כדוריות דם לבנות וטסיות דם יכולים לשמש כסמן לבריאות bioenergetic הכללי של אדם ולכן יש לו את הפוטנציאל לפקח על תהליכים פתולוגיים ואת ההשפעה של טיפולים. כאן אנו מתארים שיטה לבודד ולמדוד את תפקוד המיטוכונדריה ופרץ חמצוני בתאים אלה.
תפקוד המיטוכונדריה ידוע לשחק תפקיד משמעותי במספר מצבים פתולוגיים כגון טרשת עורקים, סוכרת, הלם ספטי, ומחלות ניווניות אך הערכת שינויים בתפקוד bioenergetic בחולים מאתגרת. למרות שמחלות כמו סוכרת או טרשת עורקים הנוכחית קליניות עם ליקוי איבר מסוים, רכיבים מערכתיים של פתולוגיה, כגון היפרגליקמיה או דלקת, יכולים לשנות את תפקוד bioenergetic במחזור לויקוציטים או טסיות דם. תפיסה זו זכתה להכרה לכמה זמן, אבל היישום הנרחב שלה כבר מוגבל על ידי המספר הגדול של תאים ראשוניים הנדרשים לניתוח bioenergetic. מגבלה טכנית זו כבר להתגבר על ידי שילוב ספציפי של הטכניקות מגנטי בידוד חרוז, טכניקות הידבקות תא, המאפשרות לתאים שיצורפו ללא הפעלה לmicroplates, והרגישות של טכנולוגיות חדשות המיועדות למיקרופון תפוקה גבוההrespirometry roplate. דוגמא לציוד זה היא מנתח השטף תאי. מכשור כזה משתמש בדרך כלל בדיקות רגישות חמצן וה-pH למדידת שיעורי השינוי בפרמטרים האלה בתאים חסיד, אז מה שיכול להיות קשור לחילוף חומרים. כאן אנו מפרטים את השיטות לבידוד והציפוי של מונוציטים, לימפוציטים, נויטרופילים וטסיות דם, ללא הפעלה, מהדם של בני אדם והניתוח של תפקוד bioenergetic המיטוכונדריה בתאים אלה. בנוסף, אנו מדגימים כיצד חמצוני פרצו במונוציטים ונויטרופילים יכולים גם להימדד בדגימות אותו. מאז שיטות אלה להשתמש רק 8-20 מיליליטר דם אדם שיש להם פוטנציאל לניטור דור חמצן מגיב מינים וbioenergetics בסביבה קלינית.
ניטור בריאות bioenergetic של תאים חיסוניים (מונוציטים, לימפוציטים, נויטרופילים) וטסיות דם מהוכר במשך זמן מה ככלי אבחון שעשוי להיות שימושיים כדי להעריך את בריאות bioenergetic הכללית של אדם. יש גוף מתעוררים של ספרות מייחס מספר המחלות כגון סרטן, מחלות לב וכלי דם ומחלות ניווניות ל1,2 תפקוד המיטוכונדריה. זה חשוב מבחינה קלינית מאז תפקוד המיטוכונדריה יכול ליזום סדרה של אירועים הסלולר שיקדמו מסלולי איתות הפרו דלקתיים או להוביל למוות של תאים. מספר מחקרים מאופיינים תפקוד המיטוכונדריה של תאים היקפיים mononuclear הדם וטסיות דם במצבים כגון פיברומיאלגיה, סוכרת, הלם ספטי, והמחלה 3-7 אלצהיימר. לדוגמא, מחקר שנערך לאחרונה העריך את bioenergetics של טסיות דם כסמן לתפקוד המיטוכונדריה ומצא כי טסיות דם מסוג 2 Diabetחולי ic פחתו 7,8 צריכת החמצן במיטוכונדריה. מממצאים אלה ואחרים, ברור שמונוציטים, לימפוציטים, נויטרופילים, וטסיות דם יכולים לשמש כסמנים פונדקאיות כשינויים בbioenergetics תחת מצבים פתולוגיים שכן הם יסקור את מחזור הדם המערכתי ועשויים לשקף שינויים מטבוליים מקומיים והעולמיים. כדי לקבוע אם גישה זו יש ערך פרוגנוסטי או אבחון בשיטת תפוקה גבוהה של ניתוח ושיטה עקבית להכנת תא נדרשת.
השיטות כדי למדוד את התפקוד המיטוכונדריה בלויקוציטים וטסיות דם שמעורבים בעבר בידוד של המיטוכונדריה או הערכה של bioenergetics הסלולר בתאים שלמים 4,9. היתרון של הערכת bioenergetic הסלולרית באמצעות שטף תאי מנתח (XF) הוא שהפונקציה של המיטוכונדריה בתאים ניתן להקים עם מצעי אנדוגני ופרמטרי נשימה כגון דליפת פרוטון ונשימה מקסימליקיבולת ניתן לקבוע. אנו ואחרים השתמשו בטכנולוגיה זו כדי להראות שפרופילי bioenergetic בטסיות דם, ניתן להקים מונוציטים ולימפוציטים מבודדים מהדם של בני אדם והשוואה בין סוגי תאים 8. בנוסף, שניהם נויטרופילים ומונוציטים בעלי קיבולת פרץ חמצוני בי oxidases NAPDH מופעלים וצורכים חמצן ליצירת superoxide. חשוב מכך, מסלול זה הוא מרכיב מרכזי של חסינות מולדת, והוא מווסת על ידי דלקת מערכתית. לדוגמא, זה כבר הראה כי שינויים בקיבולת פרץ חמצוני קשורים עם מחלות אוטואימוניות שונות, כגון טרשת נפוצה, דלקת פרקים, וזיהומים חוזרים ונשנים 10,11. כרגע אין מבחני כמותיים תפוקה גבוהה זמינים כדי למדוד את פרץ חמצוני בדגימות קליניות. זה חשוב מכיוון שמאפיין את קיבולת פרץ חמצוני של נויטרופילים ומונוציטים יכולים גם לשמש ככלי אבחונים חשובים מכמה patholoחיס.
האתגרים הטכניים המפתח היו רגישות נמוכה למדידה של צריכת חמצן תוך שימוש בטכניקות polarographic קונבנציונליות ואת הצורך להשתמש בתאים מצורפים בעת שימוש בטכניקות fluorometric microplate רגישות יותר. בסרטון מעשי זה, אנו מתארים את הפתרון הטכני לבעיות אלו. אנחנו פירוט השיטות לבידוד, ציפוי והמדידה של bioenergetics של מונוציטים, לימפוציטים, נויטרופילים, וטסיות דם ופרץ חמצוני של מונוציטים ונויטרופילים מהדם אנושי. שיטה זו מתאימה להערכה קלינית של bioenergetics ופרץ חמצוני לחוקרים שיש להם גישה לאוכלוסייה מטופלת ואת היכולת להשיג דגימות דם טריות.
פרוטוקול זה מייצג את האוסף של כמה טכניקות מנוצלים בדרך כלל לבידוד תאי דם באופן מתאים לניתוח bioenergetics. הטכניקות רציפות שהוצגו הן יתרון לשיטות אחרות בידוד (כלומר ניתוח FACS) ליכולת שלהם לבודד מספר גדול של תאים בתנאי תקשורת מבוקרים עם לחצים מינימאליים מונחים על התאים המבודדים. יש לו את החסרון של בידודים ממושכים גם עם הפרעות מינימליות. פרוטוקול זה משמש כבסיס לבידוד של תאי דם עיקריים מבני אדם, שניתן להסיק להגדרות קליניות ומחקר translational.
הפרדת MACS היא טכניקת בידוד תא אמינה שמציעה את האפשרות של בידוד תאים ישירות מדם כולו, עם זאת, שיטה זו דורשת כמויות גדולות יותר של נוגדנים ואינה אופטימלי לבידוד של כל ארבעת סוגי התאים שונים כפי שמתוארים בשיטה זו. שם יש בeen אין ראיות כדי להראות שהסלקציה החיובית של לויקוציטים ידי תוצאות הפרדת MACS בהפעלה באמצעות פרוטוקול הבידוד שלנו. עמודות MACS לפעול באמצעות קיבוע של תאים שכותרתו בשדה מגנטי באמצעות נוגדנים מצומדות כדי 50 חלקיקי פאראמגנטי ננומטר. לאחר מכן תאים שכותרתו eluted את הטור. בחירות חיוביות ושליליות מיושמות בפרוטוקול זה כדי להבטיח בידוד וטוהר מהירים. אם מספרי תא לקויים מתקבלים מבידוד או טוהר הוא בשאלה, ניתן להוסיף יותר נוגדנים למדגם לפי ההוראה של הספק והמעבר שני דרך עמודת LS עלול לגרום לטוהר גבוה יותר (טבלה 2). המעבדה שלנו מצאה טוהר גבוה ויעילות ציפוי באמצעות הפרוטוקול הקיים על ידי ניתוח השעיות תא סופיים על ידי ניתוח FACS 8.
יש מנתחי שטף תאיים היכולת לפקח גם צריכת חמצן והחמצת תקשורת בזמן אמת מעל זה של otאלקטרודות. צריכת החמצן כפי שנצפה על ידי תגובת פרץ חמצוני במונוציטים ונויטרופילים היא מונואמין NADPH תלוי כפי שמוצג על ידי עיכוב עם DPI 8. שראינו בהפסד תלוי בזמן בקיבולת פרץ חמצוני עם בידודים ממושכים או מבחני XF מורחבים. פרוטוקול זה תוכנן ופותחו לשימוש בXF24 אבל גם תואם עם XF96 כבשליש עד חצי מהתא XF24 זריעת צפיפות (איור 3).
בעיצוב של פרוטוקול זה, היצמדות לפרוטוקולים קיימים עבור כל טכניקה הנדרשת לביצועים אופטימליים עם שינויים שנעשו אך ורק כדי לשלוט בתנאי תקשורת לניתוח bioenergetic. לאחר שליטה בטכניקות, פרוטוקול כזה יכול לשמש במגוון רחב של יישומי translational ומחקר כדי למדוד את הרעילות או יעילות של אסטרטגיות טיפול, לחקור מאפיינים המטבולי של מחלה, וייצור חמצון על ידי מונוציטים וneutrophils במצבים דלקתיים.
The authors have nothing to disclose.
המחברים מבקשים להודות על התרומה הטכנית של גלוריה נאווידס. עבודה זו נתמכה על ידי איגוד הלב האמריקאי 13PRE16390001 (SR), NIH T32HL07918 (PAK), NIH T32HL007457 (TM), P30DK056336 (BKC), סיבוכי NIDDK סוכרתיים Consortium (DiaComp, www.diacomp.org) DK076169 מענק (VDU subaward), וDK079337 אובריאן מרכז P30 (VDU).
QuadroMACS Starting Kit incl. QuadroMACS Separator and MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-094-833 | |
CD235a (Glycophorin A) MicroBeads, human | Miltenyi Biotec | 130-050-501 | |
CD61 MicroBeads, human for platelets | Miltenyi Biotec | 130-051-101 | |
CD14 MicroBeads, human for monocytes | Miltenyi Biotec | 130-050-201 | |
CD15 MicroBeads, human for granulocytes | Miltenyi Biotec | 130-046-601 | |
LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
BD Vacutainer ACD Blood collection tubes | Fisher | 02-684-26 | |
RPMI 1640 | Gibco | 11835-030 | with L-glutamine and without phenol red |
Prostaglandin I2, sodium salt | Cayman | 18220 | |
1.5 ml semi-micro cuvettes | Phenix Research Products | SC-2410 | |
Histopaque density gradient, specific gravity 1.077 | Sigma | 10771 | |
Histopaque density gradient, specific gravity 1.119 | Sigma | 11191 | |
Bovine Serum Albumin Fraction V | Roche | 3117405001 | fatty-acid ultra-free |
Phorbol 12-myristate 13-acetate | Sigma | P8139 | |
XF24 FluxPak | Seahorse Biosciences | 100850-001 | |
DMEM | Fisher | MT90113PB | w/o Glucose, L-Glutamine, Pyruvate, Phenol Red, and Bicarbonate |
L-Glutamine, 200mM (100x) | Invitrogen | 25030-081 | |
D-Glucose | Sigma | G7528 | |
Sodium Pyruvate | Sigma | P8574 | |
Cell-Tak (cell adhesive) | BD Biosciences | CB-40242 | |
Oligomycin | Sigma | O4876 | |
Antimycin A | Sigma | A8674 | |
(FCCP) Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone | Sigma | C-2920 | |
DC Protein Assay Reagent A | Bio-Rad | 500-0113 | |
DC Protein Assay Reagent S | Bio-Rad | 500-0015 | |
DC Protein Assay Reagent B | Bio-Rad | 500-0114 | |
Equipment | Vendor | Product # | Comments/Description |
Seahorse | Seahorse Biosciences | ||
QuadroMACS Separator and MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-090-976 and 24039 | |
Spectrophotometer |