопор становится полностью мокрой и впоследствии увеличена до 21 нм в диаметре. В этот момент пор демонстрирует стабильную проводимость со свойствами низким уровнем шума. Количественный анализ шума в подобных нанопор показан как спектральная плотность мощности участков в рисунке 3b. Шум амплитуда низкочастотного из unwet и / или забитые поры очень высока (> 20 пА RMS), что делает их непригодными для использования в эксперименте. По кондиционирования с сильных электрических полях, мощности шума на низких частотах (<10 кГц) является diminisхед почти на 3 порядка и готов к малошумящих экспериментов.

На рисунке 4а показана типичная измерения тока как потенциал, приложенный пульсирует между сильных электрических полях для увеличения и низкие периоды измерения электрического поля. После каждого последующего импульса, в результате ионный ток через нанопоры в измерительного напряжения (т.е. нанопор проводимости) увеличивает на конечную величину. Это показывает, что нанопор увеличивается в размерах, а диаметр D может быть выведено из его проведении G в растворе проводимости σ, аппроксимации нанопор как имеющие цилиндрическую геометрию эффективной длиной л эфф. В то время как различные другие модели существуют для соотнесения нанопор проводимость его геометрии 17,19-21, следующее соотношение, который включает в себя геометрическую термин и термин сопротивления доступа, было доказано действительны для ТЭМ-пробуренных нанопор в высокой концентрации соликонцентрации, в широком диапазоне диаметров, представляющих интерес для двухцепочечной ДНК транслокации 17,22.

Как только желаемый диаметр достигнут, процесс автоматически останавливается с помощью программного обеспечения. Полученный диаметр нанопор может быть подтверждена с помощью точных измерений IV, как показано на фиг.4b.

Важно отметить, что нанопоры, обработанные с использованием высоких электрических полей полностью функциональны. Это подтверждено обнаружением λ транслокации ДНК, как показано в проводимости следов представленных на фиг.5а. На этой фигуре дцДНК приводится посредством двух нанопор, которые были увеличены до 11 нм и 32-нм с использованием описанного способа. В каждом случае, базовый проводимость чрезвычайно стабильна и ясные блокады наблюдаются как молекулы дц перемещать через нанопоры, показывая высокое отношение сигналУровнем шума одиночных молекул транслокация события, как по сравнению с необработанными пор, которые обладают высокой шума. Как показано на вставках фиг.5а, множественные дискретные уровни блокированию наблюдаются как отдельные свернутых молекул перемещать, как и ожидалось для нанопор этих размеров. Гистограммы нанопор проводимости во время транслокации событий через каждую пору показаны на рисунке 5б. Малошумящих свойства нанопор выявить четкие, легко разрешимые пики, соответствующие базовым (без ДНК), один (одна нить ДНК - развернутый) и двойные блокирования состояния (две цепочки ДНК - в сложенном виде). Следует отметить тот факт, что изменение проводимости, соответствующий одной молекулы двухцепочечной ДНК, занимающего пору отличается для больших и малых нанопор. Это косвенно свидетельствует о том, что применение высоких электрических полей на самом деле расширения существующих нанопор, как можно было бы наблюдать то же самое амплитуда блокирования Если создавались другие поры или трещины в тон мембраны в процессе 17.

Аналогично, фиг.6 иллюстрирует эффективность высоких электрических полей для увеличения нанопоры, изготовленные в мембранах различной толщины. Здесь нанопор создан в 10-нм SiNx мембраны изначально частично unwet, показывая нестабильную и относительно небольшую проводимость. По заявлению переменного ± 3 В (± 0,3 В / нм) импульсами 4 длительности сек (30 всего), нанопор намокает и проявляет идеальные характеристики IV для 3 нм поры. Методология была затем повторяется в течение 400 последующих импульсов и нанопор был увеличен до 8 нм. Это расширение, выполненное в сопоставимых электрических полей, но ниже, приложенное напряжение смещения, чем для нанопор, изготовленных в 30-нм мембран, показывает, что процесс в первую очередь электрическое поле приводом. Поскольку ток блокада получают путем транслокации через более тонкой мембраны больше, чем производится в толстых поры, нанопор в тонких мембранОбработанный таким образом может быть использован для изучения более короткие молекулы, такие как белки с повышенной чувствительностью.

Рисунок 1
Рисунок 1. Nanopore клеток сборки. Нитрида кремния мембрана, содержащая нанопор помещается между силиконовыми прокладками из эластомера, которые, в свою очередь, сжатого двумя тефлоновыми полуэлементов содержащих резервуаров электролита. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .

Рисунок 2
Рисунок 2. Кондиционирование Nanopore и расширение установки. Нанопор пробурена в 30 нм толщиной нитрида кремния мембраны (слева) соединяет два резервуара электролита.Компьютер используется для управления либо усилитель патч-зажим или внешнего блока питания (DAQ карты), которая применяется потенциальную предвзятость по нанопор через Ag / AgCl электродами, погруженными в водоемах электролитов. Усилитель тока передает ионный ток, измеренный для мониторинга в реальном времени с помощью компьютерных программ. Эта цифра была изменена с [11]. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .

Рисунок 3
Рисунок 3. Текущие следы до и после применения сильных электрических полях. (А) По монтажа, и даже после очистки с пираньи решения, проводимость нанопор неустойчива и меньше, чем ожидалось для цилиндрического 10-нм поры (синий). После применения 2 сек импульсов 8 V,нанопор полностью смачивают и увеличенный, демонстрируя стабильную проводимость и может быть использован для молекулярно-биологических экспериментов зондирования (зеленый). (Б) спектральная плотность мощности участки не полностью смоченной и забитой нанопор (синий и оранжевый, соответственно). При приложении 200 мс импульсов 8 V, нанопор были смочены и мусор удаляется (зеленый и красный соответственно). Эта цифра была изменена с [11]. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .

Рисунок 4
Рисунок 4. Nanopore увеличения с помощью высоких электрических полей. (А) Чередование расширения и измерения возможных погрешностей (красный) показывает, что ионный ток через нанопоры (синий) увеличивается в конечных этапов. В результате поведениеИзмерение Ance может использоваться для вывода диаметром нанопор. Как только желаемый диаметр был достигнут, процесс останавливается. (Б) измерения Точные IV из проводимости подтверждают, что размеры нанопор увеличились. Такие участки обеспечивают более точную оценку размера пор, чем текущие значения точечных так как они могут быть в форме и их симметрично и Омическая поведение может быть подтверждена. Эта цифра была изменена с [11]. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .

Рисунок 5
Рисунок 5. Транслокация ДНК через условные нанопор. (А) Добавление двухцепочечной ДНК (48,5 кб) с одной стороны нанопор при смещении 150 мВ производит переходные блокады в кондактанса следов 11-нм (синий) и 32-нм ПОРэс (красный). (Б) Гистограммы проводимости каждого из нанопор показать дискретные пики, соответствующие базовым, одноместные и двухместные события транслокационные. Эта цифра была изменена с [11]. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .

Рисунок 6
Рисунок 6. Расширение нанопор в 10 нм мембран. Нанопор в 10 нм мембраны первоначально экспонаты очень мало проводимости и асимметричные ВАХ (оранжевые). По заявлению 30 импульсов, чередующихся между ± 3 V (4 длительности сек), нанопор смачивает и демонстрирует идеальные свойства IV с проводимостью в соответствии с ожидаемой для 3 нм поры (синий). Еще 400 импульсов ± 3 V увеличивает нанопор диаметром до 8 нм(Зеленый). Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .

Discussion

Контроль размера нанопор имеет принципиальное значение в приложениях биомолекулярных зондирования. Диаметры нанопор должна быть порядка размеров молекул зондируемой; они должны быть достаточно большим, чтобы вместить образец, но достаточно малы, чтобы достичь оптимального шум сигнал-. В то время как контроль размера с использованием метода подарил применения высоких электрических полей является однонаправленным в том, что диаметров нанопор только увеличивается на протяжении всего процесса, нанопор диаметром от 3-100 нм может быть вылепленный, с точностью субнанометровой. Как 3-4 нм поры могут быть легко изготовлены с использованием ПЭМ 23, это позволяет для надежного изготовления полупроводниковых нанопор для широкого диапазона приложений от зондирующего структуру оцДНК взаимодействию громоздких белок-лиганд. В то время как рост нанопор выше 100 нм может быть очень быстрым и менее точным, более умеренные условия, увеличивающие могут быть использованы для достижения лучшего контроля над процессом. Как суч, самый важный шаг для достижения эффективного контроля размер является выбор силы и длительности импульса, чтобы сбалансировать увеличения эффективности и уровня точности, требуемой для достижения желаемого диаметра пор. Это еще более подчеркивается расширения тонких нанопор (толщина 10-нм), где увеличение наблюдается более низкий уклон, но сопоставимый напряженность электрического поля. В зависимости от окончательного размера, как правило, можно увеличить нанопоры диаметрам суб-100 нм в течение нескольких минут.

Точно так же, большие низкочастотные колебания тока исключает одной молекулы исследования, как это почти невозможно отличить транслокационные сигналы от фонового шума. Неполное смачивания 24, наличие углеродистых остатков, оставшихся после первоначальной изготовления 25 и адсорбции мусора на нанопор стенки 13 может ухудшить качество сигнала, что требует дополнительной очистки с резкими химических обработок, которые часто яnefficacious. Интересно, что он является общим для протоколы твердотельные нанопор, чтобы подчеркнуть важность очистки нанопор в пираньи растворе или с кислородной плазмы перед установкой, чтобы помочь смачивание или удалить любые загрязнения, оставшиеся от процессов бурения, обработки изображений и обработки. Даже с этим лечение, однако, нанопор часто не мокрой или продолжают демонстрировать высокую шум, и предложил решение для неудачных попыток, чтобы выполнить дополнительную очистку, которая может быть очень много времени 14. С применением высоких электрических полей, эти длинные протоколы не может быть необходимым в зависимости от применения. Было установлено, что большинство устройств может быть восстановленные на месте с использованием метода, описанного здесь, следовательно уменьшая время подготовки и необходимость иметь дело с агрессивных химикатов. Наиболее важные шаги в смягчении электрический шум является простое увеличение напряжения и / или длительности импульса, чтобы полностью смочить поры и удалить слабо связанных мусора.Нанопоры обработанные таким образом надежно могут быть использованы в экспериментах биомолекулы транслокации, таких, как прохождении ДНК и белков. Если эти молекулы придерживаться стенки поры, ведущие к забитой и шумной электрический сигнал, высокие импульсы электрического поля могут быть восстановлены, чтобы удалить препятствия и восстановить свойства с низким уровнем шума для дальнейших экспериментов, без размонтирования чипа нанопор от жидкостной ячейке.

Применение сильных электрических полях на установке, описанной ограничивается требованием внешнего источника питания, которые могут применять до 10 V и усилителя тока, в которых отсутствуют чувствительность и свойства с низким уровнем шума при высокой пропускной способностью (> 1 кГц) для зондирования одной молекулы. В то время как типичные биомолекулярные эксперименты полагаться на текущей малошумящий усилитель, которая ограничена ± 1 В, это несложно спроектировать единую систему, которая может выполнить как высокую кондиционирование электрического поля и чувствительной измерения тока с ADJUстабильный прирост. Несмотря на это ограничение, переход от одной установки на другую быстро и просто. По сравнению с существующими методами для управления размером нанопор такие как использование SEM 5, термического окисления и мембраны переформирования 8, высокие электрические поля предлагаем быстрое и более точное и менее дорогой методологию, которая может быть выполнена и в лаборатории с использованием стандартного оборудования и обеспечить более широкий диапазон размеров нанопор. Способность быстро и воспроизводимо снизить низкочастотный шум и делает первоначальный изготовление более надежным и продлевает срок службы полупроводниковых нанопор, как ранее используемые поры может быть обновленным для дальнейших экспериментов. В общей сложности, более 95% нанопор различной толщины условных с сильных электрических полях демонстрировала очень слабую низкочастотного шума характеристику, что делает их подходящими для биомолекул зондирования. Изготовление, таким образом, проще и надежнее, делая эксперименты твердотельные нанопор более ДоступнаяBLE для исследователей и потенциально позволяя для пути к коммерциализации нанопор технологий посредством более надежных процессов изготовления.

Disclosures

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Acknowledgments

Мы признаем поддержку по естественным наукам и инженерным исследовательского совета Канады, Канадского фонда инноваций, и Научно-исследовательского фонда Онтарио. Мы благодарим Y. Liu для помощи в изготовлении нанопор и характеристики, Л. Анджеевский за полезные обсуждения и технической поддержки, и А. Marziali за помощь в нанопор программного обеспечения и дизайна приборов.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
JEM-2100F TEM JEOL Drilling requires 200 kV accelerating voltage
Axon Axopatch 200B patch-clamp amplifier Molecular Devices Low-noise voltage and current amplifier
X-Series data acquisition card National Instruments PCI-6351 Interfacing with setup, apply of high electric fields
LabVIEW 2012 software National Instruments Apply voltages, record current, data analysis
Current amplifier Keithley Current amplification during high electric field pulses
30-nm thick silicon nitride TEM membrane windows Norcada Inc. NT005X Substrate in which nanopores are created
10-nm thick silicon nitride TEM membrane windows Norcada Inc. NT005Z Substrate in which nanopores are created
Silicone elastomer O-rings Marian Chicago HT6135 Punched for sealing the nanopore chip
Ag/AgCl electrodes In Vivo Metric E255
Nitric acid Fisher Scientific 52004P Used for cleaning cells - handle with caution
Hydrogen peroxide Fisher Scientific H323 Used for piranha solution - handle with caution
Sulfuric acid Fisher Scientific A300 Used for piranha solution - handle with caution
Potassium chloride Fisher Scientific P335
HEPES Fisher Scientific BP310 Buffering KCl solution
Primary Faraday cage Shielding nanopore cell, electrodes
Secondary Faraday cage Shielding headstage, electrode wires
Teflon cell To hold nanopore chip and reservoirs
Hot plate VWR Heating piranha solution

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Venkatesan, B. M., Bashir, R. Nanopore sensors for nucleic acid analysis. Nat. Nanotechnol. 6, (10), 615-624 (2011).
  2. Smeets, R. M. M., Keyser, U. F., Dekker, N. H., Dekker, C. Noise in Solid-State Nanopores. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, (2), 417-421 (2008).
  3. Tabard-Cossa, V., Trivedi, D., Wiggin, M., Jetha, N. N., Marziali, A. Noise analysis and reduction in solid-state nanopores. Nanotechnology. 18, 4484-4418 (2007).
  4. Wu, M. -Y., et al. Control of Shape and Material Composition of Solid-State Nanopores. Nano Lett. 9, (1), 479-484 (2009).
  5. Prabhu, A. S., Freedman, K. J., Robertson, J. W. F., Nikolov, Z., Kasianowicz, J. J., Kim, M. J. SEM-induced shrinking of solid-state nanopores for single molecule detection. Nanotechnology. 22, 425302 (2011).
  6. Li, J., Stein, D., McMullan, C., Branton, D., Aziz, M. J., Golovchenko, J. A. Ion-beam sculpting at nanometre length scales. Nature. 412, (6843), 166-169 (2001).
  7. Rosenstein, J. K., Wanunu, M., Merchant, C. A., Drndic, M., Shepard, K. L. Integrated nanopore sensing platform with sub-microsecond temporal resolution. Nat. Methods. 9, (5), 487-492 (2012).
  8. Vanden Hout, M., Hall, A. R., Wu, M. Y., Zandbergen, H. W., Dekker, C., Dekker, N. H. Controlling nanopore size, shape and stability. Nanotechnology. 21, 115304 (2010).
  9. Li, Q., et al. Size evolution and surface characterization of solid-state nanopores in different aqueous solutions. Nanoscale. 4, (5), 1572-1576 (2012).
  10. Smeets, R., Dekker, N., Dekker, C. Low-frequency noise in solid-state nanopores. Nanotechnology. 20, 095501 (2009).
  11. Beamish, E., Kwok, H., Tabard-Cossa, V., Godin, M. Precise control of the size and noise of solid-state nanopores using high electric fields. Nanotechnology. 23, (40), 405301 (2012).
  12. Smeets, R. M. M., Keyser, U. F., Wu, M. Y., Dekker, N. H., Dekker, C. Nanobubbles in Solid-State Nanopores. Phys. Rev. Lett. 97, (8), 088101 (2006).
  13. Niedzwiecki, D. J., Grazul, J., Movileanu, L. Single-Molecule Observation of Protein Adsorption onto an Inorganic Surface. J. Am. Chem. Soc. 132, (31), 10816-10822 (2010).
  14. Niedzwiecki, D. J., Movileanu, L. Monitoring Protein Adsorption with Solid-state Nanopores. J. Vis. Exp. (58), e3560 (2011).
  15. Wanunu, M., Meller, A. Single-molecule analysis of nucleic acids and DNA-protein interactions. Single-molecule techniques: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. 395-420 (2008).
  16. Tabard-Cossa, V. Instrumentation for Low-Noise High-Bandwidth Nanopore Recording. Engineered Nanopores for Bioanalytical Applications. 59-93 (2013).
  17. Kowalczyk, S. W., Grosberg, A. Y., Rabin, Y., Dekker, C. Modeling the conductance and DNA blockade of solid-state nanopores. Nanotechnology. 22, (31), 315101 (2011).
  18. Siwy, Z., Fuliński, A. Origin of 1/fα Noise in Membrane Channel Currents. Phys. Rev. Lett. 89, (15), 158101 (2002).
  19. Liebes, Y., et al. Reconstructing solid state nanopore shape from electrical measurements. Appl. Phys. Lett. 97, (22), 223105 (2010).
  20. Kim, M. J., Wanunu, M., Bell, D. C., Meller, A. Rapid Fabrication of Uniformly Sized Nanopores and Nanopore Arrays for Parallel DNA Analysis. Adv. Mater. 18, (23), 3149-3153 (2006).
  21. Smeets, R. M. M., Keyser, U. F., Krapf, D., Wu, M. -Y., Dekker, N. H., Salt Dekker, C. Dependence of Ion Transport and DNA Translocation through Solid-State Nanopores. Nano Lett. 6, (1), 89-95 (2006).
  22. Wanunu, M., Dadosh, T., Ray, V., Jin, J., McReynolds, L., Drndić, M. Rapid electronic detection of probe-specific microRNAs using thin nanopore sensors. Nat. Nanotechnol. 5, (11), 807-814 (2010).
  23. Dekker, C. Solid-state nanopores. Nat. Nanotechnol. 2, (4), 209-215 (2007).
  24. Powell, M. R., Cleary, L., Davenport, M., Shea, K. J., Siwy, Z. S. Electric-field-induced wetting and dewetting in single hydrophobic nanopores. Nat. Nanotechnol. 6, (12), 798-802 (2011).
  25. Egerton, R. F., Li, P., Malac, M. Radiation damage in the TEM and SEM. Micron. 35, (6), 399-409 (2004).
Точная настройка размера и Минимизация шума полупроводниковых нанопор
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Beamish, E., Kwok, H., Tabard-Cossa, V., Godin, M. Fine-tuning the Size and Minimizing the Noise of Solid-state Nanopores. J. Vis. Exp. (80), e51081, doi:10.3791/51081 (2013).More

Beamish, E., Kwok, H., Tabard-Cossa, V., Godin, M. Fine-tuning the Size and Minimizing the Noise of Solid-state Nanopores. J. Vis. Exp. (80), e51081, doi:10.3791/51081 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter