الكريات البيض في الدم والصفائح الدموية ويمكن أن تستخدم كعلامة للصحة الطاقة البيولوجية الشاملة للفرد وذلك لديها القدرة على رصد العمليات المرضية وتأثير العلاجات. نحن هنا تصف طريقة لعزل وقياس وظيفة الميتوكوندريا وانفجار التأكسدي في هذه الخلايا.
ومن المعروف ضعف الميتوكوندريا أن تلعب دورا هاما في عدد من الحالات المرضية مثل تصلب الشرايين، والسكري، والصدمة الإنتانية، والأمراض العصبية ولكن تقييم التغيرات في وظيفة الطاقة البيولوجية في المرضى الذين يعانون من التحدي. على الرغم من أن الأمراض مثل السكري أو تصلب الشرايين الحاضر سريريا مع ضعف الجهاز محددة، مكونات النظامية من الأمراض، مثل ارتفاع السكر في الدم أو التهاب، ويمكن تغيير وظيفة الطاقة البيولوجية في تعميم الكريات البيض أو الصفائح الدموية. وقد اعترف هذا المفهوم لبعض الوقت ولكن تم تقييد التطبيق على نطاق واسع من قبل عدد كبير من الخلايا الأولية اللازمة لتحليل الطاقة البيولوجية. وقد تم التغلب على هذا القيد من خلال الجمع بين التقنية خصوصية تقنيات حبة العزل المغناطيسي، وتقنيات التصاق الخلية، والتي تسمح للخلايا لضمها دون تفعيل لmicroplates، وحساسية من التكنولوجيات الجديدة مصممة للإنتاجية عالية هيئة التصنيع العسكريقياس التنفس roplate. مثال على هذه المعدات هو محلل تدفق خارج الخلية. يستخدم مثل هذه الأجهزة عادة الأكسجين ودرجة الحموضة تحقيقات حساسة لقياس معدلات التغير في هذه المعلمات في الخلايا الملتصقة، ومن ثم يمكن المتعلقة الأيض. نحن هنا من التفصيل الطرق لعزل وطلاء من وحيدات، الخلايا الليمفاوية، والعدلات والصفيحات، من دون تفعيل، من الدم البشري وتحليل وظيفة الميتوكوندريا الطاقة البيولوجية في هذه الخلايا. بالإضافة إلى ذلك، ونحن لشرح كيفية التأكسدي انفجر في وحيدات والعدلات ويمكن أيضا أن يقاس في نفس العينات. منذ استخدام هذه الأساليب فقط 8-20 مل دم الإنسان لديهم إمكانات لرصد الجيل أنواع الاكسجين التفاعلية والطاقة الحيوية في عملية إعداد سريرية.
مراقبة صحة الطاقة البيولوجية للخلايا المناعية (وحيدات، الخلايا الليمفاوية، العدلات) والصفائح الدموية من الدم وقد اعترف لبعض الوقت كأداة تشخيصية يمكن أن تكون مفيدة لتقييم صحة الطاقة البيولوجية الشاملة للفرد. هناك هيئة الناشئة الأدب وعزا عدد من الأمراض مثل السرطان وأمراض القلب والأوعية الدموية وأمراض الاعصاب لضعف الميتوكوندريا 1،2. هذا هو المهم سريريا منذ ضعف الميتوكوندريا يمكن الشروع في سلسلة من الأحداث الخلوية التي تعزز مسارات الإشارات الموالية للالتهابات أو تؤدي إلى موت الخلية. وتتميز العديد من الدراسات وظيفة الميتوكوندريا من الخلايا الدموية المحيطية وحيدات النوى والصفائح الدموية في ظروف مثل فيبروميالغيا، ومرض السكري، والصدمة الإنتانية، ومرض الزهايمر 3-7. على سبيل المثال، تقييم دراسة حديثة أن الطاقة الحيوية من الصفائح الدموية كعلامة من أجل وظيفة الميتوكوندريا وجدت أن الصفائح الدموية من النوع 2 DIABETقد المرضى جيم تقلص الميتوكوندريا 7،8 استهلاك الأوكسجين. من هذه النتائج وغيرها، فمن الواضح أن وحيدات، الخلايا الليمفاوية، العدلات، والصفائح الدموية يمكن أن تكون علامات بديلة وذلك اعتبارا من التغيرات في الطاقة الحيوية في ظل ظروف مرضية لأنها مسح جهاز الدورة الدموية ويمكن أن تعكس التغيرات الأيضية المحلية والعالمية. لتحديد ما إذا كان هذا النهج له قيمة النذير أو التشخيص طريقة إنتاجية عالية من التحليل وكان المطلوب هو طريقة متسقة لإعداد الخلية.
الأساليب لقياس وظيفة الميتوكوندريا في الكريات البيض والصفيحات الدموية وقد شاركت سابقا عزل الميتوكوندريا أو تقييم الطاقة الحيوية الخلوية في الخلايا سليمة 4،9. الاستفادة من تقييم الطاقة البيولوجية الخلوية باستخدام تدفق خارج الخلية (XF) محلل هو أن وظيفة الميتوكوندريا في الخلايا يمكن أن تنشأ مع ركائز الذاتية والمعلمات الجهاز التنفسي مثل تسرب بروتون والجهاز التنفسي القصوىيمكن تحديد القدرات. نحن وغيرنا قد استخدمت هذه التكنولوجيا لإظهار أن ملامح الطاقة البيولوجية في الصفائح الدموية، وحيدات الخلايا اللمفية المعزولة من الدم البشري يمكن أن تنشأ ومقارنة بين أنواع الخلايا 8. بالإضافة إلى ذلك، كل من العدلات وحيدات تمتلك قدرة التأكسدي في انفجار التي يتم تنشيطها oxidases NAPDH وتستهلك الأكسجين لتشكيل الفائق. الأهم من ذلك، هذا المسار هو عنصر أساسي من المناعة الفطرية والالتهابات الجهازية عن طريق التضمين. على سبيل المثال، فقد تبين أن ترتبط التغييرات في قدرة التأكسدي انفجار مع مختلف أمراض المناعة الذاتية مثل التصلب المتعدد، والتهاب المفاصل، والالتهابات المتكررة 10،11. حاليا لا توجد إنتاجية عالية المقايسات الكمية المتوفرة لقياس انفجار التأكسدي في العينات السريرية. هذا أمر مهم لأن تميز قدرة التأكسدي انفجار العدلات وحيدات قد تخدم أيضا كأداة تشخيصية هامة لعدة patholoخيس.
كانت التحديات التقنية الرئيسية انخفاض الحساسية لقياس استهلاك الأوكسجين باستخدام تقنيات تخطيط الاستقطاب التقليدية والحاجة إلى استخدام الخلايا المرفقة عند استخدام تقنيات صفيحة ميكروسكوبية فلوروميتريك أكثر حساسية. في هذا الفيديو عملية، ونحن تصف حل تقني لهذه المشاكل. نحن بالتفصيل الأساليب لعزل، والطلاء وقياس الطاقة الحيوية من وحيدات، الخلايا الليمفاوية، العدلات، والصفائح الدموية وانفجار التأكسدي من وحيدات والعدلات من الدم البشري، وهذا الأسلوب هو مناسبة لتقييم السريرية من الطاقة الحيوية والأكسدة انفجار للمحققين أن يكون الوصول إلى السكان المريض والقدرة على الحصول على عينات دماء جديدة.
يمثل هذا البروتوكول تجميع عدة تقنيات تستخدم عادة لعزل خلايا الدم بطريقة مناسبة لتحليل الطاقة الحيوية. تقنيات متجاورة قدمت هي مفيدة لأساليب العزل الأخرى (أي تحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية) لقدرتها على عزل أعداد كبيرة من الخلايا في ظروف وسائل الإعلام التي تسيطر عليها مع الحد الأدنى من الضغوط المفروضة على خلايا معزولة. فمن لديه عيب العزلة المطولة حتى مع الحد الأدنى من انقطاع. يخدم هذا البروتوكول كأساس لعزل خلايا الدم الأولية من بالكائن البشري، والتي يمكن استقراء في إعدادات السريرية والبحوث متعدية.
MACS الانفصال هو موثوق بها تقنية عزل الخلية التي توفر إمكانية عزل الخلايا مباشرة من الدم الكامل، ومع ذلك، يتطلب هذا الأسلوب كميات أكبر من الأجسام المضادة وليس الأمثل لعزل جميع أنواع الخلايا متميزة أربعة كما هو موضح في هذا الأسلوب. لديه هناك بالتابعين أي دليل لإثبات أن اختيار إيجابية من الكريات البيض التي كتبها نتائج الانفصال MACS في التنشيط باستخدام بروتوكول عزلتنا. الأعمدة MACS تعمل بواسطة امتصاص الخلايا المسمى في مجال مغناطيسي باستخدام الأجسام المضادة مترافق إلى 50 جزيئات مغنطيسية مسايرة فائقة superparamagnetic نانومتر. ثم يتم مزال الخلايا المسمى قبالة العمود. يتم تطبيق الاختيارات الإيجابية والسلبية في هذا البروتوكول لضمان العزلة السريع والنقاء. إذا تم الحصول على عدم كفاية أعداد الخلايا من العزلة أو النقاء هو في السؤال، وأكثر الأجسام المضادة يمكن أن تضاف إلى العينة وفقا لتعليمات البائع والمقطع الثاني من خلال العمود LS قد يؤدي إلى مزيد من النقاء (الجدول 2). وجدت لدينا مختبر نقاء عالية وكفاءة الطلاء باستخدام بروتوكول القائمة من خلال تحليل الايقاف الخلية النهائي عن طريق تحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية 8.
تحليل تدفق خارج الخلية لديها القدرة على رصد كل استهلاك الأوكسجين وتحمض وسائل الإعلام في الوقت الحقيقي على ذلك من بعد التمديدالأقطاب الكهربائية لها. استهلاك الأكسجين كما لوحظ من قبل استجابة التأكسدي انفجر في وحيدات والعدلات هو NADPH أوكسيديز تعتمد كما هو موضح عن طريق تثبيط مع DPI 8. شهدنا الوقت فقدان القدرة تعتمد في انفجار التأكسدي مع العزلة لفترات طويلة أو المقايسات XF الموسعة. وقد تم تصميم هذا البروتوكول وضعت للاستخدام على XF24 ولكن هو أيضا متوافقة مع XF96 في حوالي ثلث إلى نصف واحد من الخلية XF24 بذر الكثافة (الشكل 3).
في تصميم هذا البروتوكول، وكان مطلوبا الالتزام البروتوكولات القائمة لكل تقنية لتحقيق الأداء الأمثل مع التعديلات التي أدخلت فقط للسيطرة على الأوضاع وسائل الإعلام لتحليل الطاقة البيولوجية. بعد اتقان التقنيات، مثل بروتوكول يمكن استخدامها في مجموعة واسعة من التطبيقات والبحوث متعدية لقياس السمية أو فعالية استراتيجيات العلاج، واستكشاف الخصائص الأيضية من المرض، والإنتاج أكسدة بواسطة الوحيدات ونيوتrophils في حالات الالتهابات.
The authors have nothing to disclose.
فإن الكتاب أود أن أنوه بالمساهمة الفنية للجلوريا A بينافيدس. وأيد هذا العمل من قبل جمعية القلب الأمريكية 13PRE16390001 (SR)، NIH T32HL07918 (PAK)، NIH T32HL007457 (TM)، P30DK056336 (BKC)، مضاعفات السكري NIDDK اتحاد (DiaComp، www.diacomp.org) DK076169 منحة (subaward VDU)، ومركز اوبراين P30 DK079337 (VDU).
QuadroMACS Starting Kit incl. QuadroMACS Separator and MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-094-833 | |
CD235a (Glycophorin A) MicroBeads, human | Miltenyi Biotec | 130-050-501 | |
CD61 MicroBeads, human for platelets | Miltenyi Biotec | 130-051-101 | |
CD14 MicroBeads, human for monocytes | Miltenyi Biotec | 130-050-201 | |
CD15 MicroBeads, human for granulocytes | Miltenyi Biotec | 130-046-601 | |
LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
BD Vacutainer ACD Blood collection tubes | Fisher | 02-684-26 | |
RPMI 1640 | Gibco | 11835-030 | with L-glutamine and without phenol red |
Prostaglandin I2, sodium salt | Cayman | 18220 | |
1.5 ml semi-micro cuvettes | Phenix Research Products | SC-2410 | |
Histopaque density gradient, specific gravity 1.077 | Sigma | 10771 | |
Histopaque density gradient, specific gravity 1.119 | Sigma | 11191 | |
Bovine Serum Albumin Fraction V | Roche | 3117405001 | fatty-acid ultra-free |
Phorbol 12-myristate 13-acetate | Sigma | P8139 | |
XF24 FluxPak | Seahorse Biosciences | 100850-001 | |
DMEM | Fisher | MT90113PB | w/o Glucose, L-Glutamine, Pyruvate, Phenol Red, and Bicarbonate |
L-Glutamine, 200mM (100x) | Invitrogen | 25030-081 | |
D-Glucose | Sigma | G7528 | |
Sodium Pyruvate | Sigma | P8574 | |
Cell-Tak (cell adhesive) | BD Biosciences | CB-40242 | |
Oligomycin | Sigma | O4876 | |
Antimycin A | Sigma | A8674 | |
(FCCP) Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone | Sigma | C-2920 | |
DC Protein Assay Reagent A | Bio-Rad | 500-0113 | |
DC Protein Assay Reagent S | Bio-Rad | 500-0015 | |
DC Protein Assay Reagent B | Bio-Rad | 500-0114 | |
Equipment | Vendor | Product # | Comments/Description |
Seahorse | Seahorse Biosciences | ||
QuadroMACS Separator and MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-090-976 and 24039 | |
Spectrophotometer |