Eine der Hauptvorteile des Arbeitens mit Zebrabärblingen (Danio rerio) ist dass ihre Genetik leicht durch die Mikroinjektion von Embryonen im Frühstadium verändert werden kann. Mit diesem Verfahren können Lösungen, welche genetisches Material oder Genabschaltungskonstrukte enthalten, in die Blastomeren eingefügt werden: also in die embryonalen Zellen, welche auf dem Dottergelb des neu befruchteten Eies sind. Die Lieferung in das Zytoplasma erfolgt entweder durch die direkte Injektion in den Blastomer, oder durch natürliche zytoplasmatische Bewegungen, die nach der Injektion in das Dottergelb, auftreten. Nach erfolgreichen genetischen Manipulationen quantifiziert man normalerweise die embryonalen Phänotypen, um die genetischen Mechanismen der Entwicklung zu verstehen.
Dieses Video gibt eine Einführung in Mikroinjektionsverfahren in Zebrabärblingsembryos. Diese Einführung wiederholt zuerst die grundlegenden Komponenten für dieses Verfahren, einschließlich der Injektionsausrüstung und dem Mikroinjektor, welcher die Bewegung der Flüssigkeit mit Luftdruckpulsen kontrolliert. Danach werden die wichtigsten Schritte zur Vorbereitung eingeführt, wie zum Beispiel das Gießen der Agarplatten, um die Embryonen während der Injektion stabil zu halten, und der Kalibrierung der Mikroinjektionsausrüstung. Danach wird das Injektionsverfahren erläutert, und wir geben wichtige Hinweise wann und wo Injektionen ausgeführt werden sollen. Zum Schluss werden Anwendungen des Mikroinjektionsverfahrens erläutert, wie beispielsweise die Überexprimierung eines Gens mit mRNA, die Genabschaltung durch die Einfügung von Morpholino Oligonukleotiden, und die Herstellung von transgenen Zebrabärblingen mit speziell gestalteter Plasmid-DNA.
Procedure
Mikroinjektionen von Zebrabärblingen ermöglichen es Forschern Lösungen direkt in den sich entwickelnden Embryo einzufügen, um die Genfunktion und die Entwicklungsdynamik zu untersuchen. Embryos des 1-4 Zellenstadiums werden oft für die Injektion benutzt. Da es keine separierenden Membranen gibt, welche den Dottersack und die Zellen in diesem zeitigen Stadium trennt, werden Lösungen direkt entweder in eine Zelle oder in den Dottersack gespritzt und verbreiten sich dann durch den ganzen Organismus. Durch die Mikroinjek…