Blod leukocyter och trombocyter kan användas som markör för allmänna bioenergetiska hälsan hos en individ och så har potential att övervaka patologiska processer och effekten av behandlingarna. Här beskriver vi en metod för att isolera och mäta mitokondriefunktion och oxidativt utbrott i dessa celler.
Mitokondriell dysfunktion är känt för att spela en betydande roll i ett antal patologiska tillstånd såsom åderförkalkning, diabetes, septisk chock, och neurodegenerativa sjukdomar, men att bedöma förändringar i bioenergetisk funktionen hos patienter är utmanande. Även sjukdomar som diabetes eller åderförkalkning närvarande kliniskt med specifik organfunktion, de systemiska komponenter i patologi, såsom hyperglykemi eller inflammation, kan förändra bioenergetiska funktion i cirkulerande leukocyter eller trombocyter. Detta koncept har erkänts under en tid, men dess utbredda tillämpning har begränsats av det stora antalet primära celler som behövs för bioenergetisk analys. Denna tekniska begränsning har övervunnits genom att kombinera den särskilda karaktären hos de magnetiska pärla isoleringstekniker, cellvidhäftningsteknik, som gör att celler som skall fästas utan aktivering till mikroplattor, och känsligheten för ny teknik utformad för hög genomströmning microplate respiration. Ett exempel på denna utrustning är den extracellulära flux analysatorn. Sådana instrument används vanligtvis syre och pH-känsliga sonder för att mäta förändringstakt i dessa parametrar i vidhäftande celler, som sedan kan relateras till ämnesomsättningen. Här är vi i detalj de metoder för isolering och plätering av monocyter, lymfocyter, neutrofiler och trombocyter, utan aktivering, från humant blod och analysen av mitokondrie bioenergetisk funktion i dessa celler. Dessutom visar vi hur den oxidativa brast i monocyter och neutrofiler kan också mätas i samma prover. Eftersom dessa metoder använder bara 8-20 ml blod de har potential för övervakning av reaktiva syreradikaler generation och bioenergetik i en klinisk miljö.
Övervakning bioenergetiska hälsan av immunceller (monocyter, lymfocyter, neutrofiler) och blodplättar från blod har erkänts under en tid som ett potentiellt användbart diagnostiskt verktyg för att bedöma den totala bioenergetiska hälsa hos en individ. Det finns en växande mängd litteratur tillskriva en rad sjukdomar som cancer, hjärt-och kärlsjukdomar och neurodegenerativa sjukdomar till mitokondriell dysfunktion 1,2. Detta är kliniskt viktigt eftersom mitokondriell dysfunktion kan initiera en serie av cellulära händelser som främjar pro-inflammatoriska signalvägar eller leder till celldöd. Flera studier har karaktäriserat mitokondriell funktion av perifera mononukleära blodkroppar och blodplättar i tillstånd såsom fibromyalgi, diabetes, septisk chock, och Alzheimers sjukdom 3-7. Till exempel, utvärderade en ny studie av bioenergetik trombocyter som markör för mitokondriefunktion och funnit att trombocyter från typ 2 diabetIC patienter hade minskat mitokondrie syreförbrukning 7,8. Från dessa iakttagelser och andra, är det tydligt att monocyter, lymfocyter, neutrofiler och trombocyter kan fungera som surrogatmarkörer för förändringar i bioenergetik i sjukdomstillstånd, eftersom de kartlägga kretsloppet och kan återspegla lokala och globala metabola förändringar. För att avgöra om detta tillvägagångssätt har prognostiskt eller diagnostiskt värde en hög genomströmning metod för analys och det krävs en konsekvent metod för förberedelse cell.
Metoderna för att mäta mitokondriefunktion i leukocyter och trombocyter har tidigare involverat isolering av mitokondrier eller bedömning av cellulära bioenergetik i intakta celler 4,9. Fördelen med cellulära bioenergetisk bedömning med hjälp av ett extracellulärt flöde (XF) Analysatorn är att den mitokondriefunktion i celler kan fastställas med endogena substrat och respiratoriska parametrar som proton läcka och maximal andningskapacitet kan bestämmas. Vi och andra har använt denna teknik för att visa att bioenergetiska profiler i trombocyter, kan monocyter och lymfocyter som isolerats från humant blod fastställas och jämföras mellan celltyper 8. Dessutom har både neutrofiler och monocyter har en oxidativ burst egenskap i vilken NAPDH oxidaser är aktiverade och förbrukar syre till att bilda superoxid. Viktigt är denna väg en viktig del av medfödd immunitet och moduleras av systemisk inflammation. Till exempel har det visat sig att förändringar i den oxidativa sprängnings kapacitet är associerade med olika autoimmuna sjukdomar, såsom multipel skleros, artrit, och återkommande infektioner 10,11. För närvarande finns inga hög genomströmning kvantitativa analyser tillgängliga för att mäta den oxidativt utbrott i kliniska prover. Detta är viktigt eftersom att karakterisera den oxidativa sprängnings kapacitet av neutrofiler och monocyter kan också tjäna som ett viktigt diagnostiskt verktyg för flera pathologier.
De viktigaste tekniska utmaningar har låg känslighet för mätning av syreförbrukning genom användning av konventionella polarografiska tekniker och behovet av att använda vidhäftade celler vid användning av mer känsliga mikro fluorometriska tekniker. I den här praktiska video beskriver vi den tekniska lösningen på dessa problem. Vi detalj de metoder för isolering, plätering och mätning av bioenergetik av monocyter, lymfocyter, neutrofiler och trombocyter och den oxidativa explosion av monocyter och neutrofiler från humant blod. Denna metod är lämplig för klinisk bedömning av bioenergetik och oxidativ burst för utredare som har tillgång till en patientgrupp och förmågan att skaffa nya blodprover.
Detta protokoll utgör en sammanställning av flera gemensamt utnyttjade tekniker för blodcellisolering på ett sätt som lämpar sig för bioenergetik analys. De angränsande tekniker som presenteras är fördelaktiga för andra isoleringsmetoder (dvs. FACS-analys) för sin förmåga att isolera ett stort antal celler i kontrollerade medier förhållanden med minimala påfrestningar som ställs på de isolerade cellerna. Den har nackdelen av långa isoleringar även med minimala avbrott. Detta protokoll utgör grunden för isolering av primära blodceller från människa, som kan extrapoleras in i kliniska inställningar och translationell forskning.
MACS separation är en tillförlitlig cell isoleringsteknik som erbjuder möjligheten att isolera celler direkt från helblod, dock kräver denna metod större mängder av antikroppen och är inte optimal för isolering av alla fyra distinkta celltyper som beskrivs i denna metod. Det har been inga bevis för att visa att det positiva urvalet av leukocyter från MACS separation resulterar i aktivering med hjälp av vår isolering protokoll. MACS-kolonner fungera genom sekvestrering av märkta celler i ett magnetiskt fält med användning av antikroppar konjugerade till 50 nm superparamagnetiska partiklar. Märkta celler elueras därefter från kolonnen. Positiva och negativa val genomförs i detta protokoll för att säkerställa snabb isolering och renhet. Om otillräckliga cell nummer erhålls från isolering eller renhet är i fråga, kan fler antikroppar sättas till provet enligt leverantörens instruktioner och andra passage genom LS kolumnen kan leda till större renhet (tabell 2). Vårt laboratorium fann hög renhet och plätering effektivitet med hjälp av befintliga protokollet genom att analysera slut cellsuspensioner genom FACS-analys 8.
Cellulära flux analysatorer har förmågan att övervaka både syreförbrukning och media försurning i realtid över den för othennes elektroder. Den syreförbrukning som observeras av oxidativ burst svar i monocyter och neutrofiler är NADPH-oxidas beroende vilket framgår av hämning med DPI 8. Vi har sett en beroende förlust tid i oxidativ burst kapacitet med långa isoleringar eller utvidgade XF-analyser. Detta protokoll har utformats och utvecklats för användning på XF24 men är också förenligt med den XF96 vid ungefär en tredjedel till en halv av den XF24 cell seeding densiteter (Figur 3).
I utformningen av detta protokoll, har anslutning till befintliga protokoll för varje teknik som krävs för optimal prestanda med ändringar som gjorts enbart för att styra media förutsättningar för bioenergetisk analys. Efter mastering tekniker, kan ett sådant protokoll kan användas i ett brett spektrum av translationell och forskningsansökningar för att mäta toxicitet eller effektiva behandlingsstrategier, utforska metaboliska egenskaper sjukdom och oxidationsmedel produktion av monocyter och neutrophils i inflammatoriska tillstånd.
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka för det tekniska bidraget av Gloria A Benavides. Detta arbete stöddes av American Heart Association 13PRE16390001 (SR), NIH T32HL07918 (PAK), NIH T32HL007457 (TM), P30DK056336 (BKC), NIDDK diabeteskomplikationer Consortium (DiaComp, www.diacomp.org) bevilja DK076169 (subaward VDU), och O'Brien Center P30 DK079337 (bildskärm).
QuadroMACS Starting Kit incl. QuadroMACS Separator and MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-094-833 | |
CD235a (Glycophorin A) MicroBeads, human | Miltenyi Biotec | 130-050-501 | |
CD61 MicroBeads, human for platelets | Miltenyi Biotec | 130-051-101 | |
CD14 MicroBeads, human for monocytes | Miltenyi Biotec | 130-050-201 | |
CD15 MicroBeads, human for granulocytes | Miltenyi Biotec | 130-046-601 | |
LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
BD Vacutainer ACD Blood collection tubes | Fisher | 02-684-26 | |
RPMI 1640 | Gibco | 11835-030 | with L-glutamine and without phenol red |
Prostaglandin I2, sodium salt | Cayman | 18220 | |
1.5 ml semi-micro cuvettes | Phenix Research Products | SC-2410 | |
Histopaque density gradient, specific gravity 1.077 | Sigma | 10771 | |
Histopaque density gradient, specific gravity 1.119 | Sigma | 11191 | |
Bovine Serum Albumin Fraction V | Roche | 3117405001 | fatty-acid ultra-free |
Phorbol 12-myristate 13-acetate | Sigma | P8139 | |
XF24 FluxPak | Seahorse Biosciences | 100850-001 | |
DMEM | Fisher | MT90113PB | w/o Glucose, L-Glutamine, Pyruvate, Phenol Red, and Bicarbonate |
L-Glutamine, 200mM (100x) | Invitrogen | 25030-081 | |
D-Glucose | Sigma | G7528 | |
Sodium Pyruvate | Sigma | P8574 | |
Cell-Tak (cell adhesive) | BD Biosciences | CB-40242 | |
Oligomycin | Sigma | O4876 | |
Antimycin A | Sigma | A8674 | |
(FCCP) Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone | Sigma | C-2920 | |
DC Protein Assay Reagent A | Bio-Rad | 500-0113 | |
DC Protein Assay Reagent S | Bio-Rad | 500-0015 | |
DC Protein Assay Reagent B | Bio-Rad | 500-0114 | |
Equipment | Vendor | Product # | Comments/Description |
Seahorse | Seahorse Biosciences | ||
QuadroMACS Separator and MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-090-976 and 24039 | |
Spectrophotometer |