Blod leukocytter og blodplater kan anvendes som en markør for bioenergetisk generelle helsen til et individ, og det samme har potensial til å overvåke patologiske prosesser og virkningen av behandlinger. Her beskriver vi en fremgangsmåte for å isolere og måle mitokondriefunksjonen og oksidativ brist i disse cellene.
Mitokondriell dysfunksjon er kjent for å spille en viktig rolle i en rekke patologiske tilstander, slik som aterosklerose, diabetes, septisk sjokk, og nevrodegenerative sykdommer, men vurdering av forandringer i bioenergetisk funksjon hos pasienter er utfordrende. Selv sykdommer slik som diabetes, eller aterosklerose tilstede klinisk med spesifikk organfunksjon, den systemiske komponenter i patologien, slik som hyperglykemi eller inflammasjon, kan endre bioenergetisk funksjon i sirkulerende leukocytter eller blodplater. Dette konseptet har blitt anerkjent for en stund, men dens utbredte programmet har blitt hemmet av det store antallet primærceller som trengs for bioenergetisk analyse. Denne tekniske begrensning er overvunnet ved å kombinere spesifisiteten av de magnetiske perleisoleringsteknikker, celle adhesjons-teknikker, som tillater cellene å være festet uten aktivering på mikroplater, og følsomheten av ny teknologi utviklet for høy gjennomstrømning microplate respirometri. Et eksempel på dette utstyret er det ekstracellulære flux analysator. Slike instrumenter bruker vanligvis oksygen-og pH-sensitive sonder for å måle hastigheter for forandring av disse parametrene i adherente celler, som deretter kan bli relatert til metabolisme. Her har vi detalj de metoder for isolering og platekledning på monocytter, lymfocytter, neutrofiler og blodplater, uten aktivering, fra humant blod og analysen av mitokondriell bioenergetisk funksjon i disse cellene. I tillegg demonstrerer vi hvor den oksidative sprakk i monocytter og neutrofiler kan også måles i de samme prøver. Siden disse metodene bruker bare 8-20 ml blod fra mennesker de har potensial for overvåking av reaktive oksygen arter generasjon og bioenergi i en klinisk setting.
Overvåking av bioenergetisk helsen til immunceller (monocytter, lymfocytter, nøytrofile granulocytter) og blodplater fra blodet har blitt anerkjent for en stund som et potensielt nyttig diagnostisk verktøy for å vurdere den samlede bioenergetisk helsen til et individ. Det er en voksende mengde litteratur tildele en rekke sykdommer så som kreft, kardiovaskulære sykdommer og neurodegenerative sykdommer til mitokondriell dysfunksjon 1,2. Dette er klinisk viktig siden mitokondriell dysfunksjon kan initiere en rekke cellulære hendelser som fremmer pro-inflammatoriske signalveier eller fører til celledød. Flere studier har karakterisert mitokondriell funksjon av perifere mononukleære blodceller og blodplater i forhold, for eksempel fibromyalgi, diabetes, septisk sjokk, og Alzheimers sykdom 3-7. For eksempel, en fersk studie evaluert bioenergi blodplater som en markør for mitokondriefunksjon og funnet at blodplater fra type 2 diabetikeric pasienter hadde redusert mitokondrieoksygenforbruk 7,8. Fra disse funnene og andre, er det klart at monocytter, lymfocytter, nøytrofile og blodplater kan tjene som surrogatmarkører av endringer i bioenergi i henhold patologiske tilstander siden de kartlegge den systemiske sirkulasjonen og kan gjenspeile lokale og globale metabolske endringer. For å finne ut om denne metoden har prognostisk eller diagnostisk verdi en høy gjennomstrømning fremgangsmåte for analyse og en konsistent metode for celle preparat er nødvendig.
Metodene for å måle mitokondrienes funksjon i leukocytter og blodplater har tidligere involvert isolering av mitokondrier eller vurdering av mobilnettet bioenergi i intakte celler 4,9. Fordelen med cellulær bioenergetisk vurdering ved hjelp av et ekstracellulært fluks (XF) analysator er at mitokondriefunksjon i celler kan etableres med endogene substrater og luftveisparametere slik som proton lekkasje og maksimal respiratoriskkapasitet kan bestemmes. Vi og andre har brukt denne teknologien for å vise at bioenergetiske profiler i blodplater, kan monocytter og lymfocytter isolert fra humant blod bli etablert og sammenlignet blant celletyper 8. I tillegg er både neutrofiler og monocytter i besittelse av en oksidativ brist egenskap som NAPDH oksidaser er aktivert og forbruker oksygen for å danne superoksyd. Viktigere, er denne veien en viktig del av medfødt immunitet og er modulert av systemisk inflammasjon. For eksempel har det blitt vist at endringer i oksidativ brist kapasitet er forbundet med en rekke autoimmune sykdommer slik som multippel sklerose, artritt, og tilbakevendende infeksjoner 10,11. For tiden finnes det ikke noen høy gjennomstrømning kvantitative analyser er tilgjengelige for å måle oksidativ brist i kliniske prøver. Dette er viktig siden karakterisere den oksidative burst kapasiteten av nøytrofile og monocytter kan også tjene som et viktig diagnostisk verktøy for flere patholosynergier.
De viktigste tekniske utfordringer vært lav følsomhet for måling av oksygenforbruket ved bruk av konvensjonelle teknikker polarographic og behovet for å bruke festede celler ved bruk av mer følsomme mikro fluorometriske metoder. I denne praktiske video beskrives den tekniske løsning på disse problemer. Vi detalj de metoder for isolering, ving og måling av bioenergetikk av monocytter, lymfocytter, nøytrofile granulocytter og blodplater og den oksidative utbrudd av monocytter og neutrofiler fra menneskeblod. Denne metode er egnet for klinisk vurdering av bioenergetikk og oksidativ brist i undersøkere som har tilgang til en pasientpopulasjon, og evnen til å skaffe frisk blodprøver.
Denne protokollen representerer sammenstilling av flere vanlig anvendte teknikker for blodcelleisolasjon på en måte som passer for bioenergetikk analyse. De sammenhengende teknikkene presentert er en fordel for andre isolasjonsmetoder (dvs. FACS-analyse) for deres evne til å isolere et stort antall celler under kontrollerte betingelser media med minimale påkjenninger som legges på de isolerte celler. Det har den ulempen med lange isoleringer selv med minimale avbrudd. Denne protokollen fungerer som grunnlag for isolering av primære blodceller fra mennesker, som kan ekstrapoleres i kliniske innstillinger og translasjonell forskning.
MACS separasjon er en pålitelig celleisolasjon teknikk som gir mulighet for å isolere celler direkte fra helblod, men krever denne metoden større mengder av antistoff og er ikke optimal for isolering av alle fire forskjellige celletyper som er beskrevet i denne fremgangsmåte. Det har been ingen bevis for å vise at positiv utvelgelse av leukocytter ved MACS atskillelse skyldes i aktivering ved hjelp av vår isolasjon protokollen. MACS-kolonner som virker ved lagring av merkede celler i et magnetisk felt ved hjelp av antistoffer konjugert til 50 nm superparamagnetiske partikler. Merkede celler blir deretter eluert fra kolonnen. Positive og negative valgene er implementert i denne protokollen for å sikre rask isolasjon og renhet. Hvis utilstrekkelig celletall er oppnådd fra isolering eller renhet er aktuelle, kan flere antistoffer tilsettes til prøven i henhold til leverandørens instruksjoner og andre passasje gjennom LS kolonnen kan føre til større renhet (tabell 2). Våre laboratorie funnet høy renhet og pletteringseffektiviteten ved bruk av eksisterende protokoll ved å analysere endelige cellesuspensjoner ved FACS-analyse 8..
Ekstracellulære fluks analysatorer har evnen til å overvåke både oksygenforbruket og media surgjøring i sanntid over det av othennes elektroder. Den oksygenforbruk som observert ved oksidativ brist respons hos monocytter og nøytrofiler er NADPH oksidase avhengig som vist ved inhibering med DPI 8.. Vi har sett en tidsavhengig tap i oksidativ burst kapasiteten med langvarig isoleringer eller utvidet XF-analyser. Denne protokollen ble konstruert og utviklet for bruk på XF24 men er også kompatibelt med XF96 på omtrent en tredjedel til en halvdel av cellen XF24 seeding tetthet (Figur 3).
I utformingen av denne protokollen, ble tilslutning til eksisterende protokoller for hver teknikk er nødvendig for optimal ytelse med endringer gjort utelukkende for å styre medie betingelser for bioenergetisk analyse. Etter å mestre teknikker, kan en slik protokoll brukes i et bredt spekter av translasjonsforskning og forskning applikasjoner å måle toksisitet eller effektiviteten av behandlingsstrategier, utforske metabolske karakteristikker av sykdom, og oxidant produksjon av monocytter og neutrophils i inflammatoriske tilstander.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne ønsker å takke teknisk bidrag på Gloria A Benavides. Dette arbeidet ble støttet av American Heart Association 13PRE16390001 (SR), NIH T32HL07918 (PAK), NIH T32HL007457 (TM), P30DK056336 (BKC), NIDDK diabetiske komplikasjoner Consortium (DiaComp, www.diacomp.org) stipend DK076169 (subaward VDU), og O'Brien senter P30 DK079337 (VDU).
QuadroMACS Starting Kit incl. QuadroMACS Separator and MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-094-833 | |
CD235a (Glycophorin A) MicroBeads, human | Miltenyi Biotec | 130-050-501 | |
CD61 MicroBeads, human for platelets | Miltenyi Biotec | 130-051-101 | |
CD14 MicroBeads, human for monocytes | Miltenyi Biotec | 130-050-201 | |
CD15 MicroBeads, human for granulocytes | Miltenyi Biotec | 130-046-601 | |
LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
BD Vacutainer ACD Blood collection tubes | Fisher | 02-684-26 | |
RPMI 1640 | Gibco | 11835-030 | with L-glutamine and without phenol red |
Prostaglandin I2, sodium salt | Cayman | 18220 | |
1.5 ml semi-micro cuvettes | Phenix Research Products | SC-2410 | |
Histopaque density gradient, specific gravity 1.077 | Sigma | 10771 | |
Histopaque density gradient, specific gravity 1.119 | Sigma | 11191 | |
Bovine Serum Albumin Fraction V | Roche | 3117405001 | fatty-acid ultra-free |
Phorbol 12-myristate 13-acetate | Sigma | P8139 | |
XF24 FluxPak | Seahorse Biosciences | 100850-001 | |
DMEM | Fisher | MT90113PB | w/o Glucose, L-Glutamine, Pyruvate, Phenol Red, and Bicarbonate |
L-Glutamine, 200mM (100x) | Invitrogen | 25030-081 | |
D-Glucose | Sigma | G7528 | |
Sodium Pyruvate | Sigma | P8574 | |
Cell-Tak (cell adhesive) | BD Biosciences | CB-40242 | |
Oligomycin | Sigma | O4876 | |
Antimycin A | Sigma | A8674 | |
(FCCP) Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone | Sigma | C-2920 | |
DC Protein Assay Reagent A | Bio-Rad | 500-0113 | |
DC Protein Assay Reagent S | Bio-Rad | 500-0015 | |
DC Protein Assay Reagent B | Bio-Rad | 500-0114 | |
Equipment | Vendor | Product # | Comments/Description |
Seahorse | Seahorse Biosciences | ||
QuadroMACS Separator and MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-090-976 and 24039 | |
Spectrophotometer |