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Immunology and Infection

Bioenergetik und die Oxidative Burst: Protokolle für die Isolierung und Bewertung der menschlichen Leukozyten und Thrombozyten

doi: 10.3791/51301 Published: March 27, 2014
* These authors contributed equally

Summary

Blut-Leukozyten und Blutplättchen können als Marker der Gesamt bioenergetischen Gesundheit einer Person verwendet werden und so das Potenzial haben, pathologische Prozesse und die Auswirkungen der Behandlung zu überwachen. Hier beschreiben wir ein Verfahren zu isolieren und zu messen, die Funktion der Mitochondrien und die oxidative Burst in diesen Zellen.

Abstract

Mitochondriale Funktionsstörung ist bekannt, eine wichtige Rolle in einer Reihe von pathologischen Zuständen, wie Atherosklerose, Diabetes, septischer Schock, und neurodegenerative Krankheiten, sondern die Beurteilung von Veränderungen in bioenergetischen Funktion bei Patienten ist eine Herausforderung zu spielen. Obwohl Erkrankungen wie Diabetes oder Atherosklerose vorliegenden klinisch bestimmten Organ Beeinträchtigung, die systemischen Komponenten der Pathologie, wie Hyperglykämie oder Entzündung kann bioenergetischen Funktion der zirkulierenden Leukozyten oder Blutplättchen zu verändern. Dieses Konzept hat sich vor einiger Zeit erkannt worden, aber seine weit verbreitete Anwendung ist durch die große Anzahl von Primärzellen für Bioenergetische Analyse benötigt eingeschränkt. Diese technische Einschränkung wurde durch die Kombination der Spezifität der magnetischen Kügelchen Isolationstechniken, Zelladhäsion Techniken, die Zellen ohne Aktivierung zu ermöglichen Mikroplatten befestigt werden überwunden, und die Empfindlichkeit der neuen Technologien für hohen Durchsatz ausgelegt microplate Respirometrie. Ein Beispiel für dieses Gerät ist die extrazelluläre Fluss Analysator. Solche Instrumente verwendet in der Regel Sauerstoff-und pH-empfindliche Sonden an Veränderungsraten in diesen Parametern in adhärenten Zellen, die dann um den Stoffwechsel bezogen werden können, zu messen. Hier werden wir ausführlich die Methoden zur Isolierung und Beschichtung von Monozyten, Lymphozyten, Neutrophile und Thrombozyten, ohne Aktivierung, aus menschlichem Blut und der Analyse der mitochondrialen bioenergetischen Funktion in diesen Zellen. Darüber hinaus zeigen wir, wie die oxidative in Monozyten und Neutrophilen-Burst kann auch in den gleichen Proben gemessen werden. Da diese Verfahren nur 8-20 ml menschlichem Blut haben Potential zur Überwachung Bildung reaktiver Sauerstoffspezies und bioenergetischen in einer klinischen Umgebung.

Introduction

Überwachen des bioenergetischen Gesundheits von Immunzellen (Monozyten, Lymphozyten, Neutrophile) und Blutplättchen aus dem Blut ist seit einiger Zeit als ein potentiell nützliches Diagnosewerkzeug, um die Gesamt bioenergetischen Gesundheitszustand einer Person zu beurteilen erkannt. Es ist eine neue Körper der Literatur zuschreibt eine Reihe von Krankheiten wie Krebs, Herz-Kreislauf-Erkrankungen und neurodegenerativen Krankheiten zu mitochondriale Dysfunktion 1,2. Dies ist klinisch wichtig, da die mitochondriale Dysfunktion kann eine Reihe von zellulären Ereignissen, die pro-inflammatorische Signalwege zu fördern oder zu Zelltod einzuleiten. Mehrere Studien haben die mitochondriale Funktion von peripheren mononukleären Blutzellen und Plättchen in Erkrankungen wie Fibromyalgie, Diabetes, septischem Schock, Alzheimer-Krankheit und 3-7 gekennzeichnet. Zum Beispiel eine aktuelle Studie untersuchte die Bioenergetik von Blutplättchen als Marker für die Funktion der Mitochondrien und fand, dass Thrombozyten von Typ-2-Diabetikeric Patienten hatten mitochondriale Sauerstoffverbrauch 7,8 verringert. Aus diesen Erkenntnissen und anderen, ist es klar, dass Monozyten, Lymphozyten, Neutrophile und Thrombozyten können als Surrogatmarker der Veränderungen in der Bioenergetik unter pathologischen Bedingungen zu dienen, da sie überblicken den systemischen Kreislauf und können lokale und globale Stoffwechselveränderungen zu reflektieren. Um festzustellen, ob dieser Ansatz hat prognostischen oder diagnostischen Wert eine hohe Durchsatzanalyseverfahren und eine einheitliche Methode für die Zell Vorbereitung erforderlich.

Die Methoden, um die Funktion der Mitochondrien in Leukozyten und Thrombozyten messen zuvor beteiligt Isolierung von Mitochondrien oder Beurteilung der zellulären Bioenergetik in intakten Zellen 4,9. Der Vorteil der zellulären bioenergetischen Bewertung mit einer extrazellulären Fluss (XF)-Analysator ist, dass die Funktion der Mitochondrien in den Zellen mit endogenen Substraten und Atmungsparameter wie Protonenleck und maximale Atmungs eingerichtet werdenKapazität bestimmt werden. Wir und andere haben diese Technik verwendet, um zu zeigen, dass bioenergetische Profile in Thrombozyten, Monozyten und Lymphozyten aus menschlichem Blut isoliert etabliert und kann im Vergleich zu Zelltypen 8 werden. Außerdem sind beide Neutrophilen und Monozyten besitzen einen oxidativen Burst-Eigenschaft, in der NADPH-Oxidasen aktiviert und verbrauchen Sauerstoff in Superoxid. Wichtig ist, dass dieser Weg ein wichtiger Bestandteil der angeborenen Immunität und wird durch systemische Entzündung moduliert. Beispielsweise wurde gezeigt, dass Veränderungen in der oxidativen Burst Kapazität mit verschiedenen Autoimmunerkrankungen wie Multiple Sklerose, Arthritis und wiederkehrenden Infektionen 10,11 verbunden. Derzeit gibt es keine hohen Durchsatz quantitative Tests zur Verfügung, um den oxidativen Burst in klinischen Proben zu messen. Dies ist wichtig, da die Charakterisierung der oxidativen Burst Kapazität von Neutrophilen und Monozyten kann auch als ein wichtiges diagnostisches Werkzeug für mehrere Pathologen dienengien.

Die wichtigsten technischen Herausforderungen wurden geringe Empfindlichkeit für die Messung der Sauerstoffverbrauch mit herkömmlichen Techniken polarographischen und der Notwendigkeit, anhaftenden Zellen verwenden, wenn Sie empfindlicher Mikro fluorimetrischen Techniken. In diesem praktischen Video beschreiben wir die technische Lösung für diese Probleme. Wir detailliert die Methoden zur Isolierung, Beschichtung und Messung der Bioenergetik von Monozyten, Lymphozyten, Neutrophile und Thrombozyten und der oxidativen Burst von Monozyten und Neutrophilen aus menschlichem Blut. Diese Methode eignet sich für die klinische Beurteilung der Bioenergetik und oxidativen Burst für die Ermittler, die haben Zugang zu einer Patientenpopulation und der Fähigkeit, frische Blutproben zu erhalten.

Protocol

Alle in diesem Manuskript für die Blutentnahme, Isolierung und Analyse beschriebenen Protokolle wurden überprüft und an der Universität von Alabama in Birmingham vom Institutional Review Board genehmigt.

1. Zellisolation (Geändert von Histopaque Sigma-Aldrich Protokoll Nr. 1119 und Miltenyi Biotec MICROBEAD positive und negative Selektion Protokolle)

  1. Centrifuge Vollblut bei 500 g für 15 min in einer Zentrifuge mit einem Schwenkbecherrotor (Beschleunigung = 5-6 und ohne Bremse) (in ACD oder EDTA-Röhrchen gesammelt).
  2. Entfernen Sie die obere Schicht, die die plättchenreichem Plasma (PRP) enthält mit einer Transferpipette bis 1 cm über der Zellschicht (Erythrozyten / Buffy-Coat) bleibt. Beiseite das PRP bei Raumtemperatur für die Verarbeitung später.
  3. Übertragung der Leukozytenmanschette in einem sterilen 50 ml konischen Röhrchen auf 24 ml mit RPMI basalen verdünnen oder mindestens 4-fache Ausgangsvolumen Buffy Coat.
    Hinweis: Die obere Hälfte des RBC-Schicht kann have einbezogen werden, obwohl dies bei der Erhöhung der RPMI Volumen proportional führen.
  4. Vorbereitung der Dichtegradient unter Verwendung von Ficoll niedriger Dichte mit einem spezifischen Gewicht von 1,077 (1077) für die obere Schicht und eine hohe Dichte Ficoll mit einem spezifischen Gewicht von 1,119 (1119) für die untere Schicht in drei 15 ml konische Röhrchen (jeweils 3 ml). Um diesen Schritt durchzuführen, zuerst in jedes Röhrchen hinzufügen 1077. Unter Verwendung einer 5 ml Pipette hinzu schmalen 1119 bis der Boden des Röhrchens, indem die Pipettenspitze unterhalb 1077 und das Reagenz langsam freisetzen, ohne Vermischung mit dem oberen Gradienten. Insgesamt 6 ml Dichtegradient Medien sollten vorhanden sein, in dieser Phase mit einem sichtbaren Trennungsphase in der 3-ml-Marke.
  5. Mit Hilfe einer automatisierten Pipette 8 ml verdünntem Blut (aus Schritt 1.3) vorsichtig, um jede Steigung Rohr mit der Low-Power-Einstellung, um aus der Steigung Schichten gestört wird. Das Gesamtvolumen sollte 14 ml bei diesem Schritt.
  6. Zentrifugenröhrchen bei 700 × g für 30 min bei Raumtemperatur (BeschleuniRation 6, keine Bremse).
    Hinweis: In dieser Phase sollten drei unterschiedliche Zell Bands offensichtlich (Abbildung 1A) sein. Die obersten Bänder (zwischen 1077 und Plasma) enthält mononuklearen Zellen (MNC) und Thrombozyten, und der mittlere Band (zwischen 1007 und 1119) enthält polymorphkernigen Zellen (PMN) und unteren Band (unter 1119) enthält Erythrozyten.
  7. Sammeln Sie die MNC und PMN separat mit sterilen Glaspipetten ohne Störung der anderen Zell Bands. Kombinieren Sie die MNC Bevölkerung aus jedem Röhrchen in ein steriles 50 ml konischen Röhrchen. Wiederholen Sie diesen Vorgang für die PMN Bevölkerung.
  8. Hinzufügen von 4 Volumen RPMI zu jedem Röhrchen, enthaltend die MNC und PMN-Fraktionen, die jeweils mit den Dichtegradienten verdünnen.
  9. Zentrifugenröhrchen bei 700 g für 10 min bei Raumtemperatur.
  10. MNC Zellpellet resuspendieren und PMN Zellpellet in 1 ml RPMI mit 0,5% ultra-reinen fettsäurefreies BSA (RPMI-BSA) und Transfer zum 1,5-ml-Röhrchen steril. Pellet die Zellen unter Verwendung eines Tisch picofuge 30sek.
  11. Überstand verwerfen und Pellet resuspendieren jede Zelle in 80 ul RPMI-BSA.
  12. Mit 20 ul magnetischen Kügelchen antiCD14 markiertem Antikörper zu dem Röhrchen mit dem MNC-Fraktion zur positiven Selektion von Monozyten. Für das Röhrchen mit dem PMN Zellfraktion, mit 20 ul magnetischen Kügelchen markierten Antikörper-antiCD15 für positive Selektion von Neutrophilen. Inkubieren jeder Zellsuspension für 15 min bei 4 º C.
  13. Waschen Sie jede Zellsuspension mit 1 ml RPMI-BSA Medien und Pellet wie vorher und resuspendieren jedes Pellet in 500 ul RPMI-BSA.
  14. Die markierten Zellen werden in dem Magnetfeld der magnetischen Zellsortierung (MACS) abgetrennt. Vorbereitung der MACS LS Spalten (eine für jeden Zellsuspension), indem die Spalte auf der MACS-Separator und Waschen mit 3 ml RPMI-BSA vor der Zugabe der Zellsuspension.
  15. Nach der Anwendung von Zellsuspensionen, waschen jede Spalte 3x mit 3 ml RPMI-BSA Medien (achten Sie darauf, lassen Sie die Medien drain vollständig zwischen Waschungen). Sammeln Sie die Zellsuspension Durchfluss-und Spalten wäscht in einem sterilen Röhrchen.
  16. Um Monozyten und Neutrophilen zu isolieren, entfernen Sie die Säule aus dem Magnetfeld nach dem letzten Waschen und Elution der positiv markierten Zellen in einem sterilen Röhrchen mit 5 ml RPMI-BSA mit der Spalte Kolben.
  17. Zur Isolierung Lymphozyten zu pelletieren die Durchfluss-Waschfraktion der MNCs aus Schritt 1.15 bei 300 g für 10 min. Überstand verwerfen und Zellpellet in 80 ul RPMI-BSA. In 20 ul CD61 und CD235a Antikörper und Inkubation Zellsuspension für 15 min bei 4 º C Wiederholen Sie den MACS-Trennung vor und sammeln die Strömung durch die die Lymphozyten.
  18. Um nach wie vor (Schritt 1,9) Diabolo Monozyten, Neutrophile und Lymphozyten Fraktionen, Zentrifuge und Überstände verwerfen. Zellpellets sollten in 1 ml extrazellulären Flussmedien (XF-DMEM) für die Zählung erneut suspendiert werden. <br /> Hinweis: 8 ml Vollblut in 5.1 x 10 6 Monozyten / ml, und 5-20 x 10 6 Lymphozyten und Neutrophile / ml führen.
  19. Um Thrombozyten, Zentrifuge PRP (Schritt 1.2) für 8-10 min bei 1.500 × g bei Raumtemperatur zu isolieren. Entfernen des Plasmas und waschen Zellpellet einmal mit 5 ml steriler PBS, ergänzt mit 1 &mgr; g / ml PGI 2, repellet auszusetzen und endgültige Pellet in 1 ml PBS-Puffer PGI 2.
  20. Bestimmen Thrombozytenzahl durch Turbidimetrie, wenn die Blutplättchen in PBS-Puffer von PGI 2 Spektrophotometer wie Walkowiak et al suspendiert, die folgende Gleichung: [6,23 / (2,016 - Abs 800)] - 3,09 x Verdünnungsfaktor = # x 10 8. Thrombozyten / ml 12.

2. Überzug der Zellen

  1. Herstellung von Zell-Tak (Zell Kleber): In 90 ul Zell Klebstoff zu 180 ul diH 2 0, 540 ul 0,1 N Natrium-biCarbonat (pH 8,0) und Einstellen des pH auf 7,2-7,8 ​​unter Verwendung von 1 N NaOH. Bereiten XF Platten (24-well, V7 Mikroplatten) durch Beschichtung jede Vertiefung mit 30 ul hergestellten Zellkleber.
    Hinweis: Die Zelle Klebstoff sollte für jede Verwendung frisch hergestellt werden.
  2. Inkubieren Platte bei 37 ° C für 20-30 Minuten und dann gründlich absaugen und waschen zelladhäsiven Vertiefungen mit PBS zweimal (1 ml / Vertiefung).
  3. Führen Sie eine Zellzahl auf isolierten Monozyten, Lymphozyten, Neutrophile und Thrombozyten und in angemessener Lautstärke mit XF-DMEM, eine Aussaatdichte von 250 T-Zellen / well, Monozyten, Lymphozyten und Neutrophile zu ermöglichen, und 25 x 10 6 / gut für Thrombozyten. Alternativ zur oxidativen Burst Reaktion messen, Neutrophilen kann 125k Zellen / Well ausgesät werden. Die letzte Aussaat Lautstärke für jeden Zellsuspension sollte 200 ul / gut.
  4. Zentrifugieren Sie die Platte bei 200 g für 1 Sekunde ohne Bremse. Drehen Sie die Platte 180 ˚ und Zentrifuge wieder ohne Bremse bei 300 x g.
  5. Bringen letzten gut volStärke in 660 &mgr; l DMEM mit XF-und bei 37 º C für 30 min vor der XF-Assay. Anmerkung: Mikrophotographien von plattierten Zellen vor und nach dem Test kann verwendet werden, um eine angemessene Beschichtung zu gewährleisten und auszuschließen Zellablösung werden.

3. Herstellung einer 24-Well-Extrazelluläre Flux Assay-Kennzeichen (XF24)

  1. Hydrate XF-Sonden mit Kalibrierungslösung für mindestens 2 Stunden vor dem Test.
  2. Bereiten 10x Bestände von 0,5 ug / ml Oligomycin 0,6 uM FCCP und 10 uM Antimycin A in XF-DMEM und Last 75 ul von Stammlösungen in die Patrone Einspritzöffnungen in der obigen Reihenfolge. Wenn oxidativen Burst-Messungen zu erhalten sind, können Injektion von 10-faches von 100 ng / ml PMA nach Antimycin-A injiziert werden.
  3. Kalibrieren Sie den hydratisiert und geladenen Patrone und führen Sie die XF-Assay. Die detaillierten Verfahren für die Analyse und Interpretation der beiden Sauerstoffverbrauch und pH-Veränderungen wurden in früheren Publikationen 9,13,14 beschrieben und sind nicht dim Detail iscussed hier.
  4. Nach XF Assay absaugen alle, aber die letzten 50 ul der XF-DMEM nach Assay zum Verlust von Zellen von der Platte zu verhindern, und 50 ul RIPA Zelllysepuffer und führen Sie einen Protein-Assay für die Normalisierung.

Representative Results

Um die Bioenergetik von Blutzellen zu bewerten, ist Vollblut von Probanden durch Venenpunktion in einem EDTA oder ACD Vacutainer Sammelröhrchen gesammelt. Die Isolierung von Leukozyten und Thrombozyten nach der Blutentnahme ist in 1A visualisiert, wie im Protokoll aufgeführt. Vollblutproben werden innerhalb von 8 h Kollektion verarbeitet, um den Zelltod und Aktivierung zu vermeiden. Erweiterte Lagerzeiten von mehr als 8 Stunden wurden nicht getestet, kann aber in veränderter Bioenergetik führen und weniger Vertreter der physiologischen Bedingungen. Säure-Citrat-Dextrose (ACD-8 ml) und EDTA-Vacutainer-Röhrchen wurden für Zellisolierungen ohne beobachtete Effekt auf die bioenergetische Funktion der isolierten Zellen verwendet worden. Antikoagulantien sind notwendig, da Blutgerinnsel verringern die Anzahl der Zellen erhalten, stören richtige Phasenbildung während Ficollgradientenzentrifugation und führen zu wenig bis gar keine Blutplättchen in zentrifugiert Serum erhalten. Alle Blut stellt eine biologischschen Gefahr und richtige persönliche Schutzausrüstung muss während des gesamten Verfahrens auch nach Zellpopulationen isoliert oder Zelllysaten erzeugt werden implementiert werden. Die Proben sind entsprechend den menschlichen Entsorgungsstandards der Einrichtung entsorgt werden.

Vollblut wird zentrifugiert, um das plättchenreiche Plasma aus dem Buffy-Coat, der weißen Schicht gerade oberhalb der gepackten roten Blutkörperchen, die Leukozyten enthält, zu trennen. Die Buffy Coat wird Dichtegradienten aufgetragen und zentrifugiert, um die peripheren mononukleären Blutzellen (Monozyten und Lymphozyten) und polymorphkernige Zellen (Granulozyten) zu erhalten. RBC-Kontamination der einzelnen MNC und PMN Zellphasen zu diesem Zeitpunkt häufig und sollten während des MACS Reinigung gelöst werden. Die verschiedenen Zelltypen werden dann durch Inkubation mit magnetischen Antikörpern erhalten zu reinen Fraktionen erhalten. Monozyten werden durch Inkubation der PBMC-Fraktion mit CD14, dem Durchfluss von t gesammeltener Monozyten Lymphozyten enthalten, die dann von roten Blutkörperchen und Blutplättchen erschöpft. Die Neutrophilen werden durch Inkubation der polymorphkernige Zellschicht mit CD15-Antikörper (Fig. 1A) erhalten. Danach können die Blutplättchen durch Zentrifugation von dem plättchenreichen Plasma pelletiert und gewaschen, um andere Plasmabestandteile zu entfernen. Nach dieser Auswahl die Blutplättchen, CD14 + Monozyten, Lymphozyten, CD15 + Neutrophilen gezählt und plattiert werden auf einer Zelladhäsion mittelbeschichteten XF Analysator Platte für Bioenergetik und oxidativen Burst-Analyse.

Jede Stufe des Verfahrens sollte unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden und wird empfohlen, um eine vorzeitige Aktivierung des oxidativen Burst in Monozyten Reaktion und Neutrophilen verhindern. Ein Indikator von weniger als sterilen Bedingungen bei der Isolierung ist offensichtlich, wenn Neutrophilen, die unter basalen Bedingungen wenig bis gar keine Sauerstoffverbrauch haben, beginnen die extrazelluläre Flusstest mit erhöhten OCR-Messungen, dieschrittweise zu erhöhen oder zu abzulehnen während des Tests. Wir unterstreichen die Bedeutung der Bildgebung von Zellen mittels Lichtmikroskopie bei 200-facher oder höher, um sicherzustellen, dass keine morphologischen Zeichen der Aktivierung haben vor dem Test aufgetreten. Zum Beispiel Neutrophile normalerweise eine abgerundete unregelmäßige Form angezeigt mit ausgeprägter Zellgrenzen, wie in Fig. 1B zu sehen. Allerdings werden diese Zellen auf die Oberfläche der Platte flach, wenn sie aktiviert und verlieren ihre unterschiedliche Zellmorphologie. Wir haben bereits berichtet, die morphologischen Veränderungen der aktivierten Leukozyten und Thrombozyten mit diesem Protokoll und zusätzliche Maßnahmen zu ergreifen, um sterile Bedingungen zu gewährleisten, wenn der Begegnung Aktivierung 8.

Ein vereinfachtes Schema des Protokolls ist in Abbildung 2 als Zeittabelle, in der die wichtigsten Schritte der Zellisolierung, XF Plattenvorbereitung und XF-Assay sind detaillierte gesehen. Isolierung besteht aus der Dichtegradienten Abtrennung von Zelltypen unddurch magnetische Trennung folgt. Parallel zur Zellisolierung Prozess, XF Plattenvorbereitung notwendig, um Verzögerungen bei der Zellbeschichtung oder dem Beginn der XF-Assay zu vermeiden. Dies ist entscheidend, weil erhebliche Verspätungen zu-Zell-Aktivierung und verminderte Bioenergetik Parameter führen.

Unzureichende Zellkonzentrationen nach der Isolierung sind ein häufiges Problem und Optimierung jedes Zentrifugation Prozess ist notwendig, um Zellverlust zu vermeiden. Erfolgreiche Isolierungen wurden auf weniger als 6 ml Blut durchgeführt wurde, aber in Abhängigkeit von zirkulierenden Konzentrationen des gewünschten Zelltyps können Änderungen vorgenommen werden. Wenn die Dichte Gradienten unsachgemäß vorbereitet, kann verschiedene Zell Phasen nicht sichtbar sein und der Verlust von Zellen auftreten (siehe JoVE Lehr-Video für eine visuelle Demonstration). Zu wenig Blutplättchen aus dem PRP isoliert ist selten, aber liegt vor, wenn Waschpuffer nicht PGI 2 enthält oder wenn die Isolierung unterhalb der Raumtemperatur stattfindet. Die Gefahr der Thrombozyten einctivation wird oft verhindert werden, wenn Thrombozyten sind die letzten Zellen isoliert werden, aber wenn Thrombozyten bleiben in Waschpuffer für längere Zeit die Bioenergetik betroffen sein werden. Es wurden Fälle von kleineren Plättchenpopulationen, die nicht während der 1.500 xg Zentrifugation pelle hat und die bioenergetischen dieser Zellen wurde nicht ausführlich charakterisiert. Siehe Tabelle 2 für eine vollständige Anleitung zur Fehlerbehebung.

Bioenergetischen Profile von Leukozyten und Blutplättchen mit der XF-Analysator, der Echtzeit-O 2-Verbrauchs in Zellen mißt nichtinvasiv bestimmt werden. Jeder Zelltyp auf der XF24 Platte mit fünf Wiederholungen plattiert, wie in der 3A gezeigt. Tabelle 1 zeigt die erwartet basalen und oxidativen Burst-Werte von Zelltyp während des Tests und den durchschnittlichen Proteinkonzentrationen pro Vertiefung. Hochdurchsatz-Technologien zur Verfügung, wie der XF96, die ermöglichtvier Spendern, gleichzeitig, wie in 3B gezeigt, beurteilt werden. Nach dem Test werden die Daten auf einen Arbeitsplatzrechner für die Analyse unter Verwendung der geeigneten Software und XF Microsoft Excel exportiert. Die OCR-Werte wurden auf den Gesamtproteingehalt in den entsprechenden Vertiefungen normiert und als pmol / min / mg Protein. Die repräsentativen bioenergetischen oxidativen Burst-Profile der einzelnen Zelltyp wurden kürzlich von unserer Gruppe 8 angegeben. Die weitere Analyse der bioenergetischen Parameter des Tests (basal, ATP-gebundenen Protonen Leck, maximal, nonmitochondrial und oxidativer Burst) kann für einzelne Vertiefungen wie zuvor gezeigt, und unter 8 beschrieben, berechnet werden.

Die basale Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) wird durch den ersten 3 Messungen festgestellt, wie in Fig. 4A gezeigt. Oligomycin (0,5 ug / ml), ein Inhibitor der mitochondrialen ATP-Synthase in der XF Medium injiziert wird, um zu ermitteln, um die OCR-ATP-Synthese gekoppelt und Vertre ted als ATP-verknüpft. Die Rest OCR abzüglich der nonmitochondrial OCR können Protonenleck zurückzuführen. Dann FCCP Entkoppler wird gegeben, um die maximale OCR, gefolgt von Antimycin-A, ein Inhibitor der mitochondrialen Atmung, um nonmitochondrial Quellen Sauerstoffverbrauch zu bestimmen. Reservekapazität ist ein Maß der Menge an ATP, die unter energetischen Bedarf hergestellt werden können und als die Differenz zwischen der maximalen Rate der Atmung und der basalen berechnet. Um den oxidativen Burst Kapazität zu bestimmen, Phorbol-12-Myristat-13-Acetat (PMA) ein PKC-Agonisten injiziert, um NADPH-Oxidase-Aktivität zu erhöhen und die Erhöhung der Sauerstoffverbrauchsrate nach PMA-Stimulation mit der XF-Analysator gemessen werden. 4B zeigen, wie die verschiedenen Parameter der Funktion der Mitochondrien und oxidativer Burst berechnen.

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Abbildung 1. Isolierung von Leukozyten und Thrombozyten aus Vollblut. A) Frisch gesammelten Proben werden durch Zentrifugation in ihre Plasma und Zellbestandteile getrennt und durch Ficoll-Dichtegradienten gereinigt und Magnetic Activated Cell Sorting (MACS) von positiven (Monozyten und Neutrophilen) oder negative Selektion (Lymphozyten), während die Thrombozyten werden durch hohe isoliert Speed-Zentrifugation der plättchenreiches Plasma. B) Bilder der isolierten Zellpopulationen XF einmal in DMEM resuspendiert und bei der angegebenen Zelldichten plattiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Abbildung 2. Vorbereitung der XF24 Platten für Bioenergetische Studien von Leukozyten und Thrombozyten. Detaillierte Zeitplan für die Vorbereitung einer XF24 Testplatte durch Zellisolierung und-Beschichtung und Patrone Hydratation und Injektionsöffnung Belastung.

Fig. 3
Abbildung 3. Aufbau der Leukozyten und Blutplättchen auf XF24 und XF96-Analysator-Platten. A) Leukozyten (125-250k Zellen / Vertiefung) und Thrombozyten (25 x 10 6 Zellen / Well) von einem einzigen Spender werden auf der Testplatte unter XF24 Hintergrund vergoldet Kontrollen. 75 ul 10x Bestände Oligomycin (0,5 ug / ml), FCCP (0,6 uM), Antimycin A (10 &mgr; M) und PMA (100 ng / ml) in Medium verdünnt XF werden geladenauf die angegebenen Einspritzöffnungen. B) Leukozyten (75-150k Zellen / Vertiefung) und Plättchen (10 x 10 6 Zellen / Vertiefung) von weniger als vier Geber auf der XF96 in einem Gesamtvolumen von 180 &mgr; l DMEM-XF werden. 20 ul 10x Bestände Oligomycin (1,0 ug / ml) werden FCCP (0,6 uM), Antimycin A (10 &mgr; M) und PMA (100 ng / ml) in DMEM-XF in den angegebenen Einspritzöffnungen geladen.

Fig. 4
Abbildung 4. Bioenergetische Analyse der Indizes. A) Repräsentative Spur von Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) von Mitochondrien und oxidativen Burst in Monozyten. Basal OCR ansässig ist (ersten 3 Preise durch Zahlen in den Kreisen angedeutet). Dann aufeinanderfolgende Zugaben von Oligomycin (O, 0,5 ug / ml), FCCP (F, 0,6 &mgr; M) und Antimycin-A (A; 10 uM) werden eingespritzt, um die mitochondriale Atmung und nonmitochondrial von nicht-aktivierten Zellen zu bestimmen. Schließlich PMA (100 ng / ml) wird zugesetzt, um oxidativen Burst. B messen) Modulare Analyse der Funktion der Mitochondrien und oxidativer Burst sind durch die Unterschiede in den Raten wie angegeben berechnet.

Optimale Aussaatdichte Rel. Basal OCR (pmol O 2 / min) Rel. Oxidativer Burst OCR (pmol O 2 / min) Rel. Protein (ug) / gut
Monozyten 250k Zellen / 83,9 (± 13,0) 300,3 (± 58,8) 19,0 (± 2,4)
250k Zellen / 6,1 (± 2,2) 1411,8 (± 233,3) 20,6 (± 2,7)
Lymphozyten 250k Zellen / 52,9 (± 7,7) 15 (± 4,1) 13,2 (± 2,1)
Thrombozyten 25 x 10 6 Zellen / Well 199,4 (± 20,3) 24 (± 2,7) 47,5 (± 3,1)

Tabelle 1. Normale Parameter für die XF24-Test: Die durchschnittliche basale (Rate 3) und oxidativen Burst (Rate 7) OCR nicht nonmitochondrial OCR oder Protein korrigiert werden von Zelltyp zu den angegebenen Zelldichten überzogen dargestellt. Die durchschnittliche Proteingehalt pro Vertiefung dargestellt, wie durch einen Gleichstrom Lowry-Assay durchgeführt. Diese Daten stellen die Mittelwerte6-8 gesunden Spendern mit Klammern enthalten, ± SEM.

Schritt Problem Mögliche Ursache Lösung
1.2 klare Plasma Blutplättchen während der Zentrifugation pelletiert verringern Zentrifugation Zeit auf 10 min oder langsam zu 400 xg
milchig-Plasma überschüssige Lipide vermeiden postprandiale Sammlung
1.6 unvollständige Zellbändern gebildet KoboldRoper Gradienten Vorbereitung, Kälte-Reagenz nicht zu stören Gradienten beim Pipettieren, Verwendung Raumtemperatur Reagenz
Klumpen in Zell Bands Gerinnung des Blutes stattgefunden haben könnte Sammle Blut mit Antikoagulantien wie ACD oder EDTA
1.10 keine Zellpellet siehe Schritt 1.6 Wenn trübe Überstand siehe unten
trübe Überstand Schwere Ficollgradienten Verschmutzung, Kontamination Thrombozyten Steigern Zentrifugationsgeschwindigkeit bis 900 g, diLaute mit RPMI
1.16, 1.17 geringe Ausbeute von Leukozyten RBC schwere Kontamination, nicht genug, Vollblut, Gerinnungs Doppel-Antikörper-und RPMI-BSA-Bände, mehr Blut zu sammeln, fügen Antikoagulans
1,19 Plättchenaggregation PGI 2 weggelassen, Erkältung Medien, längerer Lagerung im Plasma hinzufügen PGI 2 Thrombozytenwaschpuffer, Verwendung Raumtemperatur Reagenzien
1,20 niedrige Thrombozytenzahl Verlust während der primären Zentrifugation, die Thrombozytenaggregation SehenSchritte 1.2 und 1.19
2.3 RBC Kontamination Wiederholen MACS Trennung

Tabelle 2. Leukozyten-und Thrombozyten Isolierung der Fehlersuche. Tabelle sind häufige Probleme bei Leukozyten-und Thrombozytenzellisolierung aus Vollblut und Lösungen, die den Benutzer durch den Fehlerbehebungsprozess angetroffen.

Discussion

Dieses Protokoll stellt die Zusammenstellung mehrerer häufigsten verwendeten Techniken für die Blutzellisolation in einer für die Analyse der Bioenergetik Weise. Sind die zusammenhängenden Techniken vorgestellt vorteilhaft zu anderen Trennverfahren (zB FACS-Analyse) für ihre Fähigkeit, eine große Anzahl von Zellen in kontrollierten Medien Bedingungen mit minimalen Belastungen auf den isolierten Zellen platziert isolieren. Es hat den Nachteil der langen Isolierungen auch mit minimalen Unterbrechungen. Dieses Protokoll dient als Grundlage für die Isolierung von primären Blutzellen aus menschlichen Probanden, die in klinischen und translationalen Forschung extrapoliert werden kann.

MACS ist eine zuverlässige Trennung Zellisolationsverfahren, das die Möglichkeit zur Isolierung von Zellen direkt aus Vollblut bietet, jedoch erfordert dieses Verfahren größere Mengen an Antikörper und ist nicht optimal für die Trennung aller vier verschiedene Zelltypen, wie in diesem Verfahren beschrieben. Es hat been keine Beweise, um zu zeigen, dass die positive Selektion von Leukozyten durch MACS Trennergebnisse bei der Aktivierung mit unserer Isolation Protokoll. MACS Spalten funktionieren durch Sequestrierung von markierten Zellen in einem Magnetfeld unter Verwendung von Antikörpern zu 50 nm superparamagnetischen Teilchen konjugiert. Markierten Zellen werden dann aus der Säule eluiert. Positive und negative Selektionen werden in diesem Protokoll implementiert, um schnelle Isolierung und Reinheit zu gewährleisten. Wenn nicht genug Zellzahlen werden aus der Isolation erhalten oder Reinheit in Frage, mehr Antikörper kann der Probe nach Anweisung des Herstellers und zweiten Durchgang durch den LS Spalte hinzugefügt werden können, in größerer Reinheit (Tabelle 2) führen. Unser Labor fand hohe Reinheit und Beschichtungseffizienz mit Hilfe der bestehenden Protokolls durch die Analyse von Zellsuspensionen Abschluss durch FACS-Analyse 8.

Extrazelluläre Fluss Analysatoren haben die Möglichkeit, sowohl den Sauerstoffverbrauch und Medien Versauerung in Echtzeit über die der ot überwachenihr Elektroden. Der Sauerstoffverbrauch durch den oxidativen Burst in Monozyten Reaktion und Neutrophile beobachtet NADPH-Oxidase-abhängige wie durch Hemmung mit DPI 8 gezeigt. Wir haben eine zeitabhängige Verlust in oxidativen Burst Kapazität bei längerer oder Isolierungen erweitert XF-Tests gesehen. Dieses Protokoll wurde für die Verwendung im XF24 entworfen und entwickelt, sondern ist auch mit dem XF96 kompatibel zu etwa ein Drittel bis eine Hälfte der Zelle XF24 Einsaatdichten (Abbildung 3).

Im Entwurf des Protokolls wurde die Einhaltung der bestehenden Protokollen für jede Technik für optimale Leistung mit Modifikationen vorgenommen hat, nur um Medienbedingungen für bioenergetische Analyse Kontrolle erforderlich. Nach dem Mastering-Techniken kann ein solches Protokoll in einer breiten Palette von Translations-und Forschungsanwendungen verwendet werden, um die Toxizität und Wirksamkeit von Behandlungsstrategien zu messen, zu erkunden metabolischen Eigenschaften der Krankheit, und Oxidationsmittel-Produktion durch Monozyten-und neut werdenrophils bei Entzündungen.

Disclosures

VDU ist ein Mitglied der Seahorse Bioscience Scientific Advisory Board.

Acknowledgments

Die Autoren möchten die technischen Beitrag von Gloria Benavides A bestätigen. Diese Arbeit wurde von der American Heart Association 13PRE16390001 (SR), NIH T32HL07918 (PAK), NIH T32HL007457 (TM), P30DK056336 (BKC) unterstützt, NIDDK Diabetische Komplikationen Consortium (Diacomp, www.diacomp.org) Zuschuss DK076169 (subaward VDU), und der O'Brien-Center P30 DK079337 (VDU).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
QuadroMACS Starting Kit includes QuadroMACS Separator and MACS MultiStand Miltenyi Biotec 130-094-833
CD235a (Glycophorin A) MicroBeads, human Miltenyi Biotec 130-050-501
CD61 MicroBeads, human  for platelets Miltenyi Biotec 130-051-101
CD14 MicroBeads, human  for monocytes Miltenyi Biotec 130-050-201
CD15 MicroBeads, human  for granulocytes Miltenyi Biotec 130-046-601
LS Columns Miltenyi Biotec 130-042-401
BD Vacutainer ACD Blood collection tubes Fisher 02-684-26
RPMI 1640 Gibco 11835-030 with L-glutamine and without phenol red
Prostaglandin I2, sodium salt Cayman 18220
1.5 ml semi-micro cuvettes Phenix Research Products SC-2410
Histopaque density gradient, specific gravity 1.077 Sigma 10771
Histopaque density gradient, specific gravity 1.119 Sigma 11191
Bovine Serum Albumin Fraction V Roche 3117405001 fatty-acid ultra-free
Phorbol 12-myristate 13-acetate Sigma P8139
XF24 FluxPak Seahorse Biosciences 100850-001
DMEM Fisher MT90113PB w/o Glucose, L-Glutamine, Pyruvate, Phenol Red, and Bicarbonate
L-Glutamine, 200 mM (100x) Invitrogen 25030-081
D-Glucose Sigma G7528
Sodium Pyruvate Sigma P8574
Cell-Tak (cell adhesive) BD Biosciences CB-40242
Oligomycin Sigma O4876
Antimycin A Sigma A8674
(FCCP) Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone Sigma C-2920
DC Protein Assay Reagent A Bio-Rad 500-0113
DC Protein Assay Reagent S Bio-Rad 500-0015
DC Protein Assay Reagent B Bio-Rad 500-0114
Seahorse Seahorse Biosciences
QuadroMACS Separator and MACS MultiStand Miltenyi Biotec 130-090-976 and 24039
Spectrophotometer

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References

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Bioenergetik und die Oxidative Burst: Protokolle für die Isolierung und Bewertung der menschlichen Leukozyten und Thrombozyten
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Kramer, P. A., Chacko, B. K., Ravi, S., Johnson, M. S., Mitchell, T., Darley-Usmar, V. M. Bioenergetics and the Oxidative Burst: Protocols for the Isolation and Evaluation of Human Leukocytes and Platelets. J. Vis. Exp. (85), e51301, doi:10.3791/51301 (2014).More

Kramer, P. A., Chacko, B. K., Ravi, S., Johnson, M. S., Mitchell, T., Darley-Usmar, V. M. Bioenergetics and the Oxidative Burst: Protocols for the Isolation and Evaluation of Human Leukocytes and Platelets. J. Vis. Exp. (85), e51301, doi:10.3791/51301 (2014).

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