Eksperimentell autoimmun encefalomyelitt (EAE) er en etablert dyremodell av multippel sklerose. C57BL / 6 mus immunisert med myelin oligodendrocyte glykoprotein (MOG) peptid 35-55 (MOG 35-55), noe som resulterer i en stigende slapp lammelse forårsaket av autoreaktive immunceller i sentralnervesystemet. Protokoller for sykdom induksjon og overvåking vil bli diskutert.
Multippel sklerose er en kronisk neuroinflammatory demyelinerende sykdom i sentralnervesystemet med en sterk neurodegenerative komponent. Mens den eksakte etiologi av sykdommen er ennå uklart, er autoreaktive T-lymfocytter tenkt å spille en sentral rolle i sin patofysiologi. MS terapi er bare delvis effektiv så langt og forskningsinnsats fortsette å utvide vår kunnskap om patofysiologien av sykdommen og for å utvikle nye behandlingsstrategier. Eksperimentell autoimmun encefalomyelitt (EAE) er den mest vanlige dyremodell for MS deler mange kliniske og patofysiologiske funksjoner. Det er et bredt mangfold av EAE modeller som reflekterer ulike kliniske, immunologiske og histologiske aspekter av menneskelige MS. Aktivt-indusert EAE i mus er den enkleste induserbar modell med robuste og kopier resultater. Det er spesielt egnet for å undersøke effekten av narkotika eller av bestemte gener ved hjelp av transgene mus utfordret av autoimmune neuroinflammation. Derfor blir musene immunisert med CNS-homogenater eller peptider av myelin proteiner. På grunn av den lave immunogene potensial av disse peptidene, er kraftige adjuvanser anvendes. EAE følsomhet og fenotype avhenger av den valgte antigen og gnager belastning. C57BL / 6 mus er ofte brukt påkjenning for transgen muse konstruksjon og svare bl.a. til myelin oligodendrocyte glykoprotein (MOG). Den immunogene epitop MOG 35-55 blir suspendert i Freunds fullstendige adjuvans (CFA) før immunisering og pertussis toxin anvendes på dagen for immunisering, og to dager senere. Mus utvikle en "klassisk" selvbegrensende monofasisk EAE med stigende slapp lammelse innen 9-14 dager etter vaksinasjon. Mus evalueres daglig bruker en klinisk scoring system for 25-50 dager. Spesielle hensyn til omsorg tar av dyr med EAE samt potensielle bruksområder og begrensninger av denne modellen blir diskutert.
Multippel sklerose (MS) er en kronisk demyelinerende inflammatorisk sykdom i sentralnervesystemet, karakterisert ved at ødeleggelsen av oligodendrocytter og nevroner resulterer i heterogene og samler kliniske symptomer. MS er regnet som en prototypic autoimmun sykdom i sentralnervesystemet (CNS) og dyremodeller har blitt utviklet for å belyse sin komplekse patogenesen. Videre er nåværende terapier er bare delvis effektive, og målet hovedsakelig den inflammatoriske fase av sykdommen, mens den neurodegenerative komponenten er sannsynligvis den største utfordring for fremtidig terapeutisk nærmer seg 1,2.
Mens den eksakte etiologien av sykdommen er fremdeles usikker, er en autoimmun reaksjon mot epitoper på myelinlaget av aksoner i sentralnervesystemet antatt å provosere utbruddet av sykdommen. Feilregulering av immunsystemet, genetisk sårbarhet og miljøfaktorer (f.eks infeksjoner, vitamin D) antas åpåvirke sentrale aspekter ved de patofysiologiske mekanismene for MS.
Tre ulike typer dyremodeller er i dag etablert for utforskning av patologiske mønstre av MS: Viral modeller som Theiler sin murine encefalomyelitt virus (TMEV), modeller indusert av giftstoffer som cuprizone, og til slutt ulike varianter av eksperimentell autoimmun encefalomyelitt (EAE) 3, 4. Selv om de alle etterligne funksjonene i MS, skiller de seg enormt i underliggende patologiske funksjoner som involvering av det adaptive immunsystemet. EAE er den mest vanlige dyremodell som den er spesielt nyttig for å undersøke neuroinflammatory trasé og ofte tjener som et "bevis-for-prinsipp" modell for effekten av nye behandlingsstrategier 5,6. EAE kan induseres i mange forskjellige dyr (for eksempel mus, rotter, miniswine, marsvin, kyllinger, eller primater). Imidlertid har musene blitt den mest utbredte bruk arter som er i det minste delvis på grunnå utvide repertoaret av sofistikerte transgene eller knockout mus 7.
Patofysiologien av EAE er basert på reaksjonen av immunsystemet mot hjerne-spesifikke antigener. Denne reaksjonen induserer betennelse og ødeleggelse av antigen bærekonstruksjoner, noe som resulterer i nevrologiske og patologiske funksjoner sammenlignbare som de som ble observert hos MS-pasienter. Tre ulike tilnærminger kan skilles: Aktivt-indusert EAE (aEAE; aktiv immunisering), passivt overført EAE (pEAE; overføring av encefalitogeniske celler fra en immunisert dyr), og mer nylig spontane EAE musemodeller (sEAE) som gjør at studiet av autoimmune mekanismer uten eksogen manipulasjon. Den enkleste induserbar modellen er aEAE i mus givende i raske og robuste resultater. Denne modellen er regnet som "gullstandarden" av neuroimmunological dyremodeller av mange forskere på feltet åtte.
For aEAE induksjon, dyreter immunisert med en subkutan injeksjon av en emulsjon som består av det valgte antigen, og Freunds fullstendige adjuvans (CFA) ledsaget av en intraperitoneal injeksjon av pertussis toxin på dagen for immunisering, og to dager senere. Følgelig er myelin-spesifikke T-lymfocytter aktiveres i periferien og migrere inn i CNS over blod-hjerne-barrieren. Ved registrering i CNS, er T-celler aktiveres av lokale og infiltrere antigenpresenterende celler som resulterer i påfølgende inflammatoriske kaskader, involvering av andre celler som monocytter eller makrofager og til slutt i demyelinisering og aksonal celledød ni. Avhengig av immuniseringsprotokollen, og kombinasjoner av musestamme (f.eks C57BL / 6, SJL / J, Biozzi) og antigen (f.eks myelin oligodendrocyte glykoprotein (MOG), myelin basisk protein (MBP), myelin proteolipid protein (PLP)), sykdommen Selvfølgelig kan ta en akutt, kronisk progressiv eller relapsing remitting sykdomsforløpet.
<p class= "Jove_content"> C57BL / 6 mus har blitt den mest brukte belastning for transgene mus konstruksjon og et voksende mangfold av knockout eller transgene mus er tilgjengelig. Vi her beskriver en protokoll for immunisering av C57BL / 6 mus med MOG 35-55 peptid 10 som resulterer i en monofasisk EAE med første symptomer etter 9-14 dager, sykdom maksimalt ca 3-5 dager etter sykdomsutbruddet og treg og delvis symptom utvinning i løpet av de neste 10-20 dagene. Som det immunogene potensial av MOG 35-55 peptidet alene er ikke tilstrekkelig til å fremkalle sykdommen, hjelpemidler slik som CFA er nødvendig. Det antas, at komponentene i CFA aktivere mononukleære fagocytter som induserer fagocytose av disse molekylene og sekresjon av cytokiner. Dette resulterer i en forlengelse av nærvær av antigener, og en mer effektiv transport av disse til det lymfatiske system. EAE-induksjon lettes ved anvendelse av pertussis toksin (PT), som er blant annet blitt foreslått å modulereblod-hjerne-barrieren, og den immunologiske respons i seg selv 11. Etter sykdom induksjon, må man være spesielt forsiktig for daglig evaluering av mus for sykdomssymptomer.Et mangfold av ulike EAE modeller med aktiv immunisering protokoller har blitt beskrevet de siste tiårene. Mens rottemodeller har vært mye brukt inntil nylig, mus er nå den mest populære modellorganisme for EAE forskning. Denne utviklingen er blant annet på grunn av den omfattende og stadig økende repertoar av tilgjengelige transgene mus. Immunisering av C57BL / 6 mus med MOG 35-55 peptidet er en av de mest utbredte EAE-modeller, og kan betraktes som en pålitelig og repliserbar og godt å bruke dyremodell. I mange neuroimmunological laboratorier, er MOG 35-55 indusert EAE etablert som modell for valg mens andre EAE modeller brukes til mer spesifikke eksperimentelle spørsmål.
Et kritisk punkt å vurdere er planleggingen av den eksperimentelle innstillinger for å sikre at EAE eksperimenter utføres metodisk korrekt. For intern validitet, er blindet scoring av sykdom symptomer anbefales. Kompetanseimental grupper bør være alders, vekt-og sex-matchet og mus bør være tilfeldig fordelt til behandlingsgruppene. Eksperimenter skal alltid utføres i samsvar med dyrevern forskrifter. EAE studier er ofte underpowered og ikke tar hensyn til statistiske type II feil. Derfor, før forsøk, beregninger prøvestørrelse bør utføres. Nødvendige gruppe størrelser er avhengig av den forventede effektstørrelse. Høring av en ekspert for statistisk analyse kan tas i betraktning før du starter EAE eksperimenter.
Noen begrensninger i protokollen må holdes i bakhodet. Viktigst er tolkningen av aEAE data kompromittert av modusen for immunisering ved bruk av hjelpestoff-og pertussis-toksin som har både ekstra innflytelse på den immunologiske reaksjon. Det bør også tas i betraktning at MOG 35-55 EAE-modellen viser i hovedsak en CD4 + T-celle drevet immunologisk respons. CD8 + T-celler og B-celler spilleren mindre fremtredende rolle og alternative protokoller bør vurderes når du adresserer disse celletypene. Den forventede sykdomsforløp er akutt, monofasisk og selvbegrensende. Alternativt kan en relapsing-remitting sykdomsforløpet også oppnås i alternative EAE modeller. En annen viktig begrensning av protokollen er en viss skjevhet mot den immunologiske komponent av MS patofysiologi. I løpet av de siste årene har det blitt stadig klarere at MS har en sterk nevrodegenerativ komponent. Den døde oligodendrocytes og nevroner resultater i en progressiv oppbygging av nevrologiske underskudd. Det må tas hensyn til at EAE modellen ikke kan være fullt egnet til å ta eksperimentet spørsmål om nevrodegenerative mekanismer for autoimmun betennelse. Alternative dyremodeller med fokus på CNS patologi kan betraktes – f.eks cuprizone modell som kompromisser giftig demyelinisering uten involvering av perifer immunsystemet.
Den beskrevne protokollen anses som en grunnleggende neuroimmunological eksperimentell modell og kan endres for andre programmer. Den eksperimentelle fremgangsmåte som er beskrevet ovenfor kan lett anvendes på andre EAE protokoller ved varierende muse-stammer, eller type og mengde av protein (f.eks bruke PLP 139-151 peptid og SJL mus for en remitterende EAE sykdomsforløpet som er spesielt egnet for vurdering av terapeutisk virkninger på tilbakefall). Den beskrevne protokoll kan også brukes for adoptive overføringsforsøk (passive EAE). I denne modellen blir C57BL / 6 mus immunisert med MOG 35-55 peptid og CFA som beskrevet ovenfor. I kontrast er pertussis toksin ikke nødvendig. Etter 7-15 dager, milt eller lymfeknuter er isolert og immunceller er restimulert in vitro med MOG 35-55 peptidet og forskjellige cytokiner før overføring til en ny gruppe av C57BL/6se mus. Disse mottaker musene utvikler EAE noen dager tidligere enn på clasSical immunisering. In vitro-betingelsene kan varieres etter spesielle immunologiske spørsmål (f.eks polarisering inn i T H T H 1 eller 17 celler).
Noen ganger kan lav sykdom forekomst eller svake symptomer være et eksperimentelt utfordring. Noen anbefalinger for feilsøking er:
– Disease alvorlighetsgraden kan varieres med ulike mengder av peptid / mus.
– Optimal CFA konsentrasjonen kan variere 1-5 mg / ml. Vurdere en titrering av CFA ved etablering av forsøkene. Vennligst referer til de respektive retningslinjer for de respektive institusjonelle dyr omsorg og bruk komité for tillatt CFA konsentrasjoner så mange forskrifter forby CFA konsentrasjoner som overstiger 2 mg / ml.
– Ulike metoder er beskrevet for å forberede emulsjonen. Alternative metoder som virvling for en time eller lydbehandling kan vurderes hvis dårlig emulgering regnes som possible feilkilde.
– Alder, kjønn, årstid og miljøforhold innenfor dyret anlegget er viktige faktorer som påvirker EAE mottakelighet. Det bør sikres at forholdene er sammenlignbare mellom uavhengige eksperimenter.
Som beskrevet ovenfor, kan den nevnte protokoll brukes som utgangspunkt for adoptive EAE eksperimenter. Denne modellen er spesielt egnet for separering av perifere og CNS-effekter av en genetisk fenotype (for eksempel ved å overføre encefalitogeniske knockout cellene inn i villtype mottaker mus) og for spesifikke immunologiske spørsmål som fenotypen av de overførte cellene kan karakteriseres grundig. Den siste utviklingen i EAE forskning i løpet av de siste årene er T celle reseptor transgene mus. Disse musene utvikler EAE symptomer spontant uten ytre påvirkning å omgå problemet med adjuvant inokulering. Imidlertid krever denne modellen store mengder dyr for breeding å sikre tilstrekkelige gruppe størrelser. Evaluering av knockout mus krever kryssing før EAE eksperimenter i motsetning til aEAE. Ettersom hver mus utvikler sykdom symptomer på en annen dag, kan evalueringen av nye stoffer være ganske komplisert. Derfor forblir verdien av klassisk aEAE for neuroimmunological uimotsagt.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av Interdisciplinary Center for Clinical Research (IZKF) Münster (SEED 03/12, SB).
Female C57BL/6 mice, age 10-12 weeks, ~20 g weight | e.g. Jackson Laboratory, Charles River | ||
MOG35-55 (MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK) | e.g. Pepceuticals Ltd | Store at -20°C | |
Incomplete Freund’s adjuvant (IFA) | e.g. Sigma-Aldrich Co. | F5506 | Store at 4 °C. |
Syringes, 1 ml with 26G3/8 needle | e.g. Becton Dickinson & Co. | 309625 | |
Syringes, 2 ml | e.g. B. Braun | 7389 | |
Needles, 25G5/8 and 30G1/2 | e.g. Becton Dickinson & Co., | 305122, 305106 | |
Three way halve | e.g. B. Braun | 16494 C | |
Pertussis toxin, lyophilized in buffer | Enzo Life Sciences Inc. | BML-G100 | Store at 4 °C. |
M. tuberculosis H37 RA | BD Difco | 231141 | Store at 4 °C. |