Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.
The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.
Optogenetics har revolusjonert systemer-nivå nevrovitenskap i sin søken etter de nevrale kretser kjøre normale og sykdoms relevant atferds stater. Oppdagelsen av at lysfølsomme mikrobielle opsins en kunne være funksjonelt uttrykt i pattedyrceller gitt plattformen for å bruke lys for å få enestående kontroll av nevral aktivitet med høy romlig og tidsmessig presisjon 2. I motsetning til tradisjonelle elektrofysiologiske og farmakologiske metoder for manipulering av nevral aktivitet, tillater optogenetics for kontroll av spesifikke celletyper (basert på genetiske identifisere eller romlig spring) i heterogene populasjoner og på fysiologisk relevante tidsrammer. Den påfølgende innføringen av en nevral-optisk grensesnitt gitt et praktisk verktøy for levering av lys til å oppføre dyr 3. Dette har gjort det mulig for sanntids modulering av definerte nevrale kretser i våken oppfører gnagere for å årsaks testerollen til disse nevrale kretser i styringen av atferdstilstander som er relevante for nevrologisk og psykiatrisk sykdom 4-6. Optogenetics derfor representerer et kraftig verktøy for innføring i ethvert laboratorium interessert i å undersøke den funksjonelle sammenhengen mellom hjerneaktivitet og atferdsmessige eller fysiologiske tiltak i dyremodeller.
Vellykket design og gjennomføring av en optogenetic eksperiment innebærer ulike trinn og hensyn (se figur 1). Målet med den gjeldende protokollen er å gi enkeltpersoner med de verktøy og komponenter, sammen med teoretisk og praktisk kunnskap, er nødvendig for å utføre optogenetic stimulering i våken oppfører gnagere. For tiden er det to dominerende bølgelengdeområder som brukes for å aktivere mikrobielle opsin kanaler: i det blå-spektra (vanligvis 473 nm) og grønn-gul-spektra (vanligvis 532 eller 591 nm). Både lasere og lysdioder (LED) kan brukes som lyskilder til deliver bestemte bølgelengder av lys til hjernevev. Den ikke-koherent lys som emitteres av LED-enhetene, men gjør effektiv overføring av lys vanskelig når kopling inn i de små kjernefibre som kreves for in vivo-gnager stimulering. Bestemme passende laser montering er et viktig første skritt, og vil avhenge av tiltenkt bruk av optogenetics i laboratoriet. Den nåværende protokoll beskriver to grunnleggende utforminger som varierer i deres lette montering og bruk: enkle forhåndskoblet med to lasere og lasersystemer (se figur 2). Enkeltlasersystemer som er pre-kombinert av produsenten er i hovedsak ready-to-go ved ankomst med liten eller ingen oppsett er nødvendig, men har den ulempen med minimal sluttbruker tilpasning. En dual lasersystem muliggjør levering av to ulike bølgelengder ned samme fiber. Dette vil bli stadig viktigere med bruk av kombi optogenetics der ulike bølgelengder kan brukes til å aktivere / hemme distinct celletyper som er romlig samlokalisert. Dette er også avgjørende for bruk med bi-stabile vise funksjons opsins hvor photocurrents er initiert og avsluttes av blått og gult lys, henholdsvis 7,8. Dual laser systemer er også tilpasses som brukeren kan legge til eller fjerne komponenter (f.eks eksterne skodder, bjelke filtre, inline kraft meter) fra strålebanen etter behov. På grunn av sin allsidighet, er det dobbel laser oppsett anbefales hvis optogenetics kommer til å være en fortsatt verktøy som brukes i laboratoriet. Kobling av lasere, derimot, kan være en utfordring, og så en rask, enkel og pålitelig koblingsmekanisme er gitt i denne protokollen. Merk, denne protokollen beskriver montering av optiske komponenter og utnytter patch ledninger og komponenter som er optimalisert for steg-indeksen flermodusfibere med en 200 mikrometer kjerne og en numerisk apertur (NA) på 0,22. Ulike kjerne størrelser og NA er tilgjengelig for kjøp, men alle komponenter bør passe perfekt sammen i form av kjernestørrelse og NA å unngå lystap ved fiberkontaktpunktene. Alternativt, ved en fiberforbindelse, kan lyset passere fra en mindre til en større kjernestørrelse; og / eller fra en lavere til en høyere NA NA-fiber uten ytterligere tap.
Tethering strategier er gitt som gir mulighet for samtidig stimulering av flere mus for høy gjennomstrømming atferds testing. Protokollene som tilbys anta bruk av kroniske implanterbare fibre for adferdstesting, men kan modifiseres for akutte stimuleringsregimer. Akutt implanterte fibre er fordelaktige for å kombinere optogenetic stimulering med farmakologisk manipulasjon, siden den samme kanyle kan brukes til å levere medikamenter og spissen av en optisk fiber til det samme sted. Anvendelsen av kronisk implanterte-fibre er imidlertid sterkt anbefalt for flere dagers adferdstesting som det reduserer vevskade assosiert med gjentatt innsetting og fjerning av fibrer og øker nøyaktigheten i form av konsistent anbringelse av fiberen forvev belysning tre. Når det kombineres med tethering konfigurasjoner som er beskrevet her, kan atferden bli registrert pålitelig over flere dager. Faktisk har pålitelig lysgjennomgang blitt rapportert måneder etter fiber implantasjon 9 slik at kronisk stimulering og atferds testing paradigmer kan teoretisk bli gjennomført over flere dager og uker. Flere merknader om maskinvarekomponentene har blitt lagt til i protokollen for å gi leseren valg i det beste produktet som passer deres individuelle behov, herunder kostnadseffektive alternativer og produkter som kan gjøres internt. Viktige tips som er nyttige under oppsett og gjennomføring er også gitt.
Dagens beskrevet laser set-ups og tethering strategier er kompatibel med et bredt spekter av gnager atferdstester. Faktisk har en rekke atferdstester blitt brukt følgende, eller medfølgende, til in vivo optogenetic stimulering som inkluderer emotive atferds oppgaver, atferds conditioning, læring og hukommelse paradigmer, søvn, opphisselse, og appetitive oppgaver nevne noen (se Nieh et al. 6 for en omfattende gjennomgang). Optogenetics har endret måten tradisjonelle atferds tester er utført ved at flere-dagers studier kan nå kondenseres til en enkelt sesjon i hvilken atferd sammenlignes, innenfor-fagene, under forskjellige epoker av lys 'på' versus 'off' 5. Av notatet, atferds apparater som inneholder døråpninger, lukkede avdelinger eller andre hindringer kan måtte endres for å imøtekomme passering av tethered fibre.
Den beskrevne tethering strategier tillatelse sien samtidig stimulering av multiple mus fra en enkelt laser. Høy gjennomstrømning optogenetic atferds testing kan derfor oppnås gjennom bruk av flere lasere og testing av utstyr. Antallet dyr som kan stimuleres samtidig, vil imidlertid være begrenset av den maksimale kraft som lett kan oppnås ved hver fiberenden. Maksimal effekt på fiberenden er avhengig av 1) startkraft av laseren; 2) kobling effektivitet og 3) antall bjelke splittelser. For en 100 mW blå laser med ~ 80% kopling effektivitet og opptil 4 stråle spagaten (som avbildet i Figur 4C), gjennomsnittlig strøm på fiber spissen kan variere mellom 5-10 mW ved bruk av 200 mikrometer core, 0,22 NA fiber patch ledninger (nb forventer tap ved overføring fra roterende ledd for å være <15%). Måling av lysmengden på fiberenden er avgjørende for bestemmelse av tilstrekkelig lys kraft for opsin aktivering som opsins varierer i lysfølsomhet og derfor lyset strømtetthet (mW/ Mm 2) som kreves for aktivering 11. For eksempel, den stabile trinn-funksjon opsin (SSFO) virker som en foton akkumulator og krever derfor svært lite lys effekttetthet for aktivering (<8 μW / mm 2) 8. Sammenligne dette med den tradisjonelle kanalen rhodopsin (ChR2) som krever minimum 1 mW / mm 2 av lys for å lokke fram aksjonspotensialer 2. Tabell 1 er gitt som en hurtigreferanse for kjente minimums lys irradianser kreves for å aktivere de vanligste opsins tiden i bruke. Til slutt, må man vurdere at lys blir spredt og absorberer som den reiser gjennom hjernevevet slik at mer lys kraft er nødvendig for dypere strukturer i hjernen tre. En nyttig online ressurs er tilgjengelig på http://www.stanford.edu/group/dlab/cgi-bin/graph/chart.php som skal beregne lysintensiteten på ulike dyp gjennom hjernevev ved å ta innutgjøre fiberkjernestørrelse, numerisk apertur, bølgelengden til lyset som brukes, og det anvendte utgangs lys kraft på fiberenden. For en utmerket oversikt over de teoretiske prinsippene bak disse beregningene, se Foutz et al. (2012) 12. Eksempler på hvordan du bruker disse prinsipper og beregninger til eksperimentell design er demonstrert i Aravanis et al. (2007) tre og Tye et al. (2012) 13. Utføre disse beregningene før starten av et eksperiment er avgjørende for å sikre tilstrekkelig lys irradians for opsin aktivering. Gitt disse hensyn, er det fordelaktig å kjøpe høyere-drevet laser for å sikre tilfredsstillende effekt. Lasere med en utgangseffekt på mellom 100 til 200 mW er generelt tilstrekkelig til å kompensere for små kjernefibre, multiple fiber splitting, koblings ineffektivitet og overføring taper 7. Hvis du bruker høy effekt lasere, men forsiktighet må tas for å unngå nerveskade eller varme og lys-medarbeiderd gjenstander som kan oppstå ved langvarig og / eller høy drevet lys belysning 7. Et sikkert område for in vivo-eksperimenter er opp til 75 mW / mm2. 14
Bestemme på hvilken type laser til kjøp kan være en komplisert sak som det er mange faktorer å vurdere. For eksempel lede diode lasere gi mer stabil og repeterbare pulsutgang enn gjør diode-pumpet solid-state (DPSS) lasere, og er mer pålitelig over tid i en lab miljø. I noen tilfeller kan imidlertid direkte diodelasere avgir en lavere lyseffekt, ~ 0,1 mW, selv når ledespenning er 0 V på grunn av en konstant forspenning strøm blir sendt til dioden ved laserstyringselektronikk. Denne "spontan" emisjon har et bredere spekter enn det laser utslipp fra den samme laseren, så kan spesielt reduseres ved å installere et smalt bånd-pass (eller 'opprydding') filter mellom laser og kobleren (se liste deler). Dette filteret vil ogsåredusere strømproduksjonen med ~ 50% når lasing, så kjøpe en høyere-drevet laser tilsvarende. Det bør bemerkes at gule dpss lasere er ekstremt sensitiv og kan virke uregelmessig og har redusert levetid hvis hurtig modulert av en pulsgenerator. Justering av gule laser makt bør gjøres gjennom eksterne tetthet filter hjul plassert i strålebanen (punkt 1.7) når du bruker laseren i TTL + modus. Alternativt kjøpe en grønn 532 nm DPSS laser er et kostnadseffektivt alternativ som kan aktivere begge halorhodopsins og archaerhodopsins.
Den numeriske apertur (NA) av en fiber er viktig å vurdere når du utformer og kjøpe fiber komponenter for laser montering set-up. NA av en optisk fiber bestemmer vinklene av lysstrålene som kan aksepteres, og slippes ut i spissen av en fiber. Hvis en høyere-NA fiber er parret med et lavere-NA fiber, vil betydelig tap finne sted på dette grensesnitt, så det er viktig å være konsistent wi th fiber NA innenfor et enkelt oppsett (eller for å sikre at NA øker langs lysbanen). Virkningen av fiber NA på volumet av hjernevev belyst er mindre viktig, siden hjernevev er meget spredning, og siden lyset koplet fra en laserkilde vil ha en tendens til å "underfylling" high-NA-fibre; imidlertid optiske fibre med en NA på 0,22 og 0,37 er ofte brukt. Tilsvarende kobling fra en større-core til en mindre-core fiber vil også resultere i betydelige tap, så alltid være sikker på å bruke økende eller lik kjernediametere når framdrift fra laserkilden til dyret implantatet. På et generelt notat, bør fiber ender alltid bli avkortet når den ikke er i bruk for å hindre at støv og partikler oppbygging. Det er en god idé å regelmessig rene fiberender og kontakter (70% isopropylalkohol fungerer godt) for å sikre maksimal lys effekt, og for å teste lys effekt gjennom en "dummy implantat" før du starter hver dag med eksperimenter.
"> Under atferds testing, er det viktig at det treffes tiltak for å kontrollere for effekten av viral infeksjon, eksogene protein uttrykk, synlig lys, og mulige vev oppvarming effekter og gjenstander på dyrs atferd. Derfor bør den riktige kontrollgruppe består av dyr transdusert med en kontrollvirus (f.eks, GFP, EYFP, mCherry) som mottar identiske lys stimuleringsparametere. Eksperimentell verifisering er et avgjørende avsluttende trinn som de atferdsdata som brukes for analysen er helt avhengig av riktig opsin og fiberoptisk plassering i regionen av interesse . Nærmere bestemt, i dyr, hvor ingen immunhistokjemisk signal blir detektert, og hvor plassering av signal eller fibre er ikke i området av interesse, og deretter adferdsdata for at dyret skal fjernes fra forsøket. I tillegg er det viktig å teste lysutbytte på fiber tips både før kirurgisk implantering og igjen obduksjon for å sikre tilstrekkelig lys makt for opsin aktivering. I animals hvor alvorlig lystap har oppstått gjennom fiber etter eksperimentering (> 30%) 9, bør vurderes data for at dyret skal fjernes. Kriterier for fjerning bør etableres en priori. Til slutt må man ta hensyn til pulsfrekvens som kreves for å modulere signalimpulsene, som vil avhenge av hjernestrukturen og neuronal sub-typer blir målrettet. Publiserte optogenetic lette stimuleringsparametere eksisterer for flere neuronal sub-typer, men bør evnen til å modulere signalimpulsene være uavhengig bekreftet ved in vivo eller hjerneskiveelektrofysiologiske opptak.Som man blir dreven laserbruk og modifikasjon av laseroppsett, kan kombinasjoner av forskjellige bølgelengder bli bundet til flere fibre av et enkelt dyr, eller levert ned samme fiber for kombinatorisk optogenetics 8. Multi-bølgelengde stimulering vil bli stadig viktigere gitt den raske utviklingen av rød-shifted channelrhodopsins 8, prosjektering av blå-skiftet hyperpolariserer opsins 15, bruk av bistabile step-funksjon opsins 8,16,17, og den generelle utvide listen over opsins med distinkt aktivering spektra 11. Denne utvidelsen av optogenetic verktøykassen vil tillate enestående kontroll over flere nevrale sub-typer både innenfor og på tvers av hjernen for å bestemme deres rolle i styrende komplekse atferds stater.
The authors have nothing to disclose.
These studies were funded by grants received from the NIH (MH082876, DA023988).
1. Laser Set-up | ||||
Name of Equipment | Company | Quantity | Catalog Number | Comments |
100mW 473nm or 488nm Diode Laser System , <2% Stability | Omicron | 1 | Luxx/Phoxx 473/488-100 | Optional accessory includes a remote control box with key switch and LED Display |
100mW 594nm DPSS laser | Colbolt | 1 | 0594-04-01-0100-300 | 04-01 series yellow laser; sensitive to back-reflection from fibers |
200mW 532nm DPSS laser; 5% power stability | Shanghai Lasers | 1 | GL532T3-200 | Cost-effective alternative to yellow DPSS laser for activation of halorhodopsins and archaerhodopsins |
Non-contact style laser to multimode fiber coupler | OZ Optics | 1 | HPUC-23-400/700-M-20AC-11 | For use with dual laser set-up; Specs: 33mm OD for 400-700nm; FC receptacle, f=20mm lens with post mount laser head adapter #11 |
Aluminum breadboard, 12" x 18" x 1/2", 1/4"-20 Threaded | Thorlabs | 1 | MB1213 | For dual laser system |
Aluminum breadboard, 10" x 12" x 1/2". 1/4"-20 Threaded | Thorlabs | 1 | MB1012 | For single laser system |
Aluminum breadboard, 4" x 6" x 1/2", 1/4"-20 Threaded | Thorlabs | 2 | MB4 | For blue laser; dual laser system |
Compact variable height clamp, 1/4"-20 Tapped | Thorlabs | 4 | CL3 | |
3/4" stainless post | Thorlabs | 1 | TR075 | |
1" stainless post | Thorlabs | 4 | TR1 | |
Post holder with spring-loaded hex-locking thumbscrew | Thorlabs | 2 | PH1 | |
Pedestal Base Adapter | Thorlabs | 3 | BE1 | |
Small Clamping Fork | Thorlabs | 3 | CF125 | |
Kinematic mount for 1" optics with visible laser quality mirror | Thorlabs | 3 | KM100-E02 | |
Neutral filter density wheel | Thorlabs | 1 | NDC-50C-2M | |
1" Longpass dichroic mirror 50% | Thorlabs | 1 | DMLP505 | |
Kinematic mount for 1" optics | Thorlabs | 1 | KM100 | For dichroic mirror |
20-piece hex wrench kit with stand | Thorlabs | 1 | TC2 | |
1/4"-20 cap screw and hardware kit | Thorlabs | 1 | HW-KIT2 | |
Mounting base 1" x 2.3"x3/8" | Thorlabs | 1 | BA1S | |
FC/PC to FC/PC L-Bracket mating sleeve | Thorlabs | 2 | ADAFCB1 | Dual FC/PC L-bracket also available |
Breadboard lifting handles | Thorlabs | 3 | BBH1 | |
Ø1" Bandpass Filter, CWL = 450 ± 2 nm, FWHM = 10 ± 2 nm | Thorlabs | 1 | FB450-10 | For use with diode lasers that spontaneously emit |
2. Laser Coupling | ||||
Name of Equipment | Company | Quantity | Catalog Number | Comments |
! Laser protective eyewear | Various | One for every user at each wavelength | ! Consult with laser provider to ensure proper selection of eyewear that will provide maximal light attenuation for the purchased laser | |
Fiber optic cable tester | Eclipse | 1 | 902-186N | |
One-step fiber connector cleaner | Thorlabs | 1 | FBC1 | |
Coupler patch cord (0.75 meter) | Thorlabs | 1 | 0.75m 200um core, 0.22NA, FC/PC connectors multimode fibers | For dual laser system |
Coupler patch cord (0.5 meter) | Thorlabs | 1 | 0.5m 200um core, 0.22NA, FC/PC connectors, multimode | For single laser system |
Doric mini cube | DORIC | 2 | DMC_1x2_FC-2FC | |
Compact power and energy meter console | Thorlabs | 1 | PM100D | Digital 4" LCD |
C-series slim power sensor 5-500mW | Thorlabs | 1 | S130C | Multiple detectors types are available; check with vendor |
3. In vivo Optogenetic Stimulation | ||||
Name of Equipment | Company | Quantity | Catalog Number | Comments |
Multimode fiber splitters | FONT Canada | 2 | Large core fiber optic 1 X 2 splitter, 50/50 ratio, FC connectors, ruggedized | Length, core size and numerical aperture can be specified when ordering; cost-effective smaller core sizes available |
Arbitrary waveform function generator (2 channel) | Rigol | 1 | DG1022 | Can control up to 2 lasers at once |
Fiber optic rotary joint (commutator) | DORIC* | 6 to 8 | FRJ_1X1_FC-FC | *Also available through Thorlabs and Prizmatix |
Animal patch cords (Custom Mono Fiberoptic Cannula with 10mm ferrules, FC/PC connector) | DORIC | 8 | MFP_200/240/900-0.22_2m_FC-MF2.5 | Length, core size and numerical aperture can be specified when ordering; alternatively, these can be made custom made in-house (see Sparta et al. 2012)9. |
PFP ceramic split sleeve, 2.5mm ID, 11.40mm length (25/pkg) | Precision fiber Products | 1 | SM-CS1140S | Used for attaching implanted fiber optic on animal to a light-delivering fiber patch cord with flat cleeve (FC) end |
Clear dust caps for Ø2.5 mm ferrules (25/pkg) | Thorlabs | 1 | CAPF | |
Metal cap for FC/PC and FC/APC mating sleeves | Thorlabs | 2 | CAPF1 | |
Thick-jacketed patch cords (custom order) | Thorlabs | 4 | 200um core, 0.22NA, FC/PC connectors multimode fibers | Length, core size, and numerical aperture can be specified when ordering |