Bloed leukocyten en bloedplaatjes kunnen worden gebruikt als een marker van algemene bio-energetische gezondheid van een individu en dus de potentie om pathologische processen en het effect van behandeling te controleren. Hier beschrijven we een werkwijze voor het isoleren en meten mitochondriale functie en de oxidatieve uitbarsting in deze cellen.
Mitochondriale dysfunctie is bekend een belangrijke rol in een aantal pathologische aandoeningen zoals atherosclerose, diabetes, septische shock, en neurodegeneratieve ziekten, maar om veranderingen in de bio-energetische functie bij patiënten uitdaging. Hoewel ziekten zoals diabetes of atherosclerose onderhavige klinisch specifieke orgaan stoornis, de systemische onderdelen van de pathologie, zoals hyperglycemie of ontsteking, kan bio-energetische kunnen veranderen in circulerende leukocyten en trombocyten. Dit concept is enige tijd bekend, maar de wijdverbreide toepassing is beperkt door het grote aantal primaire cellen nodig voor bio-energetische analyse. Deze technische beperking overwonnen door het combineren van de specificiteit van de magnetische kraal isolatietechnieken, celadhesie technieken, waarmee cellen worden gehecht zonder activering microplaten, en de gevoeligheid van nieuwe technologieën ontworpen voor high throughput microplate respirometry. Een voorbeeld van dit materiaal het extracellulaire flux analysator. Dergelijke instrumenten gebruikt doorgaans zuurstof en pH-gevoelige probes mate van verandering van deze parameters in hechtende cellen, die vervolgens kunnen worden gerelateerd aan metabolisme meten. Hier hebben we detail de methoden voor de isolatie en beplating van monocyten, lymfocyten, neutrofielen en bloedplaatjes, zonder activering, uit menselijk bloed en de analyse van bio-energetische mitochondriale functie in deze cellen. Daarnaast hebben we aantonen hoe de oxidatieve burst in monocyten en neutrofielen ook worden gemeten in dezelfde stalen. Aangezien deze methoden gebruiken slechts 8-20 ml menselijk bloed hebben ze mogelijkheden voor het bewaken van reactive oxygen species generatie en bio-energetica in een klinische setting.
Monitoring van de bio-energetische gezondheid van immuuncellen (monocyten, lymfocyten, neutrofielen) en bloedplaatjes uit het bloed is sedert enige tijd als een potentieel nuttig diagnostisch hulpmiddel om de algehele bio-energetische gezondheid van een individu te beoordelen. Er is een nieuwe hoeveelheid literatuur toeschrijven een aantal ziekten zoals kanker, cardiovasculaire ziekten en neurodegeneratieve ziekten mitochondriale dysfunctie 1,2. Dit is klinisch belangrijk omdat mitochondriale dysfunctie een reeks van cellulaire gebeurtenissen die pro-inflammatoire signaalwegen bevorderen of leiden tot celdood kunnen initiëren. Verschillende studies hebben mitochondriale functie van perifere mononucleaire bloedcellen en bloedplaatjes bij aandoeningen zoals fibromyalgie, diabetes, septische shock, en ziekte van Alzheimer 3-7 gekarakteriseerd. Bijvoorbeeld, een recente studie evalueerde de bio-energetica van bloedplaatjes als een marker voor de mitochondriale functie en vond dat bloedplaatjes aan type 2 diabetIC patiënten hadden mitochondriale zuurstof verbruik 7,8 verminderd. Uit deze bevindingen en anderen blijkt dat monocyten, lymfocyten, neutrofielen en bloedplaatjes als plaatsvervangende markers veranderingen in bio-energetica kan dienen onder pathologische omstandigheden aangezien overzien de systemische circulatie en kunnen lokale en globale metabolische wijzigingen. Om te bepalen of deze benadering prognostische of diagnostische waarde high throughput analysemethode en consistente werkwijze voor celbereiding vereist.
De methoden om mitochondriale functie van leukocyten en bloedplaatjes te meten hebben eerder betrokken isolatie van mitochondriën of beoordeling van cellulaire bio-energetica in intacte cellen 4,9. Het voordeel van cellulaire bio-energetische evaluatie middels een extracellulaire flux (XF) analysator is dat de mitochondriale functie in cellen kunnen worden opgesteld endogene substraten en respiratoire parameters zoals proton lekkage en maximale respiratoirecapaciteit kan worden bepaald. Wij en anderen hebben gebruik gemaakt van deze technologie aangetoond dat bioenergetische profielen bloedplaatjes, monocyten en lymfocyten uit humaan bloed geïsoleerd kan worden vastgesteld en vergeleken tussen celtypes 8. Bovendien, zowel neutrofielen en monocyten bezit een oxidatieve uitbarsting hoedanigheid waarin NAPDH oxidasen worden geactiveerd en verbruiken zuurstof superoxide. Belangrijk is dat deze route is een belangrijk onderdeel van het aangeboren immuunsysteem en wordt gemoduleerd door systemische ontsteking. Zo is aangetoond dat veranderingen in de oxidatieve burst capaciteit wordt geassocieerd met verschillende auto-immuunziekten zoals multiple sclerose, artritis en recidiverende infecties 10,11. Momenteel zijn er geen hoge doorvoer kwantitatieve bepalingen waarover de oxidatieve uitbarsting in klinische monsters te bepalen. Dit is belangrijk aangezien de karakterisering van de oxidatieve uitbarsting aantal neutrofielen en monocyten kan ook dienen als een belangrijk diagnostisch hulpmiddel voor meerdere patholoogGies.
De belangrijkste technische uitdagingen lage gevoeligheid voor de meting van zuurstofconsumptie behulp van conventionele technieken polarografische en de noodzaak gehechte cellen gebruiken wanneer u gevoeliger microplaat fluorometrische technieken. In deze praktische video beschrijven we de technische oplossing voor deze problemen. We detail de methoden voor de isolatie, beplating en het meten van bio-energetica van monocyten, lymfocyten, neutrofielen en bloedplaatjes en de oxidatieve uitbarsting van monocyten en neutrofielen uit menselijk bloed. Deze methode is geschikt voor de klinische beoordeling van bio-energetica en oxidatieve burst voor onderzoekers die hebben toegang tot een patiëntenpopulatie en de mogelijkheid om nieuw bloed monsters.
Dit protocol geeft de compilatie van meerdere technieken vaak gebruikt voor bloedcel isolatie op een wijze die geschikt is voor bio-energetica analyse. De aangrenzende technieken die voordelig voor andere isolatiemethoden (bijvoorbeeld FACS-analyse) voor hun vermogen om grote aantallen cellen te isoleren in gecontroleerde media omstandigheden met minimale spanningen die op de geïsoleerde cellen. Het heeft het nadeel van langdurige isolaties, zelfs met minimale onderbrekingen. Dit protocol dient als basis voor de isolatie van primaire bloedcellen van proefpersonen, die kan worden geëxtrapoleerd naar klinische instellingen en translationeel onderzoek.
MACS scheiding betrouwbaar celisolatie techniek die het mogelijk isoleren van cellen uit bloed heeft, maar vereist deze werkwijze grotere hoeveelheden antilichaam en niet optimaal is voor de isolatie van vier verschillende celtypes zoals beschreven in deze werkwijze. Er heeft bEEN geen bewijs om aan te tonen dat de positieve selectie van leukocyten door MACS scheiding resulteert in de activering met behulp van onze isolatie-protocol. MACS kolommen functioneren van sekwestratie van gelabelde cellen in een magnetisch veld met behulp van antilichamen geconjugeerd aan 50 nm superparamagnetische deeltjes. Gelabelde cellen worden vervolgens geëlueerd uit de kolom. Positieve en negatieve selecties zijn geïmplementeerd in dit protocol om snelle isolatie en zuiverheid garanderen. Indien onvoldoende aantal cellen verkregen uit geïsoleerd of zuiverheid betrokken, kan meer antilichamen aan het monster worden toegevoegd volgens de instructies van de leverancier en de tweede doorgang door de kolom LS kan leiden tot een grotere zuiverheid (Tabel 2). Ons laboratorium gevonden hoge zuiverheid en plating efficiëntie met behulp van het bestaande protocol door het analyseren finale celsuspensies door FACS-analyse 8.
Extracellulaire flux analysers hebben de mogelijkheid om zowel het zuurstofverbruik en media verzuring in real time boven dat van othaar elektroden. Het zuurstofverbruik zoals waargenomen door de oxidatieve burst respons in monocyten en neutrofielen is NADPH oxidase afhankelijk zoals aangetoond door remming met DPI 8. We hebben een tijdsafhankelijke verlies in oxidatieve burst capaciteit langdurige isolatie of uitgebreide XF assays gezien. Dit protocol werd ontworpen en ontwikkeld voor gebruik op XF24 maar is ook compatibel met de XF96 ongeveer eenderde tot de helft van de XF24 cel zaaien dichtheden (figuur 3).
In het ontwerp van dit protocol, is de naleving van de bestaande protocollen voor elke techniek die nodig is voor optimale prestaties met wijzigingen uitsluitend media voorwaarden voor bio-energetische analyse te beheersen. Na het beheersen van technieken, kan een dergelijk protocol worden gebruikt in een breed scala aan translationeel en wetenschappelijke toepassingen om de toxiciteit of effectiviteit van de behandeling strategieën te meten, onderzoeken metabole kenmerken van de ziekte, en oxidant productie door monocyten en neutrophils in inflammatoire aandoeningen.
The authors have nothing to disclose.
De auteurs willen graag de technische bijdrage van Gloria A Benavides erkennen. Dit werk werd ondersteund door de American Heart Association 13PRE16390001 (SR), NIH T32HL07918 (PAK), NIH T32HL007457 (TM), P30DK056336 (BKC), NIDDK Diabetische complicaties Consortium (DiaComp, www.diacomp.org) subsidie DK076169 (subaward VDU), en de O'Brien Center P30 DK079337 (VDU).
QuadroMACS Starting Kit incl. QuadroMACS Separator and MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-094-833 | |
CD235a (Glycophorin A) MicroBeads, human | Miltenyi Biotec | 130-050-501 | |
CD61 MicroBeads, human for platelets | Miltenyi Biotec | 130-051-101 | |
CD14 MicroBeads, human for monocytes | Miltenyi Biotec | 130-050-201 | |
CD15 MicroBeads, human for granulocytes | Miltenyi Biotec | 130-046-601 | |
LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
BD Vacutainer ACD Blood collection tubes | Fisher | 02-684-26 | |
RPMI 1640 | Gibco | 11835-030 | with L-glutamine and without phenol red |
Prostaglandin I2, sodium salt | Cayman | 18220 | |
1.5 ml semi-micro cuvettes | Phenix Research Products | SC-2410 | |
Histopaque density gradient, specific gravity 1.077 | Sigma | 10771 | |
Histopaque density gradient, specific gravity 1.119 | Sigma | 11191 | |
Bovine Serum Albumin Fraction V | Roche | 3117405001 | fatty-acid ultra-free |
Phorbol 12-myristate 13-acetate | Sigma | P8139 | |
XF24 FluxPak | Seahorse Biosciences | 100850-001 | |
DMEM | Fisher | MT90113PB | w/o Glucose, L-Glutamine, Pyruvate, Phenol Red, and Bicarbonate |
L-Glutamine, 200mM (100x) | Invitrogen | 25030-081 | |
D-Glucose | Sigma | G7528 | |
Sodium Pyruvate | Sigma | P8574 | |
Cell-Tak (cell adhesive) | BD Biosciences | CB-40242 | |
Oligomycin | Sigma | O4876 | |
Antimycin A | Sigma | A8674 | |
(FCCP) Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone | Sigma | C-2920 | |
DC Protein Assay Reagent A | Bio-Rad | 500-0113 | |
DC Protein Assay Reagent S | Bio-Rad | 500-0015 | |
DC Protein Assay Reagent B | Bio-Rad | 500-0114 | |
Equipment | Vendor | Product # | Comments/Description |
Seahorse | Seahorse Biosciences | ||
QuadroMACS Separator and MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-090-976 and 24039 | |
Spectrophotometer |