Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.
The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.
Optogenetics har revolutioneret systemer-niveau neurovidenskab i sin søgen efter de neurale kredsløbselementer køre normale og sygdomsrelaterede relevant adfærdsmæssige tilstande. Opdagelsen af, at lysfølsomme mikrobielle opsiner 1 kan udtrykkes funktionelt i mammale celler billede platformen for at bruge lys til at opnå en hidtil uset kontrol af neural aktivitet med høj rumlig og tidsmæssig præcision 2. I modsætning til traditionelle elektrofysiologiske eller farmakologiske metoder til manipulation af neural aktivitet, optogenetics giver mulighed for kontrol af specifikke celletyper (baseret på genetisk identificere eller fysisk projektion) inden heterogene populationer og fysiologisk relevante tidshorisonter. Den efterfølgende indførelse af en neural-optisk interface forudsat et praktisk redskab til levering af lys til at opføre dyr 3. Det har givet mulighed for real-time modulation af definerede neurale kredsløb i vågen opfører gnavere for at kausalt testerolle af disse neurale kredsløb i styringen af adfærdsmæssige tilstande relevante for neurologiske og psykiatriske sygdomme 4-6. Optogenetics derfor er et effektivt redskab til indføring i alle laboratorier interesseret i at undersøge den funktionelle sammenhæng mellem hjernens aktivitet og adfærdsmæssige eller fysiologiske foranstaltninger i dyremodeller.
Vellykket design og afslutning af en optogenetic eksperiment involverer forskellige trin og overvejelser (se figur 1). Målet med den nuværende protokol er at give den enkelte med de værktøjer og komponenter, sammen med den teoretiske og praktiske viden, som er nødvendig for at udføre optogenetic stimulation i vågen opfører gnavere. I øjeblikket er der to dominerende bølgelængdeområder beregnet til aktivering mikrobielle opsin kanaler: i det blå spektre (almindeligvis 473 nm) og grøn-gul spektre (almindeligvis 532 eller 591 nm). Begge lasere og lysemitterende dioder (LED), kan anvendes som lyskilder til deliver specifikke bølgelængder af lys til hjernevæv. Den ikke-kohærent lys, der udsendes af lysdioder, gør det imidlertid effektiv lystransmission svært, når kobling ind i de små kerne fibre, der er nødvendige til in vivo gnaver stimulation. Om passende laser samling er et afgørende første skridt og vil afhænge af den tilsigtede anvendelse af optogenetics i laboratoriet. Den nuværende protokol beskriver to grundlæggende konfigurationer, der afviger i deres lette montering og brug: single pre-koblede lasere og dobbelt lasersystemer (se figur 2). Enkelt laser systemer, der er præ-koblet af fabrikanten er i det væsentlige klar til at gå ved ankomst med lidt at ingen opsætning nødvendig, men har den ulempe, minimal slutbruger tilpasning. En dobbelt lasersystem muliggør levering af to forskellige bølgelængder ned i samme fiber. Dette vil blive stadig vigtigere med fremkomsten af kombinatorisk optogenetics hvorved forskellige bølgelængder kan bruges til at aktivere / hæmme sondringt celletyper, der er rumligt co-lokaliseret. Det er også vigtigt til brug med bi-stabile trinfunktion opsiner hvor fotostrømmen indledes og afsluttes ved blå og gule lys henholdsvis 7,8. Dual laser systemer er også tilpasses som brugeren kan tilføje eller fjerne komponenter (fx eksterne skodder, beam filtre, inline power meter) fra strålebanen efter behov. På grund af sin alsidighed, anbefales den dobbelte laser opsætning hvis optogenetics bliver en fortsat redskab i laboratoriet. Kobling af lasere kan dog være en udfordring og så en hurtig, nem og pålidelig kobling mekanisme er fastsat i denne protokol. Bemærk, denne protokol detaljer samling af optiske komponenter og udnytter patchkabler og komponenter, der er optimeret til trin-indeks multimode fibre med en 200 um kerne og en numerisk åbning (NA) på 0,22. Forskellige centrale størrelser og NA kan købes, men alle komponenter bør ideelt set passer i form af kernestørrelse og NA at undgå lystab på fiber forbindelsespunkter. Alternativt, ved en fiberforbindelse kan lys passere fra en mindre til en større kerne størrelse; og / eller fra et lavere-NA til en højere NA fiber uden yderligere tab.
Tethering strategier forudsat at mulighed for samtidig stimulering af flere mus for high-throughput adfærdsmæssig testning. De protokoller antager brug af kroniske implanterbare fibre til adfærdsmæssige test, men kan ændres til akutte stimulationsregimer. Akut implanterede fibre er fordelagtige til at kombinere optogenetic stimulering med farmakologisk manipulation, eftersom den samme kanyle kan anvendes til at levere lægemidler og spidsen af en optisk fiber til den samme placering. Anvendelsen af kronisk implanteret fibre, dog anbefales til flere dages adfærdsmæssig testning, så det reducerer vævsbeskadigelse forbundet med gentagen indføring og fjernelse af fibre og forøger nøjagtigheden i form af ensartet placering af fibre tilvæv belysning 3. Når det kombineres med at tøjre konfigurationer der er beskrevet her, kan adfærd registreres pålideligt på tværs af flere dage. Faktisk har pålidelig lystransmission er rapporteret måneder efter fiber implantation 9 sådan, at kronisk stimulering og adfærdsmæssige test paradigmer kan teoretisk set blive udført på tværs af flere dage og uger. Supplerende bemærkninger vedrørende hardwarekomponenter er blevet tilføjet til protokollen for at tillade læseren valg i det bedste produkt, der passer til deres individuelle behov, herunder omkostningseffektive alternativer og produkter, der kan gøres in-house. Vigtige tips, der er nyttige under opsætning og implementering er også til rådighed.
De nuværende beskrevne laser set-ups og tøjre strategier er kompatible med en bred vifte af gnaver adfærdsmæssige tests. Faktisk har en række adfærdsmæssige tests blevet brugt efter eller ledsager, at in vivo optogenetic stimulation, der omfatter følelsesladet adfærdsmæssige opgaver, adfærdsmæssige conditioning, indlæring og hukommelse paradigmer, søvn, ophidselse og appetitforstyrrelser opgaver nævne et par stykker (se Nieh et al. 6 for en omfattende gennemgang). Optogenetics har ændret den måde traditionelle adfærdsmæssige test udføres ved, at flere dages studier kan nu koges ned til en enkelt session, hvor adfærd sammenlignes, inden-fag, under forskellige epoker af brændetid 'versus' off »5. Notatet, adfærdsmæssige apparater, der indeholder døråbninger, lukkede rum eller andre forhindringer måske skal modificeres for at passage af bundne fibre.
Den beskrevne tøjre strategier tillader siøde- stimulering af multipel mus fra en enkelt laser. High throughput optogenetic adfærdsmæssige test kan derfor opnås ved anvendelse af flere lasere og testudstyr. Antallet af dyr, der samtidig kan stimuleres, vil imidlertid være begrænset af den maksimalt lys effekt, der kan opnås ved hver fiber spids. Maksimal udgangseffekt ved fiberspidsen er afhængig af 1) startkraft af laseren; 2) kobling effektivitet og 3) antal beam splits. For en 100 mW blå laser med ~ 80% koblingseffektivitet og op til 4 beam splits (som vist i figur 4C), gennemsnitlige styrke ved fiber spids kan variere mellem 5-10 mW, når du bruger 200 um kerne, 0,22 NA fiber patchkabler (nb forventer transmissionstab fra roterende leddene at være <15%). Måling lysudbytte på fiberspidsen er afgørende for at bestemme tilstrækkelig lys strøm til opsin aktivering som opsiner forskellige i deres følsomhed over for lys og dermed lyset effekttæthed (mW/ Mm 2), der kræves til aktivering 11. For eksempel den stabile trin-funktion opsin (SSFO) fungerer som en foton akkumulator og derfor kræver meget lidt lys effekttæthed for aktivering (<8 pW / mm 2) 8. Sammenlign dette med den traditionelle kanal rhodopsin (CHR2), der kræver et minimum på 1 mW / mm2 af lys til at fremkalde aktionspotentialer 2. Tabel 1 er tilvejebragt som en hurtig reference til kendte minimum lys bølgelængder, der er nødvendige for at aktivere de mest almindelige opsiner øjeblikket brug. Endelig må man overveje at lette scatters og absorberer som det rejser gennem hjernevæv sådan, at der kræves mere lys magt for dybere hjernens strukturer 3. En nyttig online ressource er tilgængelig på http://www.stanford.edu/group/dlab/cgi-bin/graph/chart.php der vil beregne lysintensitet ved forskellige dybder gennem hjernevæv ved at tagetegner fiberkernen størrelse, numerisk åbning, bølgelængde af lys, der anvendes, og udgangsmaterialet lyseffekt på fiberspidsen. For en fremragende overblik over de teoretiske principper bag disse beregninger, se Foutz et al. (2012) 12. Eksempler på, hvordan at anvende disse principper og beregninger til eksperimentelle design er demonstreret i Aravanis et al. (2007) 3 og Tye et al. (2012) 13. Udførelse af disse beregninger forud for starten af et forsøg er afgørende for at sikre tilstrækkelig lys bestråling for opsin aktivering. I betragtning af disse overvejelser er det fordelagtigt at købe højere-drevne lasere til at sikre tilstrækkelig effekt. Lasere med en effekt mellem 100-200 mW er generelt tilstrækkelige til at kompensere for lille kerne fibre, flere fibre opdeling, kobling ineffektivitet og transmission taber 7. Hvis du bruger højeffektlasere skal dog være opmærksom på at undgå neural skade eller varme og lys-associeretU-artefakter, der kan opstå med langvarig og / eller høj powered lys belysning 7. En sikker række til in vivo eksperimenter er op til 75 mW / mm2. 14
Beslutning om den type laser til køb kan være en kompliceret sag, som der er mange faktorer at overveje. For eksempel direkte diodelasere give mere stabil og reproducerbar pulserende output end gør diode-pumpet solid-state (DPSS) lasere, og er mere pålidelige over tid i et laboratoriemiljø. I nogle tilfælde kan imidlertid direkte diodelasere udsender en lavere lyseffekt, ~ 0,1 mW, selv når kommandoen spænding er 0 V på grund af en konstant biasstrøm sendes til diode af laserens styreelektronik. Dette "spontane" emission har et bredere spektrum, end laser emission fra samme laser, så kan specifikt reduceres ved at installere et snævert bånd-pass (eller "oprydning") filter mellem laseren og kobling (se stykliste). Dette filter vil ogsåreducere effekt af ~ 50%, når laseraktive, så købe en højere-drevne laser i overensstemmelse hermed. Det skal bemærkes, at gule DPSS lasere er ekstremt følsomme og kan opføre sig uregelmæssigt og har reduceret levetid hvis hurtigt moduleres af en impulsgenerator. Justering af gul laser magt bør ske gennem eksterne tæthed filter hjul placeret i strålegangen (afsnit 1.7), mens du fører laseren i TTL + mode. Alternativt købe en grøn 532 nm DPSS laser er et omkostningseffektivt alternativ, der kan aktivere både halorhodopsins og archaerhodopsins.
Den numeriske blænde (NA) af en fiber er vigtigt at overveje, når designe og købe fiber komponenter til laser montage set-up. NA for en optisk fiber bestemmer vinklerne af lysstråler, der kan accepteres, og udsendes på spidsen af en fiber. Hvis en højere NA fiber er parret med en lavere NA fiber, vil betydeligt tab forekomme ved denne grænseflade, så det er vigtigt at være konsistent wi th fiber NA inden for et enkelt setup (eller for at sikre, at NA stiger langs strålegangen). Virkningen af fiber NA på mængden af hjernevæv belyst er mindre vigtigt, da hjernevæv er meget spredning, og da lyset koblet fra en laserkilde vil have tendens til "underfill" high-NA fibre; dog optiske fibre med en NA på 0,22 og 0,37 er almindeligt anvendt. Ligeledes vil kobling fra en større kerne til en mindre kerne fiber også resultere i betydelige tab, så altid sørg for at bruge stigende eller lig kerne diametre når skrider fra laserkilden til dyret implantat. Som en generel bemærkning, bør fiber ender altid udjævnet, når den ikke er i brug for at forhindre støv og partikler oprustning. Det er en god idé regelmæssigt at rene fiber ender og stik (70% isopropylalkohol fungerer godt) for at sikre maksimal lys effekt, og for at teste lys effekt gennem en "dummy implantat", før du begynder hver dag eksperimenter.
"> Under adfærdsmæssige test, er det bydende nødvendigt, at der tages skridt til at kontrollere for effekten af virusinfektion, exogent proteinekspression, synligt lys, og mulige virkninger opvarmning af væv og artefakter på dyrs adfærd. Derfor bør den rette kontrolgruppe består af dyr transduceret med en kontrol-virus (f.eks GFP, EYFP, mCherry), som modtager samme lys stimuleringsparametre. Eksperimentel verifikation er et afgørende sidste skridt som de adfærdsmæssige data, der anvendes til analyse er helt afhængig af en ordentlig opsin og fiberoptiske placering i området af interesse . Specifikt i dyr, hvor der ikke detekteres immunhistokemisk signal, eller hvis placering af signal finhed ikke er i området af interesse, så adfærdsmæssige data for dette dyr bør fjernes fra forsøget. Derudover er det vigtigt at teste lysudbytte på fiberspidsen både før kirurgisk implantation og igen post-mortem at sikre tilstrækkelig lys strøm til opsin aktivering. I animals hvor alvorligt lystab er indtruffet gennem fiberen efter eksperimenter (> 30%) 9, bør data for dette dyr overvejes til fjernelse. Kriterier for udsendelse bør der oprettes på forhånd. Endelig må man overveje impulsfrekvensen kræves for at modulere neural fyring, som vil afhænge af hjernens struktur og neuronale undertyper bliver målrettet. Udgivet optogenetic lys stimuleringsparametre eksisterer for flere neuronale undertyper, bør dog evnen til at modulere neurale fyring uafhængigt bekræftet gennem in vivo eller hjerne skive elektrofysiologiske optagelser.Som man bliver dygtig med laser brug og ændring af laser set-ups, kan kombinationer af forskellige bølgelængder opbindes til flere fibre på et enkelt dyr eller leveres ned samme fiber for kombinatorisk optogenetics 8. Multi-bølgelængde stimulation vil blive stadig vigtigere i betragtning af den hurtige udvikling af rød-skifted channelrhodopsins 8, engineering af blå-skiftet hyperpolarisering opsiner 15, brug af bistabile trin-funktion opsiner 8,16,17, og den generelle voksende liste over opsiner med tydelig aktivering spektre 11. Denne udvidelse af optogenetic værktøjskasse vil tillade hidtil uset kontrol af flere neurale undertyper både inden for og på tværs af hjerneområder til at bestemme deres rolle i regulerer komplekse adfærdsmæssige tilstande.
The authors have nothing to disclose.
These studies were funded by grants received from the NIH (MH082876, DA023988).
1. Laser Set-up | ||||
Name of Equipment | Company | Quantity | Catalog Number | Comments |
100mW 473nm or 488nm Diode Laser System , <2% Stability | Omicron | 1 | Luxx/Phoxx 473/488-100 | Optional accessory includes a remote control box with key switch and LED Display |
100mW 594nm DPSS laser | Colbolt | 1 | 0594-04-01-0100-300 | 04-01 series yellow laser; sensitive to back-reflection from fibers |
200mW 532nm DPSS laser; 5% power stability | Shanghai Lasers | 1 | GL532T3-200 | Cost-effective alternative to yellow DPSS laser for activation of halorhodopsins and archaerhodopsins |
Non-contact style laser to multimode fiber coupler | OZ Optics | 1 | HPUC-23-400/700-M-20AC-11 | For use with dual laser set-up; Specs: 33mm OD for 400-700nm; FC receptacle, f=20mm lens with post mount laser head adapter #11 |
Aluminum breadboard, 12" x 18" x 1/2", 1/4"-20 Threaded | Thorlabs | 1 | MB1213 | For dual laser system |
Aluminum breadboard, 10" x 12" x 1/2". 1/4"-20 Threaded | Thorlabs | 1 | MB1012 | For single laser system |
Aluminum breadboard, 4" x 6" x 1/2", 1/4"-20 Threaded | Thorlabs | 2 | MB4 | For blue laser; dual laser system |
Compact variable height clamp, 1/4"-20 Tapped | Thorlabs | 4 | CL3 | |
3/4" stainless post | Thorlabs | 1 | TR075 | |
1" stainless post | Thorlabs | 4 | TR1 | |
Post holder with spring-loaded hex-locking thumbscrew | Thorlabs | 2 | PH1 | |
Pedestal Base Adapter | Thorlabs | 3 | BE1 | |
Small Clamping Fork | Thorlabs | 3 | CF125 | |
Kinematic mount for 1" optics with visible laser quality mirror | Thorlabs | 3 | KM100-E02 | |
Neutral filter density wheel | Thorlabs | 1 | NDC-50C-2M | |
1" Longpass dichroic mirror 50% | Thorlabs | 1 | DMLP505 | |
Kinematic mount for 1" optics | Thorlabs | 1 | KM100 | For dichroic mirror |
20-piece hex wrench kit with stand | Thorlabs | 1 | TC2 | |
1/4"-20 cap screw and hardware kit | Thorlabs | 1 | HW-KIT2 | |
Mounting base 1" x 2.3"x3/8" | Thorlabs | 1 | BA1S | |
FC/PC to FC/PC L-Bracket mating sleeve | Thorlabs | 2 | ADAFCB1 | Dual FC/PC L-bracket also available |
Breadboard lifting handles | Thorlabs | 3 | BBH1 | |
Ø1" Bandpass Filter, CWL = 450 ± 2 nm, FWHM = 10 ± 2 nm | Thorlabs | 1 | FB450-10 | For use with diode lasers that spontaneously emit |
2. Laser Coupling | ||||
Name of Equipment | Company | Quantity | Catalog Number | Comments |
! Laser protective eyewear | Various | One for every user at each wavelength | ! Consult with laser provider to ensure proper selection of eyewear that will provide maximal light attenuation for the purchased laser | |
Fiber optic cable tester | Eclipse | 1 | 902-186N | |
One-step fiber connector cleaner | Thorlabs | 1 | FBC1 | |
Coupler patch cord (0.75 meter) | Thorlabs | 1 | 0.75m 200um core, 0.22NA, FC/PC connectors multimode fibers | For dual laser system |
Coupler patch cord (0.5 meter) | Thorlabs | 1 | 0.5m 200um core, 0.22NA, FC/PC connectors, multimode | For single laser system |
Doric mini cube | DORIC | 2 | DMC_1x2_FC-2FC | |
Compact power and energy meter console | Thorlabs | 1 | PM100D | Digital 4" LCD |
C-series slim power sensor 5-500mW | Thorlabs | 1 | S130C | Multiple detectors types are available; check with vendor |
3. In vivo Optogenetic Stimulation | ||||
Name of Equipment | Company | Quantity | Catalog Number | Comments |
Multimode fiber splitters | FONT Canada | 2 | Large core fiber optic 1 X 2 splitter, 50/50 ratio, FC connectors, ruggedized | Length, core size and numerical aperture can be specified when ordering; cost-effective smaller core sizes available |
Arbitrary waveform function generator (2 channel) | Rigol | 1 | DG1022 | Can control up to 2 lasers at once |
Fiber optic rotary joint (commutator) | DORIC* | 6 to 8 | FRJ_1X1_FC-FC | *Also available through Thorlabs and Prizmatix |
Animal patch cords (Custom Mono Fiberoptic Cannula with 10mm ferrules, FC/PC connector) | DORIC | 8 | MFP_200/240/900-0.22_2m_FC-MF2.5 | Length, core size and numerical aperture can be specified when ordering; alternatively, these can be made custom made in-house (see Sparta et al. 2012)9. |
PFP ceramic split sleeve, 2.5mm ID, 11.40mm length (25/pkg) | Precision fiber Products | 1 | SM-CS1140S | Used for attaching implanted fiber optic on animal to a light-delivering fiber patch cord with flat cleeve (FC) end |
Clear dust caps for Ø2.5 mm ferrules (25/pkg) | Thorlabs | 1 | CAPF | |
Metal cap for FC/PC and FC/APC mating sleeves | Thorlabs | 2 | CAPF1 | |
Thick-jacketed patch cords (custom order) | Thorlabs | 4 | 200um core, 0.22NA, FC/PC connectors multimode fibers | Length, core size, and numerical aperture can be specified when ordering |