Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.
The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.
La optogenética ha revolucionado la neurociencia a nivel de sistemas en la búsqueda de los elementos del circuito neural que impulsan los estados de comportamiento normales y relevantes de la enfermedad. El descubrimiento de que las opsinas microbianas sensibles a la luz 1 podrían expresarse funcionalmente en células de mamíferos proporcionó la plataforma para el uso de la luz para obtener el control sin precedentes de la actividad neuronal con alta precisión espacial y temporal 2. A diferencia de los enfoques electrofisiológicos o farmacológicos tradicionales a la manipulación de la actividad neuronal, la optogenética permite el control de tipos de células específicas (basado en la proyección genética identificar o espacial) dentro de las poblaciones heterogéneas y en escalas de tiempo fisiológicamente relevantes. La posterior introducción de una interfaz neural óptica proporciona una herramienta práctica para la entrega de la luz a comportarse animales 3. Esto ha permitido a la modulación en tiempo real de los circuitos neuronales definidas en roedores comportándose despierto con el fin de probar la causalpapel de estos circuitos neuronales en el gobierno de los estados de comportamiento relacionados con la enfermedad neurológica y psiquiátrica 4-6. La optogenética, por lo tanto, representa una poderosa herramienta para la introducción en cualquier laboratorio interesado en investigar la relación funcional entre la actividad cerebral y medidas conductuales o fisiológicos en modelos animales.
El éxito del diseño y la realización de un experimento optogenética implica varios pasos y consideraciones (ver Figura 1). El objetivo del protocolo actual es proporcionar a las personas con las herramientas y componentes, junto con los conocimientos teóricos y prácticos, necesarios para llevar a cabo la estimulación optogenética en roedores comportándose despierto. Actualmente, existen dos rangos de longitud de onda predominante utilizado para activar los canales de opsina microbianos: en los espectros azul (comúnmente 473 nm) y los espectros de color amarillo-verde (comúnmente 532 o 591 nm). Ambos láseres y diodos emisores de luz (LED) se pueden utilizar como fuentes de luz para dEliver longitudes de onda específicas de la luz en el tejido cerebral. La luz no coherente emitida por los LEDs, sin embargo, hace que la transmisión eficaz de la difícil luz cuando el acoplamiento en las pequeñas fibras básicas requeridas para la estimulación in vivo de los roedores. Decidir sobre el conjunto de láser apropiado es un paso inicial crucial y dependerá del uso previsto de la optogenética en el laboratorio. El protocolo actual se describen dos configuraciones básicas que difieren en su facilidad de montaje y uso: láseres pre-acoplado individuales y sistemas de doble láser (ver Figura 2). Sistemas láser individuales que están pre-acoplados por el fabricante son esencialmente listos para ir a su llegada con poca o ninguna configuración requerida, pero tienen el inconveniente de un mínimo de personalización del usuario final. Un sistema láser dual permite la entrega de dos longitudes de onda diferentes por la misma fibra. Esto será cada vez más importante con el advenimiento de la optogenética combinatoria mediante el cual diferentes longitudes de onda se pueden utilizar para activar / inhibir la distincióntipos de células T que son espacialmente co-localizado. Este es también esencial para el uso con opsinas función de paso bi-estables donde se inician y se termina por la luz azul y amarillo, respectivamente, el 7,8 fotocorrientes. Sistemas de láser dual también son personalizables como el usuario puede agregar o quitar componentes (por ejemplo, persianas exteriores, filtros de haz, medidores de energía en línea) de la trayectoria del haz como se requiere. Debido a su versatilidad, se recomienda el láser dual configuración si la optogenética va a ser una herramienta continua utilizada en el laboratorio. El acoplamiento de los láseres, sin embargo, puede presentar un reto y así un mecanismo de acoplamiento rápido, fácil y fiable es proporcionado en este protocolo. Nota, este protocolo se detalla el conjunto de componentes ópticos y utiliza cables de conexión y componentes que están optimizados para fibras multimodo salto de índice con un núcleo de 200 micras y una apertura numérica (AN) de 0,22. Diferentes tamaños de núcleo y NA están a la venta, sin embargo todos los componentes idealmente deben coincidir en términos de núcleotamaño y NA para evitar la pérdida de luz en los puntos de conexión de fibra. Alternativamente, en una conexión de fibra, la luz puede pasar de una pequeña a una testigos de mayor tamaño; y / o de un menor-NA a una fibra de alto NA sin pérdida adicional.
Tethering se proporcionan estrategias que permiten la estimulación simultánea de múltiples ratones para las pruebas de comportamiento de alto rendimiento. Los protocolos proporcionados asumen uso de fibras implantables crónicas para las pruebas de comportamiento, pero pueden ser modificadas para protocolos de estimulación agudos. Fibras aguda implantados son ventajosos para combinar la estimulación optogenético con la manipulación farmacológica, ya que la misma cánula se puede utilizar para administrar fármacos y la punta de una fibra óptica en la misma ubicación. El uso de fibras crónicamente implantados-es, sin embargo, muy recomendable para los de varios días las pruebas de comportamiento, ya que reduce el daño tisular asociado a la inserción repetida y la eliminación de las fibras y aumenta la exactitud de la colocación consistente de fibra parailuminación tejido 3. Cuando se combina con las configuraciones de inmovilización descritos aquí, el comportamiento se puede grabar de forma fiable a través de múltiples días. Mes De hecho, la transmisión de luz fiable ha informado después de la implantación de la fibra 9 de tal manera que la estimulación crónica y paradigmas de pruebas de comportamiento pueden, en teoría, se llevarán a cabo a través de múltiples días y semanas. Notas adicionales sobre los componentes de hardware se han añadido al protocolo para permitir la elección lector en el mejor producto que se adapte a sus necesidades individuales, incluyendo alternativas rentables y productos que se pueden hacer en casa. También se proporcionan consejos importantes que son útiles durante la instalación e implementación.
Los actuales láser descrito set-ups y estrategias inmovilización son compatibles con una amplia gama de pruebas de comportamiento de roedores. De hecho, una variedad de pruebas de comportamiento han sido utilizados siguiendo, o que la acompañan, en vivo estimulación optogenética que incluyen tareas emotivos conducta, condicionamiento de la conducta, aprendizaje y paradigmas de memoria, el sueño, la excitación y las tareas del apetito por nombrar algunos (ver Nieh et al. 6 para un examen exhaustivo). La optogenética ha cambiado la forma de las pruebas tradicionales de comportamiento se realizan en que los estudios de varios días ahora se puede condensar en una sola sesión en la que se compara el comportamiento, dentro de los temas, durante distintas épocas de la luz 'sobre' versus 'off' 5. Compartimentos de destacar que los aparatos de comportamiento que contienen puertas, cerradas u otros obstáculos pueden tener que ser modificado para acomodar el paso de fibras atadas.
La estrategias de inmovilización permiso si se describesimul- estimulación de los ratones múltiple a partir de un único láser. Por lo tanto, las pruebas de comportamiento de alto rendimiento optogenético se puede lograr mediante el uso de múltiples láseres y equipos de prueba. El número de animales que pueden ser estimulados simultáneamente, sin embargo, estará limitada por la potencia de luz máxima que se puede alcanzar en cada punta de la fibra. La salida máxima de potencia en la punta de la fibra depende de la 1) potencia de arranque del láser; 2) eficiencia de acoplamiento y 3) el número de divisiones de haz. Para un láser azul de 100 mW con ~ 80% de eficiencia de acoplamiento y hasta 4 divisiones de haz (como se representa en la Figura 4C), la potencia media en la punta de la fibra puede oscilar entre 5-10 mW cuando se utiliza 200 micras núcleo, 0,22 NA cables de conexión de fibra (nb esperar que la pérdida de transmisión de juntas rotativas para ser <15%). Medición de la producción de luz en la punta de la fibra es esencial para la determinación de potencia de la luz adecuada para la activación opsina como opsinas difieren en su sensibilidad a la luz y por lo tanto la densidad de potencia de luz (mW/ Mm 2) requerida para la activación 11. Por ejemplo, la opsina-función de paso estable (SSFO) actúa como un acumulador de fotones y por lo tanto requiere muy poca densidad de potencia de luz para la activación (<8 mW / mm 2) 8. Compare esto con la rodopsina canal tradicional (ChR2) que requiere un mínimo de 1 mW / mm 2 de la luz para obtener los potenciales de acción 2. Tabla 1 se ofrece como una referencia rápida para conocidos irradiancias mínimas de luz necesarios para activar las opsinas más comunes actualmente en usar. Por último, hay que considerar que la luz se dispersa y absorbe a medida que viaja a través del tejido cerebral de tal manera que se requiere más potencia de luz para las estructuras cerebrales profundas 3. Un recurso útil en línea está disponible en http://www.stanford.edu/group/dlab/cgi-bin/graph/chart.php que calcula la intensidad de la luz a diferentes profundidades a través de tejido cerebral, teniendo encuenta el tamaño del núcleo de la fibra, apertura numérica, longitud de onda de la luz utilizada y la potencia de la luz a partir de la punta de la fibra. Para una excelente revisión de los principios teóricos que subyacen a estos cálculos, consulte Foutz et al. (2012) 12. Ejemplos de cómo aplicar estos principios y cálculos para el diseño experimental se demuestran en Aravanis et al. (2007) 3 y Tye et al. (2012) 13. Realizar estos cálculos antes del inicio de un experimento es crucial para asegurar la irradiación de luz adecuada para la activación opsina. Teniendo en cuenta estas consideraciones, es ventajoso para comprar láseres de mayor potencia para asegurar la potencia adecuada. Los láseres con una potencia entre 100 a 200 mW son generalmente suficientes para compensar las fibras del núcleo pequeños, la división de fibra múltiple, la ineficiencia de acoplamiento y transmisión pierde 7. Si el uso de láseres de alta potencia, sin embargo, se debe tener cuidado para evitar daños en los nervios o el calor y la luz-asociadod artefactos que pueden ocurrir con prolongada y / o alta iluminación luz accionada 7. Un rango seguro para los experimentos in vivo es de hasta 75 mW / mm 2. 14
La decisión sobre el tipo de láser para la compra puede ser un asunto complicado, ya que hay muchos factores a considerar. Por ejemplo, los láseres de diodo directos proporcionan salida pulsada más estable y repetible de hacer de estado sólido (DPSS) láseres de diodo-bombeado, y son más fiables en el tiempo en un entorno de laboratorio. En algunos casos, sin embargo, los láseres de diodo directos pueden emiten una potencia de la luz inferior, ~ 0,1 mW, incluso cuando la tensión de comando es 0 V debido a un sesgo de corriente constante de ser enviado al diodo por la electrónica de control del láser. Esta emisión "espontánea" tiene un espectro más amplio que hace emisión láser desde el mismo láser, por lo que se puede reducir específicamente mediante la instalación de un paso de banda estrecha (o 'limpieza') filtro entre el láser y el acoplador (véase lista de piezas). Este filtro tambiénreducir la producción de energía por ~ 50% cuando la acción láser, por lo que la compra de un láser de mayor potencia en consecuencia. Cabe señalar que los láseres de DPSS amarillas son extremadamente sensibles y pueden comportarse de forma errática y han reducido vida útil si rápidamente modulada por un generador de impulsos. El ajuste de la potencia del láser de color amarillo se debe hacer a través de ruedas de filtros de densidad externos colocados en la trayectoria del rayo (sección 1.7) mientras opera el láser en modo TTL +. Por otra parte, la compra de un verde 532 nm láser DPSS es una alternativa rentable que puede activar ambas halorhodopsins y archaerhodopsins.
La apertura numérica (NA) de una fibra es importante considerar en el diseño y la compra de componentes de fibra de conjunto de láser puesta a punto. El NA de una fibra óptica determina los ángulos de los rayos de luz que pueden ser aceptados y se emite en el extremo de una fibra. Si una fibra de alto NA está acoplado a una fibra inferior-NA, pérdida significativa ocurrirá en dicha interfaz, por lo que es importante ser consistente wi º fibra NA dentro de una sola configuración (o para asegurar que NA aumenta a lo largo de la trayectoria de la luz). El efecto de la fibra NA en el volumen de tejido cerebral de iluminación es menos importante, ya que el tejido cerebral es altamente dispersante, y puesto que la luz acoplada a partir de una fuente de láser tenderá a elevada AN fibras underfill ''; Sin embargo fibras ópticas con una NA de 0,22 y 0,37 se utilizan comúnmente. Del mismo modo, el acoplamiento de un mayor núcleo de una fibra más pequeño núcleo también se traducirá en pérdidas significativas, por lo que siempre asegúrese de usar diámetros de núcleo cada vez mayores o iguales al progresar desde la fuente de láser para el implante animal. En términos generales, extremos de la fibra siempre deben estar tapados cuando no esté en uso para evitar que el polvo y acumulación de partículas. Es una buena idea para regular extremos de las fibras limpias y conectores (70% de alcohol isopropílico funciona bien) para asegurar la salida de potencia de luz máxima, y para probar la salida de potencia de la luz a través de un "implante simulado 'antes de comenzar los experimentos de cada día.
"> Durante las pruebas de comportamiento, es imperativo que se tomen medidas para controlar los efectos de la infección viral, expresión de la proteína exógena, la luz visible, y los posibles efectos de calentamiento de tejidos y artefactos sobre el comportamiento animal. Por lo tanto, el grupo de control adecuado debe consistir en animales transducidas con un virus de control (por ejemplo, GFP, eYFP, mCherry) que reciben parámetros de estimulación luz idénticas. La verificación experimental es un paso final crucial ya que los datos de comportamiento utilizados para el análisis es totalmente dependiente de la opsina y la colocación de fibra óptica en la región de interés . Específicamente, en los animales cuando se detecta ninguna señal de inmunohistoquímica, o donde la colocación de la señal o de fibra no está en la región de interés, los datos a continuación de comportamiento para que los animales deben ser retirados de el experimento. Además, es esencial para probar la salida de luz en la punta de fibra, tanto antes de la implantación quirúrgica y de nuevo post mortem para asegurar potencia de luz adecuada para la activación opsina. En ánimals donde se ha producido la pérdida de luz severa a través de la fibra después de la experimentación (> 30%) 9, los datos para que los animales deben ser considerados para la eliminación. Criterios para la eliminación se deben establecer a priori. Por último, hay que considerar la frecuencia de impulsos requerida para modular actividad neuronal, que dependerá de la estructura del cerebro y neuronales sub-tipos como objetivo. Publicado existen parámetros de estimulación de luz optogenética para múltiples subtipos neuronales, sin embargo, la capacidad de modular la actividad neuronal debe ser confirmado de forma independiente a través in vivo o de sección de cerebro registros electrofisiológicos.Como uno se convierte en adepto con el uso de láser y modificación de láser set-ups, las combinaciones de diferentes longitudes de onda pueden ser atados a múltiples fibras en un solo animal o entregados por la misma fibra de la optogenética combinatoria 8. Estimulación multi-longitud de onda será cada vez más importante dado el rápido desarrollo de desplazamiento al rojoed channelrhodopsins 8, la ingeniería de opsinas de hiperpolarización desplazada al azul 15, el uso de biestables opsinas paso de función 8,16,17, y la ampliación de la lista general de opsinas con los espectros de activación distinta 11. Esta expansión de la caja de herramientas optogenética permitirá un control sin precedentes de múltiples subtipos neuronales dentro y fuera de las regiones del cerebro para determinar su papel en el gobierno de los estados de comportamiento complejos.
The authors have nothing to disclose.
These studies were funded by grants received from the NIH (MH082876, DA023988).
1. Laser Set-up | ||||
Name of Equipment | Company | Quantity | Catalog Number | Comments |
100mW 473nm or 488nm Diode Laser System , <2% Stability | Omicron | 1 | Luxx/Phoxx 473/488-100 | Optional accessory includes a remote control box with key switch and LED Display |
100mW 594nm DPSS laser | Colbolt | 1 | 0594-04-01-0100-300 | 04-01 series yellow laser; sensitive to back-reflection from fibers |
200mW 532nm DPSS laser; 5% power stability | Shanghai Lasers | 1 | GL532T3-200 | Cost-effective alternative to yellow DPSS laser for activation of halorhodopsins and archaerhodopsins |
Non-contact style laser to multimode fiber coupler | OZ Optics | 1 | HPUC-23-400/700-M-20AC-11 | For use with dual laser set-up; Specs: 33mm OD for 400-700nm; FC receptacle, f=20mm lens with post mount laser head adapter #11 |
Aluminum breadboard, 12" x 18" x 1/2", 1/4"-20 Threaded | Thorlabs | 1 | MB1213 | For dual laser system |
Aluminum breadboard, 10" x 12" x 1/2". 1/4"-20 Threaded | Thorlabs | 1 | MB1012 | For single laser system |
Aluminum breadboard, 4" x 6" x 1/2", 1/4"-20 Threaded | Thorlabs | 2 | MB4 | For blue laser; dual laser system |
Compact variable height clamp, 1/4"-20 Tapped | Thorlabs | 4 | CL3 | |
3/4" stainless post | Thorlabs | 1 | TR075 | |
1" stainless post | Thorlabs | 4 | TR1 | |
Post holder with spring-loaded hex-locking thumbscrew | Thorlabs | 2 | PH1 | |
Pedestal Base Adapter | Thorlabs | 3 | BE1 | |
Small Clamping Fork | Thorlabs | 3 | CF125 | |
Kinematic mount for 1" optics with visible laser quality mirror | Thorlabs | 3 | KM100-E02 | |
Neutral filter density wheel | Thorlabs | 1 | NDC-50C-2M | |
1" Longpass dichroic mirror 50% | Thorlabs | 1 | DMLP505 | |
Kinematic mount for 1" optics | Thorlabs | 1 | KM100 | For dichroic mirror |
20-piece hex wrench kit with stand | Thorlabs | 1 | TC2 | |
1/4"-20 cap screw and hardware kit | Thorlabs | 1 | HW-KIT2 | |
Mounting base 1" x 2.3"x3/8" | Thorlabs | 1 | BA1S | |
FC/PC to FC/PC L-Bracket mating sleeve | Thorlabs | 2 | ADAFCB1 | Dual FC/PC L-bracket also available |
Breadboard lifting handles | Thorlabs | 3 | BBH1 | |
Ø1" Bandpass Filter, CWL = 450 ± 2 nm, FWHM = 10 ± 2 nm | Thorlabs | 1 | FB450-10 | For use with diode lasers that spontaneously emit |
2. Laser Coupling | ||||
Name of Equipment | Company | Quantity | Catalog Number | Comments |
! Laser protective eyewear | Various | One for every user at each wavelength | ! Consult with laser provider to ensure proper selection of eyewear that will provide maximal light attenuation for the purchased laser | |
Fiber optic cable tester | Eclipse | 1 | 902-186N | |
One-step fiber connector cleaner | Thorlabs | 1 | FBC1 | |
Coupler patch cord (0.75 meter) | Thorlabs | 1 | 0.75m 200um core, 0.22NA, FC/PC connectors multimode fibers | For dual laser system |
Coupler patch cord (0.5 meter) | Thorlabs | 1 | 0.5m 200um core, 0.22NA, FC/PC connectors, multimode | For single laser system |
Doric mini cube | DORIC | 2 | DMC_1x2_FC-2FC | |
Compact power and energy meter console | Thorlabs | 1 | PM100D | Digital 4" LCD |
C-series slim power sensor 5-500mW | Thorlabs | 1 | S130C | Multiple detectors types are available; check with vendor |
3. In vivo Optogenetic Stimulation | ||||
Name of Equipment | Company | Quantity | Catalog Number | Comments |
Multimode fiber splitters | FONT Canada | 2 | Large core fiber optic 1 X 2 splitter, 50/50 ratio, FC connectors, ruggedized | Length, core size and numerical aperture can be specified when ordering; cost-effective smaller core sizes available |
Arbitrary waveform function generator (2 channel) | Rigol | 1 | DG1022 | Can control up to 2 lasers at once |
Fiber optic rotary joint (commutator) | DORIC* | 6 to 8 | FRJ_1X1_FC-FC | *Also available through Thorlabs and Prizmatix |
Animal patch cords (Custom Mono Fiberoptic Cannula with 10mm ferrules, FC/PC connector) | DORIC | 8 | MFP_200/240/900-0.22_2m_FC-MF2.5 | Length, core size and numerical aperture can be specified when ordering; alternatively, these can be made custom made in-house (see Sparta et al. 2012)9. |
PFP ceramic split sleeve, 2.5mm ID, 11.40mm length (25/pkg) | Precision fiber Products | 1 | SM-CS1140S | Used for attaching implanted fiber optic on animal to a light-delivering fiber patch cord with flat cleeve (FC) end |
Clear dust caps for Ø2.5 mm ferrules (25/pkg) | Thorlabs | 1 | CAPF | |
Metal cap for FC/PC and FC/APC mating sleeves | Thorlabs | 2 | CAPF1 | |
Thick-jacketed patch cords (custom order) | Thorlabs | 4 | 200um core, 0.22NA, FC/PC connectors multimode fibers | Length, core size, and numerical aperture can be specified when ordering |