Leucociti e piastrine può essere utilizzato come marcatore bioenergetico di salute generale di un individuo e quindi hanno il potenziale per controllare i processi patologici e l'impatto dei trattamenti. Qui si descrive un metodo per isolare e misurare la funzione mitocondriale e il burst ossidativo in queste cellule.
Disfunzione mitocondriale è conosciuto per svolgere un ruolo significativo in un certo numero di condizioni patologiche come l'aterosclerosi, diabete, shock settico, e malattie neurodegenerative ma valutare cambiamenti nella funzione bioenergetica nei pazienti è impegnativo. Anche se le malattie come il diabete o aterosclerosi presente clinicamente con insufficienza organo specifico, i componenti sistemici della patologia, come iperglicemia o infiammazione, possono alterare la funzione bioenergetica nei leucociti o piastrine circolanti. Questo concetto è stato riconosciuto da tempo, ma la sua applicazione diffusa è stata vincolata dal gran numero di cellule primarie necessarie per l'analisi bioenergetica. Questa limitazione tecnica è stata superata combinando la specificità delle tecniche di isolamento del branello magnetici, tecniche di adesione cellulare, che consentono alle cellule da allegare senza attivazione per micropiastre, e la sensibilità di nuove tecnologie progettata per elevate velocità micrespirometria roplate. Un esempio di questa apparecchiatura è l'analizzatore di flusso extracellulare. Tale strumentazione utilizza tipicamente ossigeno e pH sonde sensibili per misurare i tassi di variazione di tali parametri in cellule aderenti, che possono poi essere riportate metabolismo. Qui ci dettaglio i metodi per l'isolamento e la placcatura dei monociti, linfociti, neutrofili e delle piastrine, senza attivazione, dal sangue umano e l'analisi della funzione mitocondriale bioenergetica in queste cellule. Inoltre, si dimostra come il burst ossidativo nei monociti e neutrofili può essere misurato stessi campioni. Dal momento che questi metodi utilizzano solo 8-20 ml di sangue umano hanno il potenziale per monitorare la generazione di specie reattive dell'ossigeno e bioenergetica in un ambiente clinico.
Monitoraggio della salute bioenergetica di cellule immunitarie (monociti, linfociti, neutrofili) e delle piastrine da sangue è stato riconosciuto da tempo come strumento diagnostico potenzialmente utile per valutare la salute bioenergetico generale di un individuo. C'è una emergente di letteratura attribuire una serie di malattie come il cancro, malattie cardiovascolari e malattie neurodegenerative a disfunzione mitocondriale 1,2. Questo è clinicamente importante poiché disfunzione mitocondriale può avviare una serie di eventi cellulari che promuovono vie di segnalazione pro-infiammatorie o portano alla morte cellulare. Diversi studi hanno caratterizzato funzione mitocondriale di cellule mononucleate del sangue periferico e piastrine in condizioni come fibromialgia, diabete, shock settico, e il morbo di Alzheimer 3-7. Ad esempio, un recente studio ha valutato bioenergetica di piastrine come marker per la funzione mitocondriale e trovato che le piastrine di tipo 2 Diabetpazienti ic avevano diminuito il consumo di ossigeno mitocondriale 7,8. Da questi risultati e altri, è chiaro che i monociti, linfociti, neutrofili e piastrine possono servire come marcatori surrogati dei cambiamenti nella bioenergetica in condizioni patologiche, poiché sondaggio la circolazione sistemica e possono riflettere cambiamenti metabolici locali e globali. Per determinare se questo approccio ha un metodo elevato throughput di analisi e è necessario un metodo coerente per la preparazione di cellule valore prognostico e diagnostico.
I metodi per misurare la funzione mitocondriale nei leucociti e piastrine hanno già coinvolto l'isolamento dei mitocondri o la valutazione di bioenergetica cellulare in cellule intatte 4,9. Il vantaggio di valutazione bioenergetica cellulare utilizzando un flusso extracellulare (XF) analizzatore è che la funzione mitocondriale nelle cellule può essere stabilita con substrati endogeni e parametri respiratori come perdita protonica e respiratoria massimacapacità può essere determinato. Noi e altri abbiamo utilizzato questa tecnologia per mostrare che i profili bioenergetici in piastrine, linfociti e monociti isolati da sangue umano possono essere stabiliti e confrontati tra i tipi di cellule 8. Inoltre, entrambi i neutrofili e monociti possiedono una capacità ossidativa scoppio in cui ossidasi NADPH vengono attivati e consumano ossigeno per formare superossido. È importante sottolineare che questo percorso è un componente chiave dell'immunità innata ed è modulata da infiammazione sistemica. Ad esempio, è stato dimostrato che i cambiamenti nella capacità burst ossidativo sono associati a varie malattie autoimmuni come la sclerosi multipla, l'artrite e infezioni ricorrenti 10,11. Attualmente non ci sono high throughput analisi quantitative disponibili per misurare il burst ossidativo in campioni clinici. Questo è importante in quanto caratterizza la capacità ossidativa scoppio di neutrofili e monociti può anche servire come un importante strumento diagnostico per vari patologici eseguitiGies.
Le sfide tecniche sono bassa sensibilità per la misura del consumo di ossigeno utilizzando tecniche convenzionali polarografiche e la necessità di utilizzare cellule attaccate quando si utilizzano tecniche di micropiastre fluorimetrica più sensibili. In questo video pratico, descriviamo la soluzione tecnica a questi problemi. Abbiamo dettagliatamente i metodi per l'isolamento, la placcatura e la misura di bioenergetica di monociti, linfociti, neutrofili e piastrine e il burst ossidativo dei monociti e neutrofili dal sangue umano. Questo metodo è adatto per la valutazione clinica della bioenergetica e burst ossidativo per gli investigatori che hanno accesso a una popolazione di pazienti e la capacità di ottenere campioni di sangue fresco.
Questo protocollo rappresenta la compilazione di varie tecniche comunemente utilizzate per l'isolamento delle cellule del sangue in modo adeguato per l'analisi bioenergetica. Le tecniche presentate contigui sono vantaggiose per altri metodi di isolamento (cioè analisi FACS) per la loro capacità di isolare gran numero di cellule in condizioni controllate di media con sollecitazioni minime poste sulle cellule isolate. Ha lo svantaggio di isolamenti lunghi anche con interruzioni minime. Questo protocollo serve come base per l'isolamento di cellule del sangue primari da soggetti umani, che possono essere estrapolate in ambito clinico e ricerca traslazionale.
Separazione MACS è una tecnica di isolamento cellulare affidabile che offre la possibilità di isolare cellule direttamente dal sangue intero, tuttavia, questo metodo richiede una maggiore quantità di anticorpo e non è ottimale per l'isolamento di tutti e quattro i tipi cellulari distinti come descritto in questo metodo. Ci deve bEEN alcuna prova per dimostrare che la selezione positiva dei leucociti da MACS separazione è il risultato di attivazione utilizzando il nostro protocollo di isolamento. Colonne MACS funzione sequestro di cellule marcate in un campo magnetico utilizzando anticorpi coniugati a 50 particelle superparamagnetiche nm. Cellule marcate vengono poi eluiti largo della colonna. Selezioni positivi e negativi sono implementate in questo protocollo per garantire l'isolamento rapido e purezza. Se il numero di cellule inadeguati sono ottenuti dall'isolamento o purezza è in questione, più anticorpi possono essere aggiunti al campione secondo le istruzioni del fornitore e secondo passaggio attraverso la colonna LS può provocare una maggiore purezza (Tabella 2). Il nostro laboratorio pensa elevata purezza ed efficienza placcatura utilizzando il protocollo esistente analizzando sospensioni cellulari finali mediante analisi FACS 8.
Analizzatori di flusso extracellulari hanno la possibilità di monitorare sia il consumo di ossigeno e mezzi di acidificazione in tempo reale su quello di oti suoi elettrodi. Il consumo di ossigeno come osservato dalla risposta burst ossidativo nei monociti e neutrofili è NADPH ossidasi dipendente, come dimostrato da inibizione DPI 8. Abbiamo visto una perdita di tempo dipendente dalla capacità burst ossidativo con isolamenti prolungati o dosaggi XF estesi. Questo protocollo è stato progettato e sviluppato per l'uso sul XF24 ma è anche compatibile con il XF96 a circa un terzo alla metà della cella XF24 semina densità (Figura 3).
Nella progettazione di questo protocollo, l'aderenza ai protocolli esistenti per ogni tecnica è stato richiesto per prestazioni ottimali con le modifiche apportate unicamente a controllare le condizioni di media per l'analisi bioenergetica. Dopo tecniche di masterizzazione, un tale protocollo può essere utilizzato in una vasta gamma di applicazioni traslazionale e per misurare la tossicità o l'efficacia di strategie di trattamento, esplorare caratteristiche metaboliche della malattia, e la produzione ossidante da monociti e neutrophils in condizioni infiammatorie.
The authors have nothing to disclose.
Gli autori desiderano ringraziare per il contributo tecnico di Gloria A Benavides. Questo lavoro è stato sostenuto da American Heart Association 13PRE16390001 (SR), NIH T32HL07918 (PAK), NIH T32HL007457 (TM), P30DK056336 (BKC), Complicazioni NIDDK diabetici Consortium (DiaComp, www.diacomp.org) DK076169 concessione (subaward VDU), e il P30 DK079337 O'Brien Center (VDU).
QuadroMACS Starting Kit incl. QuadroMACS Separator and MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-094-833 | |
CD235a (Glycophorin A) MicroBeads, human | Miltenyi Biotec | 130-050-501 | |
CD61 MicroBeads, human for platelets | Miltenyi Biotec | 130-051-101 | |
CD14 MicroBeads, human for monocytes | Miltenyi Biotec | 130-050-201 | |
CD15 MicroBeads, human for granulocytes | Miltenyi Biotec | 130-046-601 | |
LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
BD Vacutainer ACD Blood collection tubes | Fisher | 02-684-26 | |
RPMI 1640 | Gibco | 11835-030 | with L-glutamine and without phenol red |
Prostaglandin I2, sodium salt | Cayman | 18220 | |
1.5 ml semi-micro cuvettes | Phenix Research Products | SC-2410 | |
Histopaque density gradient, specific gravity 1.077 | Sigma | 10771 | |
Histopaque density gradient, specific gravity 1.119 | Sigma | 11191 | |
Bovine Serum Albumin Fraction V | Roche | 3117405001 | fatty-acid ultra-free |
Phorbol 12-myristate 13-acetate | Sigma | P8139 | |
XF24 FluxPak | Seahorse Biosciences | 100850-001 | |
DMEM | Fisher | MT90113PB | w/o Glucose, L-Glutamine, Pyruvate, Phenol Red, and Bicarbonate |
L-Glutamine, 200mM (100x) | Invitrogen | 25030-081 | |
D-Glucose | Sigma | G7528 | |
Sodium Pyruvate | Sigma | P8574 | |
Cell-Tak (cell adhesive) | BD Biosciences | CB-40242 | |
Oligomycin | Sigma | O4876 | |
Antimycin A | Sigma | A8674 | |
(FCCP) Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone | Sigma | C-2920 | |
DC Protein Assay Reagent A | Bio-Rad | 500-0113 | |
DC Protein Assay Reagent S | Bio-Rad | 500-0015 | |
DC Protein Assay Reagent B | Bio-Rad | 500-0114 | |
Equipment | Vendor | Product # | Comments/Description |
Seahorse | Seahorse Biosciences | ||
QuadroMACS Separator and MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-090-976 and 24039 | |
Spectrophotometer |