Eksperimentel autoimmun encephalomyelitis (EAE) er en etableret dyremodel for multipel sklerose. C57BL / 6 mus immuniseres med myelin oligodendrocyt glycoprotein (MOG)-peptid 35-55 (MOG 35-55), hvilket resulterer i en stigende paralyse forårsaget af autoreaktive immunceller i det centrale nervesystem. Protokoller for sygdom induktion og overvågning vil blive diskuteret.
Multipel sklerose er en kronisk Neuroinflammatoriske demyeliniserende sygdom i centralnervesystemet med en stærk neurodegenerativ komponent. Mens den nøjagtige ætiologi af sygdommen er endnu uklar, er autoreaktive T-lymfocytter menes at spille en central rolle i patofysiologien. MS terapi er kun delvist effektive hidtil og forskningsindsats fortsætte med at udvide vores viden om sygdommens patofysiologi og at udvikle nye behandlingsstrategier. Eksperimentel autoimmun encephalomyelitis (EAE) er den mest almindelige dyremodel for MS deler mange kliniske og patofysiologiske funktioner. Der er en bred mangfoldighed af EAE modeller, der afspejler forskellige kliniske, immunologiske og histologiske aspekter af menneskelige MS. Aktivt induceret EAE i mus er den nemmeste inducerbare model med robuste og reproducerbare resultater. Den er specielt velegnet til at undersøge virkningerne af narkotika eller bestemte gener ved hjælp af transgene mus udfordret af autoimmun neuroinflammation. Derfor immuniseres mus med CNS homogenater eller peptider af myelin proteiner. Grundet den lave immunogene potentiale af disse peptider, er stærke adjuvanser anvendes. EAE modtagelighed og fænotype afhænger af den valgte antigen og gnaver stamme. C57BL / 6 mus er det almindeligt anvendte belastning for transgene mus konstruktion og svare blandt andre til myelin oligodendrocyt glycoprotein (MOG). Det immunogene epitop MOG 35-55 suspenderes i komplet Freunds adjuvans (CFA) forud for immunisering og pertussistoksin anvendes på dagen for immunisering og to dage senere. Mus udvikle en "klassisk" selvbegrænsende monofasisk EAE med stigende lammelse indenfor 9-14 dage efter immunisering. Mus bedømmes dagligt ved hjælp af en klinisk Pointsystemet for 25-50 dage. Særlige overvejelser til pleje udtagning af dyr med EAE samt potentielle anvendelser og begrænsninger i denne model diskuteres.
Multipel sklerose (MS) er en kronisk demyeliniserende inflammatorisk sygdom i centralnervesystemet, hvor ødelæggelsen af oligodendrocytter og neuroner resulterer i heterogene og akkumulere kliniske symptomer. MS betragtes som en prototypisk autoimmun sygdom i centralnervesystemet (CNS) og dyremodeller er blevet udviklet til at kaste lys på dens komplekse patogenese. Endvidere nuværende behandlinger er kun delvis effektive og målrette hovedsagelig inflammatorisk fase af sygdommen, mens den neurodegenerative komponent er sandsynligvis den store udfordring for fremtidig terapeutisk nærmer 1,2.
Mens den nøjagtige ætiologi af sygdommen er endnu uklar, er en autoimmun reaktion mod epitoper på myelinskeden af axoner i centralnervesystemet antages at provokere sygdommens opståen. Dysregulering af immunsystemet, genetiske sårbarhed og miljømæssige faktorer (f.eks infektioner, vitamin D) menes atpåvirke centrale aspekter af patofysiologiske mekanismer i MS.
Tre forskellige typer af dyremodeller er i øjeblikket etableret for udforskning af patologiske mønstre af MS: Virale modeller som Theilers murine encephalomyelitis virus (TMEV), modeller, induceret af giftige stoffer som cuprizone, og endelig forskellige varianter af eksperimentel autoimmun encephalomyelitis (EAE) 3, 4.. Selv om de alle efterligne funktioner i MS, de adskiller sig voldsomt i de underliggende patologiske funktioner som inddragelse af det adaptive immunsystem. EAE er den mest almindelige dyremodel, som det er især nyttig til at undersøge neuroinflammatoriske veje og fungerer ofte som en "proof-of-principle" model for effekten af nye behandlingsstrategier 5,6. EAE kan induceres i mange forskellige dyr (fx mus, rotter, miniswine, marsvin, høns eller primater). Imidlertid har mus blevet den mest udbredte brug art, som i det mindste delvis skyldestil at udvide repertoire af sofistikeret transgene eller knockout mus 7.
Patofysiologien af EAE er baseret på reaktionen af immunsystemet mod hjerne-specifikke antigener. Denne reaktion inducerer inflammation og destruktion af antigen regnskabsmæssige strukturer, hvilket resulterer i neurologiske og patologiske træk sammenlignelige som dem, der observeres i MS-patienter. Der kan skelnes mellem tre forskellige tilgange: Aktivt induceret EAE (aEAE, aktiv immunisering), passivt overført EAE (pEAE, overførsel af encephalitogene celler fra et immuniseret dyr), og for nylig spontane EAE musemodeller (sEAE), der giver studiet af autoimmune mekanismer uden exogen manipulation. Den nemmeste inducerbare model er aEAE i mus der giver i hurtige og robuste resultater. Denne model betragtes som "gold standard" for neuroimmunologiske dyremodeller af mange forskere på området 8.
For aEAE induktion dyretimmuniseres med en subkutan injektion af en emulsion bestående af det valgte antigen og komplet Freunds adjuvans (CFA), ledsaget af en intraperitoneal injektion af pertussistoksin på dagen for immunisering og to dage senere. Derfor er myelin-specifikke T-lymfocytter aktiveres i periferien og migrere ind i CNS gennem blod-hjerne-barrieren. Ved indrejse i CNS, er T-celler reaktiveres ved lokale og infiltrerer antigenpræsenterende celler resulterer i efterfølgende inflammatoriske kaskader, inddragelse af andre celler som monocytter eller makrofager og til sidst i demyelinisering og aksonal celledød 9. Afhængig immuniseringsprotokollen og kombination af musestamme (f.eks C57BL / 6, SJL / J, Biozzi) og antigen (f.eks myelin oligodendrocyt glycoprotein (MOG), myelin basic protein (MBP), myelin proteolipidprotein (PLP)) sygdommen Selvfølgelig kan tage en akut, kronisk progressiv eller attakvis sygdomsforløbet.
<p class= "Jove_content"> C57BL / 6 mus er blevet den mest almindeligt anvendte stamme i transgene mus konstruktion og en stigende mangfoldighed af knockout eller transgene mus er tilgængelig. Vi her beskrive en protokol for immunisering af C57BL / 6 mus med MOG 35-55 peptid 10, hvilket resulterer i en monofasisk EAE med første symptomer efter 9-14 dage, maksimum sygdom ca 3-5 dage efter sygdomsdebut og langsom og delvis symptom opsving over de næste 10-20 dage. Som det immunogene potentiale MOG 35-55 peptid alene ikke er tilstrækkelig til at fremkalde sygdom, adjuvanser, såsom CFA er nødvendige. Det antages, at komponenterne i CFA aktivere mononukleære fagocytter inducerer fagocytose af disse molekyler og sekretion af cytokiner. Dette resulterer i en forlængelse af tilstedeværelsen af antigener og en mere effektiv transport af disse til lymfesystemet. EAE induktion lettes ved anvendelse af pertussistoksin (PT), der blandt andet blevet foreslået at modulereblod-hjerne-barrieren og immunologiske funktion selv 11. Efter sygdom induktion, skal der tages særlig pleje til daglig evaluering af mus til sygdomssymptomer.Et væld af forskellige EAE-modeller med aktive immuniseringsprotokoller er blevet beskrevet i de seneste årtier. Mens rottemodeller er ofte blevet brugt indtil for nylig, er mus nu den mest populære model organisme til EAE forskning. Denne udvikling er blandt andet på grund af den brede og stadigt voksende repertoire af tilgængelige transgene mus. Immunisering af C57BL / 6 mus med MOG 35-55 peptid er en af de mest udbredte EAE-modeller og kan betragtes som en pålidelig, reproducerbare og godt at bruge dyremodel. I mange neuroimmunologiske laboratorier er MOG 35-55 induceret EAE etableret som den model af valg, mens andre EAE modeller bruges til mere specifikke eksperimentelle spørgsmål.
Et kritisk punkt at overveje, er planlægningen af de eksperimentelle indstillinger for at sikre, at EAE eksperimenter udføres metodisk korrekt. For intern validitet er blindet scoring af sygdomssymptomer stærkt anbefales. Experimental grupper skal være alderssvarende, vægt-og køn-matchede og mus bør der tilfældigt allokeret til behandlingsgrupper. Forsøgene bør altid udføres i overensstemmelse med regler for dyrevelfærd. EAE undersøgelser er ofte underdimensioneret og ikke tager højde for statistiske type II fejl. Derfor, forud for eksperimenter beregninger prøvestørrelses skal udføres. Nødvendige gruppe størrelser afhænger af den forventede effekt størrelse. Høring af en ekspert til statistisk analyse kunne overvejes, før du starter EAE eksperimenter.
Nogle begrænsninger af protokollen skal holdes for øje. Vigtigst er fortolkningen af aEAE data kompromitteret af den tilstand af immunisering med anvendelse af adjuvans og pertussistoksin der begge har yderligere indflydelse på den immunologiske reaktion. Det bør også overvejes at MOG 35-55 EAE model viser primært CD4 + T-celle drevet immunologisk respons. CD8 + T-celler og B-celler spilleren mindre fremtrædende rolle og alternative protokoller bør overvejes, når man behandler disse celletyper. Den forventede sygdomsforløb er akut, monofasiske og selvbegrænsende. Alternativt kan en anfaldsformen naturligvis også opnås i alternative EAE-modeller. En yderligere vigtig begrænsning af protokollen er en vis skævhed i retning af den immunologiske komponent MS patofysiologi. I de seneste år er det blevet stadig mere klart, at MS har en stærk neurodegenerativ komponent. Død af oligodendrocytter og neuroner resulterer i en progressiv akkumulering af neurologiske underskud. Det skal tages i betragtning, at EAE modellen ikke kan fuldt ud egnet til at løse eksperiment spørgsmål vedrørende neurodegenerative mekanismer autoimmun inflammation. Alternative dyremodeller med fokus på CNS-patologi kan betragtes – f.eks cuprizone model, som kompromitterer giftig demyelination uden involvering af perifere immunsystem.
Den beskrevne protokol kan betragtes som en grundlæggende neuroimmunologiske eksperimentel model og kan ændres til andre anvendelser. Den eksperimentelle procedure beskrevet ovenfor, kan nemt anvendes på andre EAE-protokoller ved varierende mus stammer eller typen og mængden af protein (fx bruge PLP 139-151 peptid og SJL-mus til en recidiverende-remitterende EAE sygdom kursus, som er specielt velegnet til at vurdere terapeutisk virkninger på tilbagefald). Den beskrevne protokol kan også anvendes til adoptiv-transfer eksperimenter (passiv EAE). I denne model er C57BL / 6 mus immuniseret med MOG 35-55 peptid og CFA som beskrevet ovenfor. I modsætning hertil er pertussistoksin ikke påkrævet. Efter 7-15 dage, milt eller lymfeknuder isoleres og immune celler restimuleret in vitro med MOG 35-55 peptid og forskellige cytokiner før overførsel til en ny gruppe af C57BL/6se mus. Disse recipientmus udvikler EAE et par dage tidligere end ved klassisk immunisering. In vitro-betingelser kan varieres til specifikke immunologiske spørgsmål (fx polarisering i T H 1 eller T H 17 celler).
Nogle gange kan lave forekomst sygdom eller svage symptomer være en eksperimentel udfordring. Nogle anbefalinger til fejlsøgning er:
– Sygdom sværhedsgraden kan varieres med forskellige mængder af peptid / mus.
– Optimal CFA koncentration kan variere fra 1-5, mg / ml. Overvej en titrering af CFA, når oprettelse af forsøgene. Der henvises til de respektive retningslinjer for respektive institutionelle dyrepleje og brug udvalg for tilladte CFA koncentrationer så mange regler forbyde CFA koncentrationer over 2 mg / ml.
– Forskellige metoder er beskrevet for udarbejdelse af emulsionen. Alternative metoder såsom vortex i 1 time eller lydbehandling kan overvejes, hvis dårlig emulgering betragtes som possible fejlkilde.
– Alder, køn, årstid og miljøforholdene inden dyret facilitet er vigtige faktorer, der påvirker EAE modtagelighed. Det bør sikres, at vilkårene er sammenlignelige mellem uafhængige forsøg.
Som beskrevet ovenfor kan nævnte protokol anvendes som udgangspunkt for adoptiv EAE forsøg. Denne model er specielt velegnet til adskillelse randområder og CNS-virkninger af en genetisk fænotype (fx ved at overføre encephalitogene knockout celler i vildtypemus recipientmus) og for specifikke immunologiske spørgsmål som fænotypen af de overførte celler kan karakteriseres grundigt. Den seneste udvikling i EAE forskning i løbet af de seneste år er T-celle receptor transgene mus. Disse mus udvikler EAE symptomer spontant uden ydre påvirkning omgå problemet med adjuverende podning. Denne model kræver imidlertid store mængder dyr til breeding at sikre tilstrækkelige gruppe størrelser. Evaluering af knockout-mus kræver krydsning før EAE forsøg i modsætning til aEAE. Da hver mus udvikler sygdomssymptomer på en anden dag, kan vurderingen af nye stoffer være temmelig kompliceret. Derfor er værdien af klassisk aEAE for neuroimmunologiske forbliver uændret.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af Interdisciplinært Center for Klinisk Forskning (IZKF) Münster (SEED 12/3, SB).
Female C57BL/6 mice, age 10-12 weeks, ~20 g weight | e.g. Jackson Laboratory, Charles River | ||
MOG35-55 (MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK) | e.g. Pepceuticals Ltd | Store at -20°C | |
Incomplete Freund’s adjuvant (IFA) | e.g. Sigma-Aldrich Co. | F5506 | Store at 4 °C. |
Syringes, 1 ml with 26G3/8 needle | e.g. Becton Dickinson & Co. | 309625 | |
Syringes, 2 ml | e.g. B. Braun | 7389 | |
Needles, 25G5/8 and 30G1/2 | e.g. Becton Dickinson & Co., | 305122, 305106 | |
Three way halve | e.g. B. Braun | 16494 C | |
Pertussis toxin, lyophilized in buffer | Enzo Life Sciences Inc. | BML-G100 | Store at 4 °C. |
M. tuberculosis H37 RA | BD Difco | 231141 | Store at 4 °C. |