रक्त leukocytes और प्लेटलेट्स एक व्यक्ति के समग्र bioenergetic स्वास्थ्य के एक मार्कर के रूप में इस्तेमाल किया और इसलिए रोग प्रक्रियाओं और उपचार के प्रभाव पर नजर रखने की क्षमता है किया जा सकता है. यहाँ हम mitochondrial समारोह और इन कोशिकाओं में oxidative फट अलग करने और मापने के लिए एक विधि का वर्णन.
Mitochondrial रोग atherosclerosis, मधुमेह, सेप्टिक सदमे, और neurodegenerative रोगों लेकिन चुनौती दे रहा है रोगियों में bioenergetic समारोह में परिवर्तन का आकलन करने के रूप में रोग की स्थिति की एक संख्या में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के लिए जाना जाता है. मधुमेह या वर्तमान atherosclerosis जैसे रोगों चिकित्सकीय विशिष्ट अंग हानि के साथ, इस तरह के hyperglycemia या सूजन के रूप में विकृति के प्रणालीगत घटकों, leukocytes या प्लेटलेट्स प्रचलन में bioenergetic समारोह को बदल सकता है. इस अवधारणा को कुछ समय के लिए स्वीकार किया गया है, लेकिन इसके व्यापक आवेदन bioenergetic विश्लेषण के लिए आवश्यक प्राथमिक कोशिकाओं की बड़ी संख्या से विवश कर दिया गया है. यह तकनीकी सीमा कोशिकाओं microplates के लिए सक्रियण के बिना संलग्न करने की अनुमति दे जो चुंबकीय मनका अलगाव तकनीक, कोशिका आसंजन तकनीक, की विशिष्टता के संयोजन के द्वारा दूर किया गया है, और नई प्रौद्योगिकियों की संवेदनशीलता उच्च throughput mic के लिए बनाया गयाroplate respirometry. इस उपकरण का एक उदाहरण के बाह्य प्रवाह विश्लेषक है. इस तरह इंस्ट्रूमेंटेशन आमतौर पर तब चयापचय से संबंधित हो सकते हैं जो पक्षपाती कोशिकाओं में इन मानकों में परिवर्तन की दर को मापने के लिए ऑक्सीजन और पीएच संवेदनशील जांच का उपयोग करता है. यहाँ विस्तार से मानव रक्त और इन कोशिकाओं में mitochondrial bioenergetic समारोह के विश्लेषण से, सक्रियण के बिना, monocytes, लिम्फोसाइटों, neutrophils और प्लेटलेट्स का अलगाव और चढ़ाना के लिए तरीकों हम. इसके अलावा, हम monocytes और neutrophils में फट ऑक्सीडेटिव भी एक ही नमूनों में मापा जा सकता है कि कैसे प्रदर्शित करता है. इन तरीकों में केवल 8-20 मिलीग्राम मानव रक्त का उपयोग के बाद से वे एक नैदानिक सेटिंग में प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों पीढ़ी और bioenergetics की निगरानी के लिए की क्षमता है.
प्रतिरक्षा कोशिकाओं (monocytes, लिम्फोसाइटों, neutrophils) और रक्त से प्लेटलेट्स की bioenergetic स्वास्थ्य की निगरानी के लिए एक व्यक्ति के समग्र bioenergetic स्वास्थ्य का आकलन करने के लिए एक संभावित रूप से उपयोगी नैदानिक उपकरण के रूप में कुछ समय के लिए स्वीकार किया गया है. इस तरह के कैंसर, हृदय रोग और mitochondrial रोग 1,2 के लिए neurodegenerative रोगों जैसे रोगों के एक नंबर के हवाले से साहित्य की एक उभरती शरीर है. Mitochondrial रोग समर्थक भड़काऊ संकेत दे रास्ते को बढ़ावा देने या कोशिका मृत्यु के लिए नेतृत्व कि सेलुलर घटनाओं की एक श्रृंखला शुरू कर सकते हैं क्योंकि यह चिकित्सकीय महत्वपूर्ण है. कई अध्ययनों से ऐसे fibromyalgia, मधुमेह, सेप्टिक सदमे, और अल्जाइमर रोग 3-7 जैसी स्थितियों में परिधीय रक्त mononuclear कोशिकाओं और प्लेटलेट्स की mitochondrial समारोह की विशेषता है. उदाहरण के लिए, हाल ही में एक अध्ययन mitochondrial समारोह के लिए एक मार्कर के रूप में प्लेटलेट्स के bioenergetics का मूल्यांकन किया और पाया कि टाइप 2 Diabet से प्लेटलेट्सआईसी रोगियों mitochondrial ऑक्सीजन की खपत 7,8 कम था. इन निष्कर्षों और दूसरों से, यह वे प्रणालीगत संचलन सर्वेक्षण और स्थानीय और वैश्विक चयापचय परिवर्तनों को प्रतिबिंबित कर सकते क्योंकि monocytes, लिम्फोसाइटों, neutrophils, और प्लेटलेट्स रोग की स्थिति के तहत bioenergetics में परिवर्तन के रूप में किराए मार्करों सेवा कर सकते हैं कि स्पष्ट है. इस दृष्टिकोण शकुन या नैदानिक मूल्य एक उच्च throughput विश्लेषण की पद्धति और सेल तैयार करने के लिए एक सुसंगत विधि आवश्यक है निर्धारित किया जाए.
leukocytes और प्लेटलेट्स में mitochondrial समारोह को मापने के लिए तरीकों पहले से बरकरार कोशिकाओं 4,9 में सेलुलर bioenergetics के mitochondria या मूल्यांकन के अलगाव शामिल है. एक बाह्य प्रवाह (XF) विश्लेषक का उपयोग सेलुलर bioenergetic मूल्यांकन का लाभ कोशिकाओं में mitochondrial समारोह ऐसे प्रोटॉन रिसाव और अधिक से अधिक श्वसन के रूप में अंतर्जात substrates और श्वसन मानकों के साथ स्थापित किया जा सकता हैक्षमता निर्धारित किया जा सकता है. हम और दूसरों प्लेटलेट्स में bioenergetic प्रोफाइल, मानव रक्त से अलग monocytes और लिम्फोसाइटों स्थापित और सेल प्रकार 8 के बीच में तुलना की जा सकती है कि दिखाने के लिए इस तकनीक का इस्तेमाल किया है. इसके अलावा, दोनों neutrophils और monocytes NAPDH oxidases सक्रिय कर रहे हैं, जिसमें एक oxidative फट क्षमता के अधिकारी और superoxide फार्म को ऑक्सीजन की खपत. महत्वपूर्ण बात है, इस मार्ग सहज उन्मुक्ति का एक प्रमुख घटक है और प्रणालीगत सूजन द्वारा संग्राहक है. उदाहरण के लिए, यह ऑक्सीडेटिव फट क्षमता में परिवर्तन एकाधिक काठिन्य, गठिया, और आवर्तक संक्रमण 10,11 के रूप में विभिन्न autoimmune रोग के साथ जुड़े रहे हैं दिखाया गया है. वर्तमान में नैदानिक नमूनों में oxidative फट मापने के लिए कोई उपलब्ध उच्च throughput मात्रात्मक assays कर रहे हैं. Neutrophils और monocytes के ऑक्सीडेटिव फट क्षमता निस्र्पक भी कई patholo के लिए एक महत्वपूर्ण नैदानिक उपकरण के रूप में सेवा कर सकता है क्योंकि यह महत्वपूर्ण हैgies.
प्रमुख तकनीकी चुनौतियों पारंपरिक polarographic तकनीक का उपयोग कर ऑक्सीजन की खपत की माप और अधिक संवेदनशील microplate fluorometric तकनीकों का उपयोग करते समय संलग्न कोशिकाओं का उपयोग करने की आवश्यकता के लिए कम संवेदनशीलता किया गया है. इस व्यावहारिक वीडियो में, हम इन समस्याओं के लिए तकनीकी समाधान का वर्णन. हम विस्तार monocytes, लिम्फोसाइटों, neutrophils, और प्लेटलेट्स और monocytes और मानव रक्त से neutrophils की ऑक्सीडेटिव फट के bioenergetics के अलगाव, चढ़ाना और माप के लिए तरीके. यह तरीका है कि जांचकर्ताओं के लिए bioenergetics और oxidative फट के नैदानिक मूल्यांकन के लिए उपयुक्त है एक रोगी जनसंख्या और ताजा रक्त के नमूने प्राप्त करने के लिए क्षमता के लिए उपयोग.
इस प्रोटोकॉल bioenergetics विश्लेषण के लिए उपयुक्त ढंग से रक्त कोशिका अलगाव के लिए कई आमतौर पर उपयोग की तकनीक का संकलन का प्रतिनिधित्व करता है. प्रस्तुत सन्निहित तकनीक अलग कक्षों पर रखा गया कम से कम तनाव के साथ नियंत्रित मीडिया की स्थिति में कोशिकाओं की बड़ी संख्या को अलग करने की क्षमता के लिए अन्य अलगाव के तरीके (यानी FACS विश्लेषण) के लिए फायदेमंद हैं. यह भी कम से कम रुकावट के साथ लंबा isolations का नुकसान है. इस प्रोटोकॉल नैदानिक सेटिंग और शोधों में extrapolated किया जा सकता है जो मानव विषयों, से प्राथमिक रक्त कोशिकाओं के अलगाव के लिए आधार के रूप में कार्य करता है.
एमएसीएस जुदाई पूरे रक्त से सीधे कोशिकाओं को अलग करने की संभावना प्रदान करता है कि एक विश्वसनीय सेल अलगाव तकनीक है, लेकिन इस विधि एंटीबॉडी का अधिक से अधिक मात्रा की आवश्यकता है और इस विधि में वर्णित के रूप में सभी चार अलग प्रकार की कोशिकाओं के अलगाव के लिए इष्टतम नहीं है. बी वहाँ हैeen कोई सबूत नहीं सक्रियण में एमएसीएस जुदाई परिणामों से leukocytes के सकारात्मक चयन हमारे अलगाव प्रोटोकॉल का उपयोग कर दिखाने के लिए कि. एमएसीएस स्तंभों 50 एनएम superparamagnetic कणों संयुग्मित एंटीबॉडी का उपयोग कर एक चुंबकीय क्षेत्र में लेबल कोशिकाओं की ज़ब्ती से कार्य करते हैं. लेबल कोशिकाओं तो कॉलम बंद eluted हैं. सकारात्मक और नकारात्मक सेलेक्शन तेजी से अलगाव और शुद्धता सुनिश्चित करने के लिए इस प्रोटोकॉल में लागू कर रहे हैं. अपर्याप्त सेल नंबर अलगाव से प्राप्त या शुद्धता सवाल में है, तो और एंटीबॉडी अधिक से अधिक शुद्धता (तालिका 2) में हो सकता है लोकसभा स्तंभ के माध्यम से विक्रेता की शिक्षा और दूसरा बीतने के अनुसार नमूने के लिए जोड़ा जा सकता है. हमारी प्रयोगशाला FACS विश्लेषण 8 से अंतिम सेल निलंबन का विश्लेषण करके मौजूदा प्रोटोकॉल का उपयोग उच्च शुद्धता और चढ़ाना दक्षता पाया.
बाह्य प्रवाह analyzers ओ.टी. के उस पर वास्तविक समय में ऑक्सीजन की खपत और मीडिया अम्लीकरण दोनों की निगरानी करने की क्षमता हैउसके इलेक्ट्रोड. डीपीआई 8 के साथ अवरोध के रूप में दिखाया monocytes और neutrophils में oxidative फट प्रतिक्रिया द्वारा मनाया के रूप में ऑक्सीजन की खपत NADPH oxidase निर्भर है. हम लंबे समय तक isolations या विस्तारित एक्सएफ assays के साथ ऑक्सीडेटिव फट क्षमता में एक समय निर्भर नुकसान देखा है. इस प्रोटोकॉल डिजाइन और विकसित XF24 पर उपयोग के लिए, लेकिन यह भी लगभग एक तिहाई घनत्व बोने XF24 सेल के एक आधा (चित्रा 3) के लिए XF96 के साथ संगत किया गया था.
इस प्रोटोकॉल के डिजाइन में, प्रत्येक तकनीक के लिए मौजूदा प्रोटोकॉल के पालन केवल bioenergetic विश्लेषण के लिए मीडिया की स्थिति को नियंत्रित करने के लिए किए गए संशोधनों के साथ इष्टतम प्रदर्शन के लिए आवश्यक था. तकनीक माहिर के बाद, इस तरह के एक प्रोटोकॉल, उपचार रणनीतियों की विषाक्तता या प्रभावशीलता को मापने की बीमारी की चयापचय विशेषताओं का पता लगाने, और एककेंद्रकश्वेतकोशिका और neut द्वारा ऑक्सीडेंट उत्पादन करने के लिए translational और अनुसंधान अनुप्रयोगों की एक विस्तृत सरणी में इस्तेमाल किया जा सकता हैभड़काऊ शर्तों में rophils.
The authors have nothing to disclose.
लेखकों ग्लोरिया एक Benavides के तकनीकी योगदान को स्वीकार करना होगा. इस काम अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन 13PRE16390001 (एसआर), एनआईएच T32HL07918 (पाकिस्तान), एनआईएच T32HL007457 (टीएम), P30DK056336 (बीकेसी) द्वारा समर्थित किया गया था, NIDDK मधुमेह जटिलताओं कंसोर्टियम (DiaComp, www.diacomp.org) अनुदान DK076169 (subaward VDU), और ओ 'ब्रायन केंद्र P30 DK079337 (वीडीयू).
QuadroMACS Starting Kit incl. QuadroMACS Separator and MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-094-833 | |
CD235a (Glycophorin A) MicroBeads, human | Miltenyi Biotec | 130-050-501 | |
CD61 MicroBeads, human for platelets | Miltenyi Biotec | 130-051-101 | |
CD14 MicroBeads, human for monocytes | Miltenyi Biotec | 130-050-201 | |
CD15 MicroBeads, human for granulocytes | Miltenyi Biotec | 130-046-601 | |
LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
BD Vacutainer ACD Blood collection tubes | Fisher | 02-684-26 | |
RPMI 1640 | Gibco | 11835-030 | with L-glutamine and without phenol red |
Prostaglandin I2, sodium salt | Cayman | 18220 | |
1.5 ml semi-micro cuvettes | Phenix Research Products | SC-2410 | |
Histopaque density gradient, specific gravity 1.077 | Sigma | 10771 | |
Histopaque density gradient, specific gravity 1.119 | Sigma | 11191 | |
Bovine Serum Albumin Fraction V | Roche | 3117405001 | fatty-acid ultra-free |
Phorbol 12-myristate 13-acetate | Sigma | P8139 | |
XF24 FluxPak | Seahorse Biosciences | 100850-001 | |
DMEM | Fisher | MT90113PB | w/o Glucose, L-Glutamine, Pyruvate, Phenol Red, and Bicarbonate |
L-Glutamine, 200mM (100x) | Invitrogen | 25030-081 | |
D-Glucose | Sigma | G7528 | |
Sodium Pyruvate | Sigma | P8574 | |
Cell-Tak (cell adhesive) | BD Biosciences | CB-40242 | |
Oligomycin | Sigma | O4876 | |
Antimycin A | Sigma | A8674 | |
(FCCP) Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone | Sigma | C-2920 | |
DC Protein Assay Reagent A | Bio-Rad | 500-0113 | |
DC Protein Assay Reagent S | Bio-Rad | 500-0015 | |
DC Protein Assay Reagent B | Bio-Rad | 500-0114 | |
Equipment | Vendor | Product # | Comments/Description |
Seahorse | Seahorse Biosciences | ||
QuadroMACS Separator and MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-090-976 and 24039 | |
Spectrophotometer |