心肌梗死和功能预后评估的猪

Summary

本协议描述了猪心肌梗死（MI）模型中使用的左前降支（LAD）的90分钟闭胸冠状动脉球囊闭塞，再灌注。此外，该协议对于几个结果的参数，如心脏功能，血液动力学，微血管性和梗塞的大小，也被提出。

Abstract

介绍新发现的心血管治疗学为先在人的试验依赖于严格规范的道德和法律的路线图。其中一个重要的前提是在一个大的动物模型，有效地反映心肌梗死（MI）的人类场景获得的所有安全性和有效性方面有很好的理解。猪被广泛使用在这方面，因为它们的心脏大小，血流动力学和冠状动脉解剖接近人类的。在这里，我们提出了一个有效的协议使用左前闭胸冠状动脉球囊闭塞降支（LAD），再灌注采用猪心肌梗死模型。这种方法是基于90分钟的心肌缺血，诱发前，室间隔及inferoseptal墙壁的大左心室梗死。此外，我们提出的协议的结果，提供了广泛的对心脏的信息的各种措施，如心脏收缩和舒张功能，hemodynamiCS，冠脉血流速度，微血管抵抗力和梗死面积。这个协议可以很容易地定制，以满足研究的新型cardioregenerative生物在不同阶段的验证（ 即后直接在急性缺血性损伤，在亚急性设置，甚至在慢性心肌梗死后瘢痕形成已经完成）的具体要求。因此，该模型提供了一个有用的翻译工具来研究心肌梗死，随后的不良重塑，以及新颖的cardioregenerative剂的潜力。

Introduction

急性心肌梗死（AMI）和它的长期后遗症如慢性心脏衰竭（CHF）深刻地影响患者的预后和生活质量，更遑论强加给我们的现有医疗资源¹成本高的限制。瑞士法郎在西方世界的患病率估计为1-2％，其中〜案件的60％是急性心肌梗死的后果是主要原因^2。仅在美国，约5.7万患者从瑞士法郎遭受占比约为3000十亿在每年的医疗费用在2008年，在成本每年在2030年上升至97美元十亿预测一式三份^1。综合起来，这些数字使了一个有力的论据发展，对于迅速转换，依赖于可重复和可靠的大型动物心肌梗塞模型，准确地模仿人类的​​场景新的cardioregenerative治疗。

猪（ 野猪 ）正越来越多地在cardiovascu使用LAR研究药理和毒理试验^3。一个负责这一成功的转化型研究工具的特征之一是其心脏功能和解剖结构与人类心脏^4,5相似。例如，猪心脏对体重的比例，心脏大小和冠状动脉解剖分布都证明是非常相似的男人^4。此外，心肌细胞代谢，电生理特性和响应于缺血性损伤如急性心肌梗死的报道，显示高水平的与人的情况^6,7协议。最终，以满足上述标准，规范的MI协议产生强大而持久的心肌梗死的研究性新药（IND）的测试是必要的。在这里，我们提出这样一个使用的左前降支（LAD），再灌注90分钟闭胸冠状动脉球囊阻断一个标准化的模式，从而创建可重复的心肌中梗死覆盖anteroapical，室间隔和左心室inferoseptal墙壁。

Protocol

所有的体内实验均按照指南编写实验动物资源研究所实验动物的护理和使用进行。实验经当地动物实验委员会。

1，药物治疗，麻醉，静脉通路，并插管

1. 药物和麻醉
   1. 术前用药
      1. 启动胺碘酮150毫克/千克，手术前10天，防止心律失常。从手术当天继续胺碘酮在100毫克/公斤的剂量，直到第28天。降低剂量至50毫克/公斤的29天，并继续下去，直到研究结束。
      2. 开始抗血小板治疗，1毫克/千克氯吡格雷从第3天在手术前和4.5毫克/千克乙酰水杨酸术前1天。继续氯吡格雷1毫克/每天每公斤体重和乙酰水杨酸80毫克/天。
      3. 开始疼痛用药1天之前由手术芬太尼贴剂，25微克/小时〜70公斤猪。继续使用芬太尼贴剂的24小时手术后，以确保有足够的止痛药。此外，每日监测对推定的不适症状（ 即行为，呼吸，步态，流动性等 ），以增加止痛药。
      4. 快的动物12小时，保持无限饮水。
   2. 麻醉
      1. 为了防止不必要的压力和不适，通过注射咪达唑仑0.4毫克/千克，氯胺酮10毫克/千克，而阿托品0.014毫克/千克的混合物肌内注射镇静剂的猪在其稳定。
      2. 由cannulating耳静脉与18G的静脉插管取得静脉通路。诱导麻醉以5毫克/公斤sodiumthiopental静脉内给药，并且得到1000/100毫克的阿莫西林/克拉维酸，以防止感染。手术作为抗生素治疗后，猪会收到1,000 / 100毫克阿莫西林/克拉维酸的一天。
      3. 通过使用endotrach插管猪EAL管（大小为8.5猪体重〜70千克）。如果需要进行球囊通气12/min的频率和运输猪的手术室。
      4. 在到来的手术室，立即开始机械正压通气_吸入氧浓度0.50，将10毫升/公斤潮气量，并12/min下的频率继续二氧化碳图。
      5. 通过继续咪达唑仑0.5毫克/公斤/小时，舒芬太尼2.5微克/公斤/小时，泮库溴铵0.1毫克/千克/小时的组合静脉滴注开始平衡麻醉。在整个操作中，连续监测ECG，动脉血压，温度，二氧化碳浓度监测仪来测量麻醉深度。例如，如果一个窦性心动过速存在，检查是否止痛药和/或麻醉是足够的。
      6. 注入4.3毫克/千克胺碘酮在500毫升venofundin静脉注射6％。
      7. 由5监测心脏节律导联心电图。
      8. 剃须和清洁颈部和后LIMB区。
      9. 插入尿管。

2，经胸超声心动图

1. 将动物右侧卧位。长白猪，如Dalland猪，只有胸骨旁意见（长，短轴）可以得到。由于胸部的形状，顶视图采集是不可行的。
2. 东方并获得二维（B型）胸骨旁长轴切面。确定了LV的尺寸舒张末期和收缩末期在M模式。
3. 旋转echo探测顺时针旋转90°，同时保持它的胸骨位置采集了LV短轴浏览在二尖瓣，乳头肌及心尖水平。乳头肌和心尖部短轴视图可能需要的回波探头放置一个或两个肋间隙相对较低，为二尖瓣短轴视图的位置。

3，手术准备及血管通路

1. Disin通电，以外科手术的区域用碘酒2％，并使用无菌手术布覆盖猪的非无菌部分。
2. 使内侧切口在颈部。通过白线，以减少肌肉损伤，并直言不讳地接近颈动脉和旁边的气管颈内静脉。
3. 仔细分离颈总动脉和颈内静脉。确保迷走神经是完好的。广场周围两艘船薇乔缝线2-0赢得容器控制。通过使用Seldinger技术cannulating颈内动脉与8F鞘实现动脉进入。固定护套的动脉，确保动脉不完全缝合闭塞。静脉通路可以通过cannulating颈静脉带9F护套也采用Seldinger技术被收购。前固定护套确保静脉结扎。或者，股动脉，也可用于动脉进入。
4. 插入s​​heat后立即辖100 IE /公斤肝素HS抑制血栓的形成。
5. 对于一个稳定和不断动脉测压，导管插入的后肢之一，通过一个小的切口动脉上方的小动脉之一。动脉被刚下的皮肤上发现，脉动可以通过皮肤表现出来。从它的周围组织分离出动脉。将容器约2薇乔2-0缝线，1近端和远端1。结扎远侧端和插入18G的静脉插管和安全紧密连接的压力。

4，有创压力容量环分析

1. 通过在颈内静脉先前放在鞘插入斯旺-Ganz导管（SG）。
2. 心脏输出设备连接到高潮在近端管腔SG的一部分。
3. 注入5毫升0.9％盐水进入SG的近侧管腔和测量心输出量;重复此三次，平均指数。
4. 通过使用先前校准PV系统测定心输出量。
5. 经颈内动脉入透视引导下左心室插入7F电导导管。
6. 选择最大的细分市场目前在LV的体积测量，并执行下呼吸基线扫描。
7. 后体积校准完成后，记录10-15下呼吸暂停甘拜下风。
8. 除去SG和放置球囊导管在下腔静脉在隔膜的水平透视指导下进行。
9. 通过在呼吸暂停充气气球进行预压降低，并记录相应的PV-循环。

5，冠状动脉内压力和流量测量

1. 稀硝酸甘油在100微克/毫升的浓度和稀释腺苷中的30微克/毫升的浓度。
2. 在左冠状动脉的开口处放置一个8F导引导管。
3. 将合并的压力/流量导线在左冠状动脉阿特的近侧部分年。
4. 管理200微克硝酸甘油冠状动脉内的和归一化的远端压力（Pd）等的金属丝计量，其动脉压。
5. 将线在中左前降支（LAD）的一部分。
6. 开始测量基线的压力和流量。通过施用60微克腺苷冠状动脉内的，与2ml生理盐水冲洗诱发充血和充血测量的压力和流量。等待流量恢复到基线值。重复测量两次。
7. 注入另一个200微克冠脉内硝酸甘油，并重复步骤1.6和1.7的左冠状动脉回旋支。

6，诱导心肌梗死

1. 将心腔内除颤导管中使用的静脉鞘右心室。远侧电极应该在脑室的先端，在心房和/或优越腔静脉近端电极。导管连接到除颤器并将其设置为50J.
2. 来自美联社的第二对角（D2）和劳30°视角测量LAD远端的直径。
3. 选择一个血管成形术用球囊。根据从D2在LAD远端（ 图1）的直径的直径。
4. 通过导引导管远端在LAD定位导丝。
5. 推进球囊导管导丝。从D2将气囊前端。
6. 辖30个IE浏览器/公斤肝素。
7. 充气气球，直到压力法援署的右侧直径相匹配。
8. 检查LAD完全闭塞的血管造影（ 图1）。
9. 覆盖无菌工作领域，伤口在颈部，用无菌窗帘布。释放胸部从任何保障，使其可用于胸外按压或经胸除颤。
10. 检查气球的压力在未来90分钟内，如果需要恢复的压力。
11. 若心室颤动：
    1. 立即开始胸外按压与100/min的频率。
    2. 静脉内给药300mg的胺碘酮作为一种快速推注（〜1分钟）。
    3. 启动心腔内除颤，给予50 J.震荡
    4. 经过5不成功的冲击，重新启动胸外按压。改变心腔内除颤经胸除颤和冲击150 J。万一不成功休克，变更为200 J。
    5. 如果需要的话，管理150毫克胺碘酮和/或1毫克肾上腺素另一剂量。用3-5分钟，必要时重播肾上腺素的两倍。
    6. 持续胸外按压，穿插经胸除颤

完成外科手术（对于长期随访）

1. 90分钟后检查血管造影，如果法援署仍完全闭塞。
2. 辖30另一个IE /公斤肝素和放气的气球。检查再灌注损伤。除去瘪气球的GUID从颈动脉鞘ING导管。
3. 小心地取出动脉鞘并用吻合钳（ 图1）立刻夹住颈动脉。继续使用针（6-0普理灵）关闭颈动脉。取出钳，检查是否有渗漏。
4. 除去内部除颤导管，并从颈内静脉取出护套。鞘进入结扎近端。
5. 关闭该颈部的皮下组织和皮肤中使用2-0薇乔两层。

7，心脏磁共振成像

1. 首先将动物的MRI检查表头下连续麻醉仰卧位。
2. 放置一个专用的相控阵心脏线圈在动物的胸部。
3. 对于形象策划取得球探图像短轴和两腔长轴意见。
4. 获得心电门控稳态自由进动短轴（自由进动）电影（从顶点到的LV基地）和两个室使用ř长轴意见。
5. 晚期钆增强（LGE）可以使用反转恢复三维涡轮梯度回波技术，双倍剂量静脉推注一个基于钆对比剂后15分钟被收购。
6. 随着功能参数验证的软件进行离线分析。评估左心室射血分数（LVEF），左室质量，舒张末期容积，收缩末期容积，每搏量，心输出量，疤痕质量。

研究和梗死面积8。结束

1. 在研究结束时，遵循协议1-5和7获得后续计量。
2. 使中位30-40厘米的切口从正下方的胸骨上切迹到刚好低于剑突的一个点。提前通过白线向下胸骨。分裂剑突，并使用剪刀科林贝尔向胸骨后从谨慎心包分离。用剪刀直言后继续进一步分离。执行胸骨bŸ 如用锤子和Lebsch刀。骨髓出血是由摩擦骨蜡对骨髓最小化。与胸骨牵开器打开胸腔。
3. 进入第三胸膜腔和定位于纵隔的下腔静脉。
4. 人道切割深麻醉下的下腔静脉安乐死的动物。除去血液与抽吸装置。放置一个9伏电池上的顶点诱发心室颤动。
5. 的心脏切除后，切开右和左心室成从基片5到顶点和培养在1％三苯基四唑鎓氯化物溶解在0.9％盐水在37℃下持续15分钟。接着，洗净切片在0.9％盐水和从两侧拍摄切片。

Representative Results

死亡率和梗死面积

在我们的中心，出32头猪（女Dalland长白，6个月，〜70千克）经受这种MI协议，五（15.6％）认为缺血时死于顽固性室颤。该协议将创建一个覆盖梗死左心室约10-15％，位于前间壁，室间隔及inferoseptal墙（ 图2A）。如果梗死面积的串行无创性评估是必要的，对CMR晚钆增强（LGE）可以用来跟随无生存能力梗死面积随着时间的推移（ 图2B）。

心功能及重塑

四周后心肌梗死，全球性和区域性的参数，反映心功能应该比较健康的基线值下降。具体来说，左室射血分数（LVEF），应减少至约〜35-45％四，周后，心肌梗死。除了整体收缩功能，几个参数反映MI后的不良重塑也可以测量，如LV形态和使用CMR和超声心动图（ 图3A和3B）的直径。 MI，作为不良重构的标志增加舒张末期容积（EDV）可以预期四周后（ 图3A和3B）。

冠脉流量和压力等参数

血管生成和形成新的毛细血管通常被认为是缺血性心脏疾病⁸重要的治疗目标。微血管性的评定，可以间接地根据冠脉内压力和流速的综合测量。在正常条件下和最大充血代表压力和流速测量值，如图4所示。后4周MI相比，充血微血管阻力应增加在梗死相关冠状动脉（LAD）对于基线情况^8。

图1心肌梗死模型的基础上LAD球囊闭塞（A）和标准手术设备：1）毛巾夹子; 2）蚊子; 3）解剖钳; 4）圆形容器; 5）持针器（精细与粗糙）; 6）科林贝尔剪刀; 7）解剖剪刀（直线和曲线）; 9）钳（德BAKEY，精细与粗糙）; 10）软管夹; 11）吻合钳; 12）纱布; 13）电铅笔; 14）手术刀持有人; 15）Dreesman（吸）; 16）牵引器; 17）灯座。 （B）左LAD和LCX的前路斜透视视图。 （三）可视化第二对角支后，定位球只是远端对D2的两个不透射线的标记（见插图，黑色箭头）。 Inflate和确保冠脉血流量被成功阻断注射对比剂（见星号）。心内除颤器导线可以在右心室可以看出（见白色箭头）。法援署表示左前降支; LCX表示左回旋支;劳表示左前斜位;美联社表示前后视图; D1表示第一对角支; D2表示第二对角支。 点击这里查看大图。

心梗后图2。心肌梗死面积（A）童子的90分钟球囊闭塞导致广泛的心肌损伤和瘢痕形成（白色），1个月时通过可视化TTC染色跟进。（B）示意图梗死分布显示，梗死位于前壁，心脏前间壁和inferoseptal段。 （C，D）和短长轴晚期钆增强CMR图像显示的广泛梗死瘢痕（白信号时，看到黑箭头）定位于前，心脏前间壁和inferoseptal段。 LGE-CMR表示后期钆增强心脏磁共振。比例尺表示3厘米。 点击这里查看大图。

图3：在评价缺血性心肌梗死模型心功能（A）代表CMR电影圈图像舒张末期和收缩末期展示inf文件的功能障碍ARCT疤痕段。 （B）M-2D模式胸骨旁长轴超声心动图的图像，显示左心室扩张（增加LVIDd比值）1个月后，心肌梗死，以及功能障碍（缺乏室间隔增厚）。 EDV表示舒张末容积; ESV表示收缩末期容积; LVIDd比值表示左室内径在舒张和LVIDs表示左室内径在收缩。 点击这里查看大图。

图4。冠脉内压力和流速导出参数。冠脉内压力和流速录音使用Combowire呈现高RESPONS之前MI（A）参考值e来充血（黑箭头）。 （B）1个月后心肌梗死，梗死相关动脉（LAD）在冠状动脉血流速度（黑色箭头）降低充血反应。其结果是，压力和流速派生的参数（HMR）或血流储备（CFR）进行比较，以基线降低。 BAPV是指基平均峰值速度; pAPV表示峰值平均峰值速度; CFR是指冠状动脉血流储备; HMR表示微血管充血阻力。 点击这里查看大图。

多个可能的研究设计不同的研究设计如图5所示。概述（一 ）示意图，以验证研究性新药（独立非执行董事）在心肌梗死的使用这个LAD心肌梗死动物模型的各个阶段。依赖于心肌梗死的选择阶段是在调查，分析的功能只可以在处理之前分配，以危险区的基线值和评估来进行。 点击这里查看大图。

Discussion

在LAD冠状动脉内球囊阻断提供了一种可再现的和一致的临床前梗死模型中的猪，可用于研究的安全性和新的心血管疗法的疗效，密切模仿人的情况。 如图5所示 ，提出了缺血/再灌注梗死模型提供了可以进一步针对调查MI和MI后重塑的不同阶段，同时在初始缺血/再灌注损伤是相同的两个平台。

这里列出的描述协议的成功是依赖于心肌缺血作为协议的最关键阶段。气球远端法援署的第二对角支的正确位置是达到足够的梗死面积，同时确保高成活率的关键。在此基础上心肌梗死模型中，约15％的死亡率，观察，而大量的中和前，中隔和阴尸的心尖段或墙壁被梗塞所看到的CMR和TTC染色（ 图2A和2B）。缺血的持续时间可以根据所期望的梗塞大小进行调整。虽然我们在这个协议中使用长白猪，小型猪（ 即哥廷根小型猪）通常需要心肌缺血（ 例如 150分钟闭塞）的持续时间较长。

在临床前和临床研究心肌梗死预后分析往往是基于对左室射血分数。虽然较低的左室射血分数已经牢牢地与增加心血管死亡风险相关，但它仍然依赖于血流动力学参数，如预紧^9。可以说，因为平均只有10-15％的LV是梗死，一些理论和实践的局限性都与左室射血分数即左室收缩功能的全球性措施，而不是反映局部改进^10。因此，在这个模型中使用结果的建议措施，阐明不同的火花 MI和心梗后重塑从而提供调查人员准确地评估新的治疗方法多层次的疗效的手段。

从临床前模型优化翻译到临床实践中，我们选择使用大猪，而不是小型猪。血流动力学测量，用药剂量和手术设备可以很容易地与临床实践中进行交换。相比于小型猪，大猪获得相对多的重量。这可能会导致长期的问题跟进，关于串口结果的可比性。女Dalland长白猪体重约70Kg在6个月的年龄。为了防止在随访期间丰富的体重增加，动物被保存在一个限制饮食。猪收到750克的定制低热量的食物（含：蛋白质15.6％，脂肪2.0％，纤维14.8％，灰分8.8％，钙0.9％，磷0.57％，镁0.29％，钾0.18％），每天两次，并获得约10千克的重量在4周内。

e_content“>麦考尔和他的同事先前已经发表了类似的协议，用于心肌梗死猪^11。该协议与他们之间存在着相当大的重叠，强调优先法援署，而不是左回旋支（LCX）或右冠状动脉（RCA ），在我们的经验，存在使用LCX总左心室梗塞大小的程度较轻，而RCA梗死伴随的不需要的传导障碍的机会较高（ 即窦房结功能障碍，AV-节点功能障碍）。之间的一个区别这两个协议涉及使用在本协议中增加了药物的血小板抑制，正如我们所观察到的无复流的基础上血栓形成为90分钟止血闭塞冠状动脉的结果率较高，这是观察与行猪¹²已知血液高凝状态观察，虽然麦考使用一个单一的，高剂量，推注肝素，提出氏加入议定书依赖于多个低剂量传遍整个手术，以减少血栓并发症肝素的使用。

综上所述，我们提出了一个猪心肌梗死模型，使研究人员能够使人类疾病的一个有效的，可重复的和高于一切实用的大动物模型研究新疗法作为迈向第一在人临床试验的重要一步使用。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% Saline	Braun
6-0 Prolene	Ethicon
Acetylsalicylic acid	Ratiopharm		80 mg
Adenosine	Apotheek UMCU		3 mg/ml
AdVantage PV loop system	Transonic Science
Amiodarone	Cordarone I.V. (Sanofi)
Amiodaron HCl (PCH)
Amoxicilline/clavulaanzuur	Sandoz		500/50 mg
Atropinesulfate	PCH		0.5 mg/ml
Bone Marrow Wax	Syneture
Cardiac Defibrillator	Philips
Clopidogrel	Apothecon B.V.		Clopidrogel 75A
Contrast agent	Telebrix
Endotracheal tube	Covidien
Fentanyl patch	Durogesic (Janssen-Cilag)		25 μg/hr
Fogarty catheter	Edwards Life Sciences
Gadolinium	Gadovist
Guidewire	Abbott
Heparin	Leo
I.V. cannula	Abbocath (Hospira Venisystems)
Iodine	Jodiumtictuur 2% (Eurovet)
Ketamine	Narketan 10 Vétoquinol
Midazolam	Actavis		5 mg/ml
Nitroglycerin	Pohl Boskamp		1 mg/ml
Pancuronium bromide			2 mg/ml
Seldinger vascular sheath 8F	Arrow
Sufentanil	Sufentanil-Hameln		50 μg/ml
Swann-Ganz catheter	Criticath ref 680078 (Argon)
Synolux	Pfizer		250 mg
Tetra-polar catheter	Transonic Science
Thiopental	Inresa		0.5 g
Triphenyl-tetrazolium chloride	Merck
Venofundin	Braun
Vicryl 2-0	Ethicon
Volcano ComboMap system	Volcano