Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.
The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.
Optogenetik har revolution system-nivå neurovetenskap i sitt sökande efter de neurala kretselement som driver normala och sjukdoms relevanta beteende stater. Upptäckten att ljuskänsliga mikrobiella opsins 1 började funktionellt uttryckas i däggdjursceller förutsatt plattformen för att använda ljus för att få oöverträffad kontroll av neural aktivitet med hög spatial och temporal precision 2. Till skillnad från traditionella elektrofysiologiska eller farmakologiska metoder för manipulering av neural aktivitet, tillåter optogenetik för bekämpning av specifika celltyper (baserat på genetisk identifiera eller rumslig projektion) inom heterogena populationer och vid fysiologiskt relevanta tidsskalor. Den senare införande av en neural-optiskt gränssnitt förutsatt ett praktiskt verktyg för leverans av ljus till beter djur 3. Detta har gjort det möjligt för realtidsmodulering av definierade neurala kretsar i Vakna beter gnagare för att kausalt testaroll dessa nervbanor i styrningen av beteende stater som är relevanta för neurologisk och psykiatrisk sjukdom 4-6. Optogenetik därför utgör ett kraftfullt verktyg för införande i alla laboratorier intresserade av att undersöka den funktionella relationen mellan hjärnans aktivitet och beteende eller fysiologiska åtgärder i djurmodeller.
Lyckad design och slutförandet av en optogenetic experiment involverar olika steg och överväganden (se figur 1). Målet med det nuvarande protokollet är att ge personer med de verktyg och komponenter, tillsammans med de teoretiska och praktiska kunskaper, som behövs för att utföra optogenetic stimulans i vaken beter gnagare. För närvarande finns det två dominerande våglängdsområden som används för att aktivera mikrobiella opsin kanaler: i det blå spektrat (vanligen 473 nm) och grön-gul spektra (vanligen 532 eller 591 nm). Både lasrar och lysdioder (LED) kan användas som ljuskällor till deliver specifika våglängder av ljus till hjärnvävnad. Den icke-koherent ljus som avges av lysdioder, gör dock en effektiv överföring av ljus svårt när koppling till de små kärn fibrer som krävs för in vivo gnagare stimulering. Besluta om lämplig laserenheten är en avgörande första steg och kommer att bero på den avsedda användningen av optogenetik i labbet. Den nuvarande protokollet beskriver två grundläggande konfigurationer som skiljer sig i deras enkla montering och användning: enkel pre kopplade lasrar och dubbla lasersystem (se figur 2). Singellasersystem som är pre-kopplade av tillverkaren är väsentligen färdig att gå vid ankomst med liten eller ingen installation krävs men har nackdelen av minimala slutanvändaranpassning. En dubbel lasersystem möjliggör leverans av två olika våglängder ner samma fiber. Detta kommer att bli allt viktigare med tillkomsten av kombinato optogenetik vari olika våglängder kan användas för att aktivera / hämma distincT-celltyper som är rumsligt samlokaliserade. Detta är också viktigt för användning med bistabila Steg Funktion opsins där fotoströmmar initieras och avslutas med blått och gult ljus, respektive 7,8. Dubbla lasersystem är också anpassnings som användaren kan lägga till eller ta bort komponenter (t.ex. externa jalusier, balk filter, inline power meter) från strålgången efter behov. Tack vare sin mångsidighet, är den dubbla laser installation rekommenderas om optogenetik kommer att bli en fortsatt verktyg som används i labbet. Koppling av lasrarna kan dock innebära en utmaning och så en snabb, enkel och pålitlig kopplingsmekanism finns i detta protokoll. Observera, detta protokoll detaljer montering av optiska komponenter och utnyttjar patchkablar och komponenter som är optimerade för steg-index multimodfibrer med en 200 nm kärna och en numerisk apertur (NA) på 0,22. Olika kärnstorlekar och NA finns att köpa, men alla komponenter bör helst matchas avseende kärnstorlek och NA för att undvika ljusförlust vid fiberanslutningspunkter. Alternativt på en fiberanslutning, kan ljuset passera från en mindre till en större kärna storlek; och / eller från en lägre-NA till en högre-NA-fiber utan ytterligare förlust.
Tjudra strategier förutsatt att möjliggöra samtidig stimulering av flera möss för hög genomströmning beteendetester. De protokoll som förutsätter användning av kroniska implanterbara fibrer för beteendetester men kan modifieras för akuta stimuleringsprotokoll. Akut implanterade fibrer är fördelaktiga för att kombinera optogenetic stimulering med farmakologisk manipulation, eftersom samma kanyl kan användas för att avge läkemedel och spetsen av en optisk fiber till samma plats. Användningen av kroniskt-implanterade fibrerna är dock rekommenderas starkt för multipel-dagars beteendetestning eftersom det minskar vävnadsskada associerad med upprepat införande och avlägsnande av fibrer och ökar noggrannheten när det gäller att konsekvent placering av fiber förvävnads belysning 3. I kombination med de tjudra konfigurationer som beskrivs här, kan spelas beteende tillförlitligt över flera dagar. Faktum är tillförlitlig ljustransmission rapporterats månader efter fiber implantation 9 så att kronisk stimulering och beteendetest paradigm kan, teoretiskt, ske över flera dagar och veckor. Kompletterande information om hårdvarukomponenter har lagts till protokollet för att låta läsaren val i den bästa produkten som passar deras individuella behov, inklusive kostnadseffektiva alternativ och produkter som kan göras i egen regi. Viktiga tips som är användbara under installationen och genomförande finns också.
De nuvarande beskrivna laser uppställningar och tjudra strategier är kompatibla med ett brett utbud av gnagare beteendetester. I själva verket har en mängd olika beteendetester använts efter, eller medföljande, för att in vivo optogenetic stimulering som omfattar känslobeteende arbetsuppgifter, beteende conditioning, inlärning och minne paradigm, sömn, upphetsning och appetitive arbetsuppgifter nämna några (se Nieh et al. 6 för en omfattande översyn). Optogenetik har förändrat hur traditionella beteendetester utförs genom att flera dagars studier kan nu kondenseras till en enda session där beteende jämförs, inom-ämnen, under olika epoker av ljus "på" kontra "off" 5. Notera beteende apparater som innehåller dörröppningar, stängda fack eller andra hinder kan behöva modifieras för att rymma passage av bundna fibrer.
Den beskrivna tjudra strategier tillstånd simultaneous stimulering av multipel möss från en enda laser. Hög genomströmning optogenetic beteendetester kan därför uppnås genom användning av flera lasrar och testutrustning. Antalet djur som kan samtidigt stimuleras, kommer dock att begränsas av den maximala ljuseffekten som kan uppnås vid varje fiberspets. Maximal uteffekt vid fiberspetsen är beroende av 1) startkraft av lasern; 2) kopplingseffektivitet och 3) antal balk splittringar. För en 100 mW blå laser med ~ 80% kopplingseffektivitet och upp till 4 balk split (som visas i figur 4C), medeleffekt på fiberspetsen kan variera mellan 5-10 mW vid användning 200 um kärna, 0.22 NA fiber kablage (nb förväntar transmissionsförluster från roterskarvar vara <15%). Mätning ljusflöde vid fiberspetsen är avgörande för att bestämma lämplig ljuseffekt för opsin aktivering som opsins skiljer sig i sin känslighet för ljus och därmed ljuseffekttäthet (mW/ Mm 2) som krävs för aktivering 11. Till exempel, den stabila steg-funktionen opsin (SSFO) fungerar som en foton ackumulator och kräver därför mycket lite ljus effekttäthet för aktivering (<8 ^ W / mm 2) 8. Jämför detta med den traditionella kanalen rodopsin (ChR2) som kräver ett minimum av 1 mW / mm2 av ljus för att framkalla aktionspotentialer 2. Tabell 1 tillhandahålls som en snabbreferens för kända minimiljus irradiances krävs för att aktivera de vanligaste opsins närvarande använda. Slutligen måste man överväga att lätta scatters och absorberar när den färdas genom hjärnvävnad så att mer ljus effekt krävs för djupare hjärnstrukturer 3. En användbar resurs online finns på http://www.stanford.edu/group/dlab/cgi-bin/graph/chart.php som beräknar ljusintensiteten vid olika djup genom hjärnvävnad genom att ta hänsynkonto fiberkärnan storlek, numerisk apertur, ljusvåglängd som används, och startljuseffekten vid fiberspetsen. För en utmärkt översikt över de teoretiska principer som ligger bakom dessa beräkningar, se Foutz et al. (2012) 12. Exempel på hur man kan tillämpa dessa principer och beräkningar till experimentell design demonstreras i Aravanis et al. (2007) 3 och Tye et al. (2012) 13. Utföra dessa beräkningar före starten av ett experiment är avgörande för att säkerställa tillräcklig ljus irradians för opsin aktivering. Med tanke på dessa överväganden, är det fördelaktigt att köpa högre drivna lasrar för att säkerställa tillräcklig uteffekt. Lasrar med en effekt mellan 100-200 mW är generellt tillräckliga för att kompensera för små kärnfibrer, fiber delning multipel, kopplings ineffektivitet och transmission förlorar 7. Om du använder högeffektlasrar dock måste man vara försiktig för att undvika nervskador eller värme och ljus-associerad artefakter som kan uppstå vid långvarig och / eller hög effekt ljus belysning 7. Ett säkert område för in vivo experiment är upp till 75 mW / mm2. 14
Besluta om vilken typ av laser för att köpet kan vara en komplicerad fråga eftersom det finns många faktorer att tänka på. Till exempel, direktdiodlasrar ger stabilare och repeterbar pulsad uteffekt än vad diodpumpade solid-state (DPSS) lasrar, och är mer tillförlitliga över tid i en labbmiljö. I vissa fall kan dock direkta diodlasrar avger en lägre ljuseffekt, ~ 0,1 mW, även när kommandot spänningen är 0 V på grund av en konstant förspänningsström skickas till dioden med laserns styrelektronik. Denna "spontana" emission har ett bredare spektrum än vad laseremission från samma laser, så kan specifikt minskas genom att installera ett smalt bandpass (eller "rensning") filter mellan lasern och kopplare (se lista delar). Detta filter kommer ocksåminska uteffekten med ~ 50% när laser, så köp en högre driven laser därefter. Det bör noteras att de gula DPSS lasrar är extremt känsliga och kan bete sig oregelbundet och har reducerad livslängd om snabbt moduleras av en pulsgenerator. Justering av gula lasereffekt bör ske genom externa densitet filterhjul placerade i strålgången (avsnitt 1.7) medan rörelse lasern i TTL + läge. Alternativt köpa en grön 532 nm DPSS laser är ett kostnadseffektivt alternativ som kan aktivera både halorhodopsins och archaerhodopsins.
Den numeriska bländaröppningen (NA) i en fiber är viktigt att tänka på när man utformar och köpa fiberkomponenter för laserenhet set-up. NA hos en optisk fiber bestämmer vinklarna för ljusstrålar som kan accepteras och avges på spetsen av en fiber. Om en högre NA fiber är parad med en lägre NA fiber, kommer betydande förlust inträffar vid det gränssnittet, så det är viktigt att vara konsekvent wi th fiber NA i en enda installation (eller för att se till att NA ökar längs strålgången). Effekten av fiber NA på volymen av hjärnvävnad belyst är mindre viktigt, eftersom hjärnvävnaden är mycket spridning, och eftersom belysningen kopplad från en laserkälla tenderar att "underfill" high-NA fibrer; Men optiska fibrer med en NA på 0,22 och 0,37 är vanligt förekommande. Likaså koppling från en större kärna till en mindre kärna fiber kommer också att leda till betydande förluster, så alltid se till att använda ökar eller lika kärndiametrar när skrider från laserkällan till implantat djuret. Rent allmänt bör fiberändarna alltid vara maximerad när den inte används för att förhindra damm och partiklar uppbyggnad. Det är en bra idé att regelbundet rena fiberändar och kontakter (70% isopropylalkohol fungerar bra) för att säkerställa maximal ljuseffekt, och att testa ljus uteffekt genom en "dummy implantat" innan varje dags experiment.
"> Under beteendetester, är det absolut nödvändigt att åtgärder vidtas för att kontrollera för effekterna av virusinfektion, exogena proteinuttryck, synligt ljus, och eventuella vävnadsuppvärmningseffekter och artefakter på djurens beteende. Därför bör den riktiga kontrollgruppen består av djur omvandlas med en kontrollvirus (t.ex. GFP, EYFP, mCherry) som tar emot identiska ljusstimuleringsparametrar. Experimentell verifiering är en avgörande sista steget som de beteendedata som används för analys är helt beroende av korrekt opsin och fiberoptisk placering i regionen av intresse . Närmare bestämt i djur där ingen immunhistokemisk signal upptäcks, eller där placering av signal eller fiber inte är i regionen av intresse, då beteendedata för detta djur bör tas bort från experimentet. Dessutom är det viktigt att testa ljusflöde på fiberspetsen både före kirurgisk implantation och igen efter slakt för att säkerställa tillräcklig ljuseffekt för opsin aktivering. I animals där svår ljusförlust har inträffat genom fibern efter experimenterande (> 30%) 9, data för detta djur bör övervägas för borttagning. Kriterier för avlägsnande bör fastställas på förhand. Slutligen måste man ta hänsyn till pulsfrekvens som krävs för att modulera neural bränning, vilket beror på hjärnans struktur och neuronala subtyper blir måltavla. Publicerade optogenetic ljus stimuleringsparametrar finns för flera neuronala subtyper, bör dock förmågan att modulera neural bränning oberoende bekräftas genom in vivo eller hjärn slice elektrofysiologiska inspelningar.Som man blir skickliga med laser användning och modifiering av laser uppställningar, kan kombinationer av olika våglängder vara uppbundna till flera fibrer på ett enskilt djur eller levereras ner samma fiber för kombinato optogenetik 8. Multi-våglängd stimulering kommer att bli allt viktigare med tanke på den snabba utvecklingen av rödförskjutningened channelrhodopsins 8, verkstads av blå-skiftat hyperpolarizing opsins 15, användningen av bistabila steg-funktion opsins 8,16,17, och den allmänna växande listan över opsins med distinkt aktiverings spektra 11. Denna expansion av optogenetic verktygslåda kommer att möjliggöra oöverträffad kontroll av flera neurala subtyper både inom och mellan hjärnregioner för att fastställa deras roll i styrande komplexa beteende stater.
The authors have nothing to disclose.
These studies were funded by grants received from the NIH (MH082876, DA023988).
1. Laser Set-up | ||||
Name of Equipment | Company | Quantity | Catalog Number | Comments |
100mW 473nm or 488nm Diode Laser System , <2% Stability | Omicron | 1 | Luxx/Phoxx 473/488-100 | Optional accessory includes a remote control box with key switch and LED Display |
100mW 594nm DPSS laser | Colbolt | 1 | 0594-04-01-0100-300 | 04-01 series yellow laser; sensitive to back-reflection from fibers |
200mW 532nm DPSS laser; 5% power stability | Shanghai Lasers | 1 | GL532T3-200 | Cost-effective alternative to yellow DPSS laser for activation of halorhodopsins and archaerhodopsins |
Non-contact style laser to multimode fiber coupler | OZ Optics | 1 | HPUC-23-400/700-M-20AC-11 | For use with dual laser set-up; Specs: 33mm OD for 400-700nm; FC receptacle, f=20mm lens with post mount laser head adapter #11 |
Aluminum breadboard, 12" x 18" x 1/2", 1/4"-20 Threaded | Thorlabs | 1 | MB1213 | For dual laser system |
Aluminum breadboard, 10" x 12" x 1/2". 1/4"-20 Threaded | Thorlabs | 1 | MB1012 | For single laser system |
Aluminum breadboard, 4" x 6" x 1/2", 1/4"-20 Threaded | Thorlabs | 2 | MB4 | For blue laser; dual laser system |
Compact variable height clamp, 1/4"-20 Tapped | Thorlabs | 4 | CL3 | |
3/4" stainless post | Thorlabs | 1 | TR075 | |
1" stainless post | Thorlabs | 4 | TR1 | |
Post holder with spring-loaded hex-locking thumbscrew | Thorlabs | 2 | PH1 | |
Pedestal Base Adapter | Thorlabs | 3 | BE1 | |
Small Clamping Fork | Thorlabs | 3 | CF125 | |
Kinematic mount for 1" optics with visible laser quality mirror | Thorlabs | 3 | KM100-E02 | |
Neutral filter density wheel | Thorlabs | 1 | NDC-50C-2M | |
1" Longpass dichroic mirror 50% | Thorlabs | 1 | DMLP505 | |
Kinematic mount for 1" optics | Thorlabs | 1 | KM100 | For dichroic mirror |
20-piece hex wrench kit with stand | Thorlabs | 1 | TC2 | |
1/4"-20 cap screw and hardware kit | Thorlabs | 1 | HW-KIT2 | |
Mounting base 1" x 2.3"x3/8" | Thorlabs | 1 | BA1S | |
FC/PC to FC/PC L-Bracket mating sleeve | Thorlabs | 2 | ADAFCB1 | Dual FC/PC L-bracket also available |
Breadboard lifting handles | Thorlabs | 3 | BBH1 | |
Ø1" Bandpass Filter, CWL = 450 ± 2 nm, FWHM = 10 ± 2 nm | Thorlabs | 1 | FB450-10 | For use with diode lasers that spontaneously emit |
2. Laser Coupling | ||||
Name of Equipment | Company | Quantity | Catalog Number | Comments |
! Laser protective eyewear | Various | One for every user at each wavelength | ! Consult with laser provider to ensure proper selection of eyewear that will provide maximal light attenuation for the purchased laser | |
Fiber optic cable tester | Eclipse | 1 | 902-186N | |
One-step fiber connector cleaner | Thorlabs | 1 | FBC1 | |
Coupler patch cord (0.75 meter) | Thorlabs | 1 | 0.75m 200um core, 0.22NA, FC/PC connectors multimode fibers | For dual laser system |
Coupler patch cord (0.5 meter) | Thorlabs | 1 | 0.5m 200um core, 0.22NA, FC/PC connectors, multimode | For single laser system |
Doric mini cube | DORIC | 2 | DMC_1x2_FC-2FC | |
Compact power and energy meter console | Thorlabs | 1 | PM100D | Digital 4" LCD |
C-series slim power sensor 5-500mW | Thorlabs | 1 | S130C | Multiple detectors types are available; check with vendor |
3. In vivo Optogenetic Stimulation | ||||
Name of Equipment | Company | Quantity | Catalog Number | Comments |
Multimode fiber splitters | FONT Canada | 2 | Large core fiber optic 1 X 2 splitter, 50/50 ratio, FC connectors, ruggedized | Length, core size and numerical aperture can be specified when ordering; cost-effective smaller core sizes available |
Arbitrary waveform function generator (2 channel) | Rigol | 1 | DG1022 | Can control up to 2 lasers at once |
Fiber optic rotary joint (commutator) | DORIC* | 6 to 8 | FRJ_1X1_FC-FC | *Also available through Thorlabs and Prizmatix |
Animal patch cords (Custom Mono Fiberoptic Cannula with 10mm ferrules, FC/PC connector) | DORIC | 8 | MFP_200/240/900-0.22_2m_FC-MF2.5 | Length, core size and numerical aperture can be specified when ordering; alternatively, these can be made custom made in-house (see Sparta et al. 2012)9. |
PFP ceramic split sleeve, 2.5mm ID, 11.40mm length (25/pkg) | Precision fiber Products | 1 | SM-CS1140S | Used for attaching implanted fiber optic on animal to a light-delivering fiber patch cord with flat cleeve (FC) end |
Clear dust caps for Ø2.5 mm ferrules (25/pkg) | Thorlabs | 1 | CAPF | |
Metal cap for FC/PC and FC/APC mating sleeves | Thorlabs | 2 | CAPF1 | |
Thick-jacketed patch cords (custom order) | Thorlabs | 4 | 200um core, 0.22NA, FC/PC connectors multimode fibers | Length, core size, and numerical aperture can be specified when ordering |