Blod leukocytter og blodplader kan anvendes som en markør for samlede bioenergetic sundhed af en person og så har potentiale til at overvåge patologiske processer og virkningen af behandlinger. Her beskriver vi en fremgangsmåde til at isolere og måle mitokondriefunktionen og oxidative burst i disse celler.
Mitokondriel dysfunktion vides at spille en væsentlig rolle i en række patologiske tilstande, såsom atherosklerose, diabetes, septisk chok, og neurodegenerative sygdomme, men at vurdere ændringer i bioenergetic funktion i patienter er udfordrende. Selv om sygdomme såsom diabetes eller åreforkalkning foreliggende klinisk specifikke organsvækkelse den systemiske komponenter i patologi, såsom hyperglykæmi eller inflammation, kan ændre bioenergetic funktion i cirkulerende leukocytter eller trombocytter. Dette koncept er blevet anerkendt i nogen tid, men dens udbredte anvendelse er begrænset af det store antal af primære celler er nødvendige for bioenergetic analyse. Denne tekniske begrænsning er blevet overvundet ved at kombinere specificiteten af de magnetiske perle isolation teknikker, celleadhæsions teknikker, som tillader celler, der skal fastgøres uden aktivering til mikroplader, og følsomheden af nye teknologier designet til high throughput mikrofonroplate respirometri. Et eksempel på dette udstyr er det ekstracellulære flux analysatoren. Sådanne instrumenter bruger typisk oxygen-og pH-følsomme prober til at måle ændringer i disse parametre i adhærente celler, som kan derefter blive relateret til metabolisme. Her har vi detaljeret metoder til isolering og plettering af monocytter, lymfocytter, neutrofile og blodplader, uden aktivering, fra humant blod og analyse af mitokondrie bioenergetic funktion i disse celler. Derudover viser vi, hvordan den oxidative burst i monocytter og neutrofile kan også måles i de samme prøver. Da disse metoder bruger kun 8-20 ml humant blod, de har potentiale til overvågning af reaktive oxygenformer generering og bioenergetik i et klinisk miljø.
Overvågning bioenergetic sundhed immunceller (monocytter, lymfocytter, neutrofile) og blodplader fra blod er blevet anerkendt i nogen tid som et potentielt nyttigt diagnostisk redskab til at vurdere den samlede bioenergetic sundhed af en person. Der er en spirende mængde litteratur tilskrive en række sygdomme som kræft, hjerte-kar-sygdomme og neurodegenerative sygdomme til mitokondriedysfunktion 1,2. Det er klinisk vigtige, idet mitokondriel dysfunktion kan iværksætte en række cellulære begivenheder, der fremmer pro-inflammatoriske signalveje eller føre til celledød. Adskillige undersøgelser har karakteriseret mitokondriefunktion af perifere mononukleære blodceller og blodplader i forhold såsom fibromyalgi, diabetes, septisk chok, og Alzheimers sygdom 3-7. For eksempel en nylig undersøgelse evaluerede bioenergetik blodplader som en markør for mitokondriefunktionen og fandt, at blodplader fra Type 2 Diabetic patienterne havde formindsket mitokondrie iltforbrug 7,8. Fra disse resultater og andre, er det klart, at monocytter, lymfocytter, neutrofiler og blodplader kan tjene som surrogatmarkører af ændringer i bioenergetik under patologiske tilstande, idet de kortlægge den systemiske cirkulation og kan afspejle lokale og globale metaboliske ændringer. At afgøre, om denne fremgangsmåde har prognostisk eller diagnostisk værdi en high throughput analysemetode og en ensartet metode til forberedelse celle er nødvendig.
De metoder til at måle mitokondriefunktionen i leukocytter og blodplader har tidligere involveret isolering af mitokondrier eller vurdering af cellulære bioenergetik i intakte celler 4,9. Fordelen ved cellulære bioenergetic vurdering ved hjælp af en ekstracellulær flux (XF) Analysatoren at mitokondriefunktionen i celler kan etableres med endogene substrater og respiratoriske parametre såsom proton lækage og maksimal respiratoriskkapacitet kan bestemmes. Vi og andre har brugt denne teknologi til at vise, at bioenergetic profiler i blodplader, kan etableres monocytter og lymfocytter isoleret fra humant blod og sammenlignet blandt celletyper 8. Desuden har begge neutrofile og monocytter besidder en oxidativ burst i hvilken egenskab NAPDH oxidaser aktiveres og forbruge ilt til at danne superoxid. Vigtigere er det, denne vej er en vigtig del af medfødt immunitet og moduleres af systemisk inflammation. For eksempel er det blevet vist, at ændringer i den oxidative burst kapacitet er forbundet med forskellige autoimmune sygdomme, såsom multipel sklerose, arthritis og tilbagevendende infektioner 10,11. I øjeblikket er der ingen høj kapacitet kvantitative analyser rådighed til at måle oxidative burst i kliniske prøver. Dette er vigtigt, da karakterisere den oxidative burst kapacitet af neutrofiler og monocytter kan også tjene som et vigtigt diagnostisk redskab for flere pathologier.
De vigtigste tekniske udfordringer har været lav følsomhed til måling af ilt forbrug ved hjælp af konventionelle polarografiske teknikker og behovet for at bruge vedhæftede celler, når du bruger mere følsomme mikroplade fluorometrisk teknikker. I denne praktiske video beskriver vi den tekniske løsning på disse problemer. Vi detalje metoder til isolering, plating og måling af bioenergetik af monocytter, lymfocytter, neutrofile og blodplader og den oxidative burst af monocytter og neutrofile fra humant blod. Denne metode er velegnet til klinisk vurdering af bioenergetik og oxidativ burst for efterforskerne, der har adgang til en patientpopulation, og evnen til at opnå nye blodprøver.
Denne protokol udgør kompilationen af flere almindeligt anvendte teknikker til blodlegemer isolation på en måde egnet til bioenergetik analyse. De sammenhængende, der præsenteres, er fordelagtige til andre isoleringsmetoder (dvs. FACS-analyse) for deres evne til at isolere et stort antal celler i kontrollerede medier vejrforhold med minimale spændinger placeret på de isolerede celler. Det har den ulempe, at langvarige isolationer selv med minimale afbrydelser. Denne protokol tjener som grundlag for isolering af primære blodceller fra mennesker, der kan ekstrapoleres til kliniske indstillinger og translationel forskning.
MACS separation er en pålidelig celleisolering teknik, der giver mulighed for at isolere celler direkte fra fuldblod, men denne metode kræver større mængder af antistof og er ikke optimal til isolering af alle fire forskellige celletyper som beskrevet i denne metode. Der har bEen ingen beviser for, at den positive udvælgelse af leukocytter ved MACS separation resulterer i aktivering ved hjælp af vores isolation protokol. MACS kolonner fungerer ved binding af mærkede celler i et magnetisk felt under anvendelse af antistoffer konjugeret til 50 nm superparamagnetiske partikler. Mærkede celler elueres derefter fra søjlen. Positive og negative markeringer er implementeret i denne protokol for at sikre hurtig isolation og renhed. Hvis utilstrækkelige celleantal fås fra isolation eller renhed er i spørgsmålet, kan flere antistoffer tilsættes til prøven, som pr sælgers instruktion og anden passage gennem LS kolonne kan resultere i større renhed (tabel 2). Vores laboratorium fundet høj renhed og udpladningseffektivitet brug af den eksisterende protokol ved at analysere de endelige cellesuspensioner ved FACS-analyse 8.
Ekstracellulære flux analysatorer har evnen til at overvåge både iltforbrug og medier forsuring i realtid via det af othendes elektroder. Forbruget ilt som observeret af oxidative burst respons i monocytter og neutrofile er NADPH oxidase afhængig som vist ved hæmning med DPI 8. Vi har set en tidsafhængig tab i oxidative burst kapacitet med langvarige isolationer eller udvidede XF assays. Denne protokol blev designet og udviklet til brug på XF24 men er også kompatibel med XF96 på cirka en tredjedel til halvdelen af XF24 cellepodning tætheder (figur 3).
I design af denne protokol, blev tilslutning til eksisterende protokoller for hver teknik er nødvendig for optimal ydeevne med lavet udelukkende for at styre medieforhold for bioenergetic analyse ændringer. Efter mastering teknikker, kan en sådan protokol skal anvendes i en bred vifte af translationelle og forskning applikationer til at måle toksicitet eller effektiviteten af behandlingsstrategier, udforske metaboliske karakteristika af sygdom, og oxidant produktion af monocyt og neutrophils i inflammatoriske tilstande.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne anerkende det tekniske bidrag af Gloria A Benavides. Dette arbejde blev støttet af American Heart Association 13PRE16390001 (SR), NIH T32HL07918 (PAK), NIH T32HL007457 (TM), P30DK056336 (BKC), NIDDK diabetiske komplikationer Consortium (DiaComp, www.diacomp.org) tilskud DK076169 (subaward VDU) og O'Brien center P30 DK079337 (skærmarbejde).
QuadroMACS Starting Kit incl. QuadroMACS Separator and MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-094-833 | |
CD235a (Glycophorin A) MicroBeads, human | Miltenyi Biotec | 130-050-501 | |
CD61 MicroBeads, human for platelets | Miltenyi Biotec | 130-051-101 | |
CD14 MicroBeads, human for monocytes | Miltenyi Biotec | 130-050-201 | |
CD15 MicroBeads, human for granulocytes | Miltenyi Biotec | 130-046-601 | |
LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
BD Vacutainer ACD Blood collection tubes | Fisher | 02-684-26 | |
RPMI 1640 | Gibco | 11835-030 | with L-glutamine and without phenol red |
Prostaglandin I2, sodium salt | Cayman | 18220 | |
1.5 ml semi-micro cuvettes | Phenix Research Products | SC-2410 | |
Histopaque density gradient, specific gravity 1.077 | Sigma | 10771 | |
Histopaque density gradient, specific gravity 1.119 | Sigma | 11191 | |
Bovine Serum Albumin Fraction V | Roche | 3117405001 | fatty-acid ultra-free |
Phorbol 12-myristate 13-acetate | Sigma | P8139 | |
XF24 FluxPak | Seahorse Biosciences | 100850-001 | |
DMEM | Fisher | MT90113PB | w/o Glucose, L-Glutamine, Pyruvate, Phenol Red, and Bicarbonate |
L-Glutamine, 200mM (100x) | Invitrogen | 25030-081 | |
D-Glucose | Sigma | G7528 | |
Sodium Pyruvate | Sigma | P8574 | |
Cell-Tak (cell adhesive) | BD Biosciences | CB-40242 | |
Oligomycin | Sigma | O4876 | |
Antimycin A | Sigma | A8674 | |
(FCCP) Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone | Sigma | C-2920 | |
DC Protein Assay Reagent A | Bio-Rad | 500-0113 | |
DC Protein Assay Reagent S | Bio-Rad | 500-0015 | |
DC Protein Assay Reagent B | Bio-Rad | 500-0114 | |
Equipment | Vendor | Product # | Comments/Description |
Seahorse | Seahorse Biosciences | ||
QuadroMACS Separator and MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-090-976 and 24039 | |
Spectrophotometer |