प्रायोगिक autoimmune इंसेफैलोमाईलिटिस (EAE) एकाधिक काठिन्य के एक स्थापित पशु मॉडल है. C57BL 6 / चूहों केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में autoreactive प्रतिरक्षा कोशिकाओं की वजह से एक आरोही झूलता हुआ पक्षाघात में जिसके परिणामस्वरूप, माइलिन oligodendrocyte ग्लाइकोप्रोटीन (MOG) पेप्टाइड 35-55 (MOG 35-55) के साथ प्रतिरक्षित कर रहे हैं. रोग प्रेरण और निगरानी के लिए प्रोटोकॉल पर चर्चा की जाएगी.
एकाधिक काठिन्य एक मजबूत neurodegenerative घटक के साथ केंद्रीय तंत्रिका तंत्र की एक पुरानी neuroinflammatory demyelinating विकार है. रोग की सटीक एटियलजि अभी तक स्पष्ट नहीं है, autoreactive टी लिम्फोसाइट अपने pathophysiology में एक केंद्रीय भूमिका निभाने के लिए लगा रहे हैं. एमएस चिकित्सा अब तक केवल आंशिक रूप से प्रभावी है और अनुसंधान के प्रयासों की बीमारी के pathophysiology पर हमारे ज्ञान का विस्तार करने और उपन्यास उपचार रणनीति विकसित करने के लिए जारी है. प्रायोगिक autoimmune इंसेफैलोमाईलिटिस (EAE) एमएस कई नैदानिक और pathophysiological सुविधाओं को साझा करने के लिए सबसे आम पशु मॉडल है. मानव एमएस के अलग, नैदानिक प्रतिरक्षाविज्ञानी और ऊतकीय पहलुओं को प्रतिबिंबित जो EAE मॉडल की एक व्यापक विविधता है. चूहों में सक्रिय रूप से प्रेरित EAE मजबूत और replicable परिणामों के साथ सबसे आसान inducible मॉडल है. यह विशेष रूप से autoimmune neuroi द्वारा चुनौती ट्रांसजेनिक चूहों का उपयोग करके दवाओं की या विशेष जीन के प्रभाव की जांच के लिए अनुकूल हैnflammation. इसलिए, चूहों सीएनएस homogenates या माइलिन प्रोटीन के पेप्टाइड्स के साथ प्रतिरक्षित कर रहे हैं. कारण इन पेप्टाइड्स के कम immunogenic क्षमता को मजबूत, adjuvants उपयोग किया जाता है. EAE संवेदनशीलता और phenotype चुना प्रतिजन और कृंतक तनाव पर निर्भर करता है. C57BL 6 / चूहों ट्रांसजेनिक माउस निर्माण के लिए आमतौर पर इस्तेमाल तनाव हैं और माइलिन oligodendrocyte ग्लाइकोप्रोटीन (MOG) के लिए दूसरों के बीच में जवाब. immunogenic मिलान MOG 35-55 दो दिन बाद टीकाकरण के दिन पर लागू है और पूरा Freund के सहायक (सीएफए) से पहले टीकाकरण और काली खांसी विष में निलंबित कर दिया है. चूहे टीकाकरण के बाद 9-14 दिनों के भीतर झूलता हुआ पक्षाघात आरोही साथ एक "क्लासिक" आत्म सीमित monophasic EAE विकास. चूहे 25-50 दिनों के लिए एक नैदानिक स्कोरिंग प्रणाली का उपयोग दैनिक मूल्यांकन कर रहे हैं. देखभाल EAE के साथ जानवरों के रूप में लेने के साथ ही इस मॉडल के संभावित अनुप्रयोगों और सीमाओं के लिए विशेष ध्यान चर्चा कर रहे हैं.
मल्टीपल स्केलेरोसिस (एमएस) के केंद्रीय तंत्रिका तंत्र की एक पुरानी demyelinating सूजन की बीमारी है जिसमें heterogenic और जमते नैदानिक लक्षणों में oligodendrocytes और न्यूरॉन्स के परिणाम के विनाश. एमएस केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) के एक prototypic autoimmune विकार के रूप में माना जाता है और पशु मॉडल इसकी जटिल रोगजनन पर प्रकाश डाला करने के लिए विकसित किया गया है. इसके अलावा, मौजूदा चिकित्सा केवल आंशिक रूप से प्रभावी हैं और neurodegenerative घटक शायद भविष्य चिकित्सकीय के लिए बड़ी चुनौती है, जबकि मुख्य रूप से रोग के भड़काऊ चरण को लक्ष्य 1,2 दृष्टिकोण.
रोग की सटीक एटियलजि अभी तक स्पष्ट नहीं है, सीएनएस में axons की माइलिन आवरण पर epitopes के खिलाफ एक autoimmune प्रतिक्रिया रोग की शुरुआत को भड़काने के लिए माना जाता है. प्रतिरक्षा प्रणाली, आनुवंशिक भेद्यता और पर्यावरणीय कारकों (जैसे संक्रमण, विटामिन डी) की dysregulation माना जाता हैएमएस के pathophysiological तंत्र के प्रभाव केंद्रीय पहलुओं.
पशु मॉडल की तीन अलग अलग प्रकार वर्तमान में एमएस की वैकृत पैटर्न की खोज के लिए स्थापित कर रहे हैं: Theiler के murine इंसेफैलोमाईलिटिस वायरस (TMEV) जैसे वायरल मॉडल, cuprizone तरह विषाक्त एजेंटों द्वारा प्रेरित मॉडल, और प्रयोगात्मक autoimmune इंसेफैलोमाईलिटिस (EAE) 3 के अंत में अलग वेरिएंट, 4. वे सभी एमएस की विशेषताओं की नकल है, वे अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणाली की भागीदारी जैसे अंतर्निहित रोग सुविधाओं में काफी मतभेद है. यह neuroinflammatory रास्ते की जांच के लिए विशेष रूप से उपयोगी है और अक्सर उपन्यास उपचार रणनीति 5,6 की प्रभावकारिता के लिए एक "सबूत के सिद्धांत" मॉडल के रूप में कार्य करता है के रूप में EAE सबसे आम पशु मॉडल है. EAE कई विभिन्न जानवरों (जैसे चूहे, चूहे, miniswine, गिनी सूअर, मुर्गी, या प्राइमेट) में प्रेरित किया जा सकता है. हालांकि, चूहों में कम से कम आंशिक रूप से कारण है जो सबसे अधिक व्यापक रूप से उपयोग प्रजातियों बन गए हैंपरिष्कृत ट्रांसजेनिक या पीटा चूहों 7 के प्रदर्शनों की सूची का विस्तार करने के लिए.
EAE के pathophysiology मस्तिष्क के विशिष्ट एंटीजन के खिलाफ प्रतिरक्षा प्रणाली की प्रतिक्रिया पर आधारित है. यह प्रतिक्रिया तुलनीय तंत्रिका विज्ञान और रोग सुविधाओं में जिसके परिणामस्वरूप, प्रतिजन ले जाने संरचनाओं की सूजन और विनाश को प्रेरित करता है जो एमएस रोगियों में मनाया उन. तीन अलग अलग दृष्टिकोण प्रतिष्ठित किया जा सकता है: सक्रिय प्रेरित EAE (aEAE; सक्रिय प्रतिरक्षण); autoimmune के अध्ययन की अनुमति है, जो और अधिक हाल ही में सहज EAE माउस मॉडल (sEAE) निष्क्रिय EAE तबादला, (एक प्रतिरक्षित पशु से मस्तिष्कशोथ उत्पन्न करने वाला कोशिकाओं के हस्तांतरण pEAE) एक्सोजेनस हेरफेर के बिना तंत्र. सबसे आसान inducible मॉडल तेजी से और मजबूत परिणामों में उपज चूहों में aEAE है. इस मॉडल क्षेत्र 8 में कई शोधकर्ताओं द्वारा neuroimmunological पशु मॉडल की "सोने के मानक 'के रूप में माना जाता है.
AEAE शामिल होने के लिए, पशुचुना प्रतिजन से मिलकर एक पायस की एक चमड़े के नीचे इंजेक्शन के साथ प्रतिरक्षित और टीकाकरण के दिन और दो दिन बाद पर काली खांसी विष की intraperitoneal इंजेक्शन के साथ Freund के adjuvans (सीएफए) पूरा हो गया है. नतीजतन, माइलिन विशेष टी लिम्फोसाइट परिधि में सक्रिय है और रक्त मस्तिष्क बाधा पार सीएनएस में प्रवास कर रहे हैं. सीएनएस में प्रवेश पर, टी कोशिकाओं monocytes या मैक्रोफेज और अंततः demyelination और axonal कोशिका मृत्यु 9 में जैसे अन्य कोशिकाओं के बाद भड़काऊ Cascades, भागीदारी में जिसके परिणामस्वरूप स्थानीय और घुसपैठ प्रतिजन कोशिकाओं पेश द्वारा पुन: सक्रिय कर रहे हैं. प्रतिरक्षण प्रोटोकॉल और माउस तनाव के संयोजन पर निर्भर करता है (जैसे C57BL / 6, SJL / जम्मू, Biozzi) और प्रतिजन (जैसे माइलिन oligodendrocyte ग्लाइकोप्रोटीन (MOG), माइलिन बुनियादी प्रोटीन (MBP), माइलिन proteolipid प्रोटीन (पीएलपी)), रोग बेशक एक तीव्र, पुरानी प्रगतिशील या relapsing प्रेषक रोग पाठ्यक्रम ले जा सकते हैं.
<p class= "Jove_content"> C57BL 6 / चूहों ट्रांसजेनिक चूहों निर्माण के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल तनाव बन गए हैं और पीटकर या ट्रांसजेनिक चूहों की बढ़ती भीड़ उपलब्ध है. हम यहाँ MOG के बारे में 3-5 दिनों रोग शुरू होने और धीमी गति से और आंशिक लक्षण वसूली के बाद 9-14 दिनों, रोग अधिकतम बाद पहला लक्षण के साथ एक monophasic EAE में जो परिणाम 35-55 पेप्टाइड 10 के साथ C57BL 6 / चूहों के टीकाकरण के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन अगले 10-20 दिनों में खत्म. अकेले MOG 35-55 पेप्टाइड की immunogenic संभावित रोग को उत्पन्न करने के लिए पर्याप्त नहीं है, ऐसे सीएफए के रूप में adjuvants जरूरी हैं. यह सीएफए के घटकों इन अणुओं की phagocytosis और साइटोकिन्स के स्राव उत्प्रेरण मोनोन्यूक्लियर फ़ैगोसाइट को सक्रिय करता है, माना जाता है. इस एंटीजन की उपस्थिति और लसीका प्रणाली के लिए इनमें से एक अधिक कुशल परिवहन की मोहलत में यह परिणाम है. EAE प्रेरण दूसरों के बीच में मिलाना करने का सुझाव दिया गया है जो काली खांसी विष (पीटी) के आवेदन से मदद की हैरक्त मस्तिष्क बाधा और प्रतिरक्षा जवाबदेही ही 11. रोग प्रेरण के बाद, विशेष देखभाल की बीमारी के लक्षणों के लिए चूहों की दैनिक मूल्यांकन के लिए लिया जाना चाहिए.सक्रिय प्रतिरक्षण प्रोटोकॉल के साथ अलग EAE मॉडल की एक भीड़ ने पिछले दशकों में वर्णित किया गया है. चूहे मॉडल व्यापक रूप से हाल ही में जब तक इस्तेमाल किया गया है, चूहों अब EAE अनुसंधान के लिए सबसे लोकप्रिय मॉडल जीव हैं. इस विकास के कारण उपलब्ध ट्रांसजेनिक चूहों के व्यापक और बढ़ती प्रदर्शनों की सूची के लिए दूसरों के बीच में है. MOG 35-55 पेप्टाइड साथ C57BL 6 / चूहों का टीकाकरण सबसे व्यापक रूप से वितरित EAE मॉडलों में से एक है और एक विश्वसनीय, replicable और अच्छी तरह से उपयोग पशु मॉडल के रूप में माना जा सकता है. अन्य EAE मॉडल अधिक विशिष्ट प्रयोगात्मक प्रश्नों के लिए उपयोग किया जाता है, जबकि कई neuroimmunological प्रयोगशालाओं में, MOG 35-55 प्रेरित EAE पसंद के मॉडल के रूप में स्थापित है.
विचार करने के लिए एक महत्वपूर्ण बिंदु EAE प्रयोगों methodologically सही प्रदर्शन कर रहे हैं कि यह सुनिश्चित करने के लिए प्रयोगात्मक सेटिंग्स की योजना बना रही है. आंतरिक वैधता के लिए, रोग के लक्षणों का अंधा स्कोरिंग अत्यधिक की सिफारिश की है. अनुभवimental समूहों होना चाहिए उम्र, वजन, और सेक्स से मिलान और चूहों बेतरतीब ढंग से उपचार समूहों को आवंटित किया जाना चाहिए. प्रयोगों को हमेशा पशु कल्याण के नियमों के अनुपालन में किया जाना चाहिए. EAE अध्ययन अक्सर underpowered हैं और खाते में सांख्यिकीय प्रकार द्वितीय त्रुटियाँ नहीं लेते. इसलिए, पिछले प्रयोगों के लिए, नमूना आकार गणना प्रदर्शन किया जाना चाहिए. आवश्यक समूह आकार अपेक्षित प्रभाव आकार पर निर्भर करते हैं. सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए एक विशेषज्ञ के परामर्श EAE प्रयोगों शुरू करने से पहले विचार किया जा सकता है.
प्रोटोकॉल के कुछ सीमाओं को ध्यान में रखा जाना चाहिए. सबसे महत्वपूर्ण बात, aEAE डेटा की व्याख्या प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया पर दोनों अतिरिक्त प्रभाव है जो सहायक, काली खांसी और विष के प्रयोग के साथ टीकाकरण के मोड से समझौता किया है. यह भी MOG 35-55 EAE मॉडल मुख्य रूप से प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया प्रेरित एक सीडी 4 + टी सेल से पता चलता है कि विचार किया जाना चाहिए. सीडी 8 + टी कोशिकाओं और बी कोशिकाओं खेलनाइन प्रकार की कोशिकाओं को संबोधित जब एक कम प्रमुख भूमिका और वैकल्पिक प्रोटोकॉल पर विचार किया जाना चाहिए. उम्मीद रोग कोर्स, तीव्र monophasic और आत्म – सीमित है. वैकल्पिक रूप से, एक relapsing-remitting रोग कोर्स भी वैकल्पिक EAE मॉडल में प्राप्त किया जा सकता है. प्रोटोकॉल की एक और महत्वपूर्ण सीमा एमएस pathophysiology के प्रतिरक्षात्मक घटक की दिशा में एक निश्चित पूर्वाग्रह है. पिछले वर्षों के दौरान, यह एमएस एक मजबूत neurodegenerative घटक है कि तेजी से स्पष्ट हो गया है. स्नायविक घाटे के एक प्रगतिशील संचय में oligodendrocytes और न्यूरॉन्स के परिणाम की मौत. यह EAE मॉडल पूरी तरह autoimmune सूजन की neurodegenerative तंत्र के विषय में प्रयोग सवालों का पता करने के लिए उपयुक्त नहीं हो सकता है कि ध्यान में रखा जाना चाहिए. सीएनएस विकृति पर ध्यान देने के साथ वैकल्पिक पशु मॉडल पर विचार किया जा सकता है – परिधीय प्रतिरक्षा प्रणाली की भागीदारी के बिना विषाक्त demyelination समझौता जो cuprizone मॉडल उदा.
वर्णित प्रोटोकॉल एक बुनियादी neuroimmunological प्रयोगात्मक मॉडल के रूप में माना जा सकता है और अन्य अनुप्रयोगों के लिए संशोधित किया जा सकता है. ऊपर वर्णित प्रायोगिक प्रक्रिया को आसानी से अलग चूहों उपभेदों द्वारा अन्य EAE प्रोटोकॉल को लागू किया जा सकता है या प्रकार और प्रोटीन की मात्रा (जैसे चिकित्सकीय आकलन करने के लिए विशेष रूप से अनुकूल है जो एक relapsing-remitting EAE रोग कोर्स के लिए पीएलपी 139-151 पेप्टाइड और SJL चूहों का उपयोग relapses पर प्रभाव). वर्णित प्रोटोकॉल भी दत्तक हस्तांतरण प्रयोगों (निष्क्रिय EAE) के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इस मॉडल में, C57BL 6 / चूहों MOG 35-55 पेप्टाइड और ऊपर वर्णित के रूप में सीएफए के साथ प्रतिरक्षित कर रहे हैं. इसके विपरीत, काली खांसी विष की आवश्यकता नहीं है. 7-15 दिन, spleens या लिम्फ नोड्स अलग कर रहे हैं और प्रतिरक्षा कोशिकाओं C57BL/6se चूहों के एक नए समूह में स्थानांतरित करने से पहले MOG 35-55 पेप्टाइड और विभिन्न साइटोकिन्स के साथ इन विट्रो में restimulated कर रहे हैं. ये प्राप्तकर्ता चूहों कि कुछ दिन पहले clas पर से EAE विकसितसिकल प्रतिरक्षण. इन विट्रो स्थितियों विशिष्ट प्रतिरक्षा प्रश्नों के लिए (टी एच 1 या टी एच 17 कक्षों में जैसे ध्रुवीकरण) अलग किया जा सकता है.
कभी कभी, कम रोग की घटना या कमजोर लक्षण एक प्रयोगात्मक चुनौती हो सकती है. समस्या निवारण के लिए कुछ सिफारिशें की हैं:
– रोग की गंभीरता पेप्टाइड / माउस के विभिन्न मात्रा के साथ अलग किया जा सकता है.
– इष्टतम सीएफए एकाग्रता 1-5 मिलीग्राम / मिलीलीटर से भिन्न हो सकते हैं. प्रयोगों की स्थापना जब सीएफए की एक अनुमापन पर विचार करें. के रूप में कई नियमों 2 मिलीग्राम / एमएल से अधिक सीएफए सांद्रता मना अनुमति दी सीएफए सांद्रता के लिए संबंधित संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति के संबंधित दिशा निर्देशों को देखें.
– विभिन्न तरीकों पायस की तैयारी के लिए वर्णित हैं. गरीब emulsification possib के रूप में माना जाता है कि अगर इस तरह 1 घंटा या sonication के लिए vortexing के रूप में वैकल्पिक तरीकों पर विचार किया जा सकता हैLe त्रुटि स्रोत.
– आयु, लिंग, वर्ष और जानवरों की सुविधा के भीतर पर्यावरण की स्थिति का मौसम EAE संवेदनशीलता को प्रभावित करने वाले महत्वपूर्ण कारक हैं. यह स्थितियां स्वतंत्र प्रयोगों के बीच तुलना कर रहे हैं कि यह सुनिश्चित किया जाना चाहिए.
ऊपर वर्णित है, का उल्लेख प्रोटोकॉल दत्तक EAE प्रयोगों के लिए बात शुरू के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. इस मॉडल विशेष रूप से (wildtype प्राप्तकर्ता चूहों में मस्तिष्कशोथ उत्पन्न करने वाला पीटकर कोशिकाओं में परिवर्तित करने से उदा) एक आनुवंशिक phenotype के परिधीय और सीएनएस प्रभाव को अलग करने के लिए और हस्तांतरित कोशिकाओं के phenotype अच्छी तरह होती जा सकता है के रूप में विशिष्ट प्रतिरक्षा सवालों के लिए अनुकूल है. पिछले वर्षों के दौरान EAE अनुसंधान के क्षेत्र में नवीनतम विकास टी सेल रिसेप्टर ट्रांसजेनिक चूहों हैं. इन चूहों को बाहरी प्रभाव सहायक टीका की समस्या को धोखा देने के बिना अनायास EAE लक्षण विकसित. हालांकि, इस मॉडल breedi के लिए जानवरों की बड़ी मात्रा की आवश्यकतापर्याप्त समूह आकार सुनिश्चित करने के लिए एनजी. पीटा चूहों का मूल्यांकन पिछले aEAE के विपरीत EAE प्रयोगों को crossbreeding की आवश्यकता है. प्रत्येक माउस एक अलग दिन पर रोग के लक्षण के रूप में विकसित, उपन्यास पदार्थों का मूल्यांकन नहीं बल्कि जटिल हो सकता है. इसलिए, neuroimmunological के लिए शास्त्रीय aEAE के मूल्य चुनौती बनी हुई है.
The authors have nothing to disclose.
इस काम क्लीनिकल रिसर्च के लिए अंतःविषय केंद्र (IZKF) मुंस्टर (बीज 12/3, एसबी) द्वारा समर्थित किया गया.
Female C57BL/6 mice, age 10-12 weeks, ~20 g weight | e.g. Jackson Laboratory, Charles River | ||
MOG35-55 (MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK) | e.g. Pepceuticals Ltd | Store at -20°C | |
Incomplete Freund’s adjuvant (IFA) | e.g. Sigma-Aldrich Co. | F5506 | Store at 4 °C. |
Syringes, 1 ml with 26G3/8 needle | e.g. Becton Dickinson & Co. | 309625 | |
Syringes, 2 ml | e.g. B. Braun | 7389 | |
Needles, 25G5/8 and 30G1/2 | e.g. Becton Dickinson & Co., | 305122, 305106 | |
Three way halve | e.g. B. Braun | 16494 C | |
Pertussis toxin, lyophilized in buffer | Enzo Life Sciences Inc. | BML-G100 | Store at 4 °C. |
M. tuberculosis H37 RA | BD Difco | 231141 | Store at 4 °C. |