För att motverka patogen spridning, värdceller omorganisera sin cytoskelettet att compartmentalize bakterier och framkalla autophagy. Använda Shigella infektion av vävnadsodlingsceller, värd och patogen hälsofaktorer som ligger denna process identifieras och karakteriseras. Med hjälp av zebrafisk modeller av Shigella-infektion, är den roll upptäckta molekyler och mekanismer som undersökts in vivo.
Shigella flexneri är en intracellulär patogen som kan fly från fagosomer att nå cytosolen, och polymerisera värd aktin cytoskelettet att främja dess motilitet och spridning. Nytt arbete har visat att proteiner involverade i aktin-baserade motilitet också är kopplade till autophagy, en intracellulär process avgörande för cell autonom immunitet nedbrytning. Påfallande, kan värdceller hindra aktin-baserade motilitet S. flexneri genom compartmentalizing bakterier inuti "Septin burar" och rikta dem till autophagy. Dessa observationer tyder på att en mer fullständig förståelse av septins, en familj av trådformiga GTP-bindande proteiner, kommer att ge nya insikter i processen för autophagy. Denna rapport beskriver protokoll för övervakning autophagy-cytoskeleton interaktioner orsakade av S. flexneri in vitro med användning av vävnadsodlingsceller och in vivo med användning av zebrafisk larver. Dessa protokoll möjliggör undersökning av intracellulära mechanisms som styr bakteriell spridning på molekylär, cellulär och hela organismen nivå.
Shigella flexneri, en gramnegativ invasiv enteropatogen bakterie, kan fly från fagosomer till cytosolen, och polymerisera värd aktin cytoskelettet att undgå cytosoliska immunsvar och främja inom och inter rörelsen 1,2. Trots förståelsen av aktin-baserade motilitet in vitro 3,4, de mekanismer som begränsar bakteriespridning in vivo har inte fullständigt klarlagda. Detta är avgörande för en mer fullständig förståelse av medfödd immunitet och värdförsvar.
Septins, en mycket konserverad familj av proteiner bland metazoans, är guanosintrifosfat (GTP) -bindande proteiner som monterar in i hetero-oligomera komplex och bildar opolära trådar som associerar med cellmembran och cytoskelettet 5,6. Senaste arbete har upptäckt att infekterade värdceller kan förhindra Shigella aktin baserade motilitet genom compartmentalizing bakterier riktade till autophAGY inne "Septin burar", avslöjar den första cellulära mekanism som motverkar aktin baserade motilitet 7,8. Ett stort öppet fält av utredning ligger nu i "Septin biologi och infektion". Septin montering, som orsakas av en mängd olika patogener (t.ex., Listeria monocytogenes 7,9,10, Mycobacterium Marinum 7,8, Candida albicans 11), kan dyka upp som en nyckelfråga i värdförsvar 5,12.
Autophagy, ett starkt konservativa intracellulär nedbrytningsprocessen, ses som en viktig komponent i cellautonoma immunitet på grund av dess förmåga att leverera cytosoliska bakterier till lysosomen 13,14. Men den roll som bakterie autophagy in vivo begränsar eller främjar bakteriell replikering fortfarande dåligt kända 15,16. Den zebrafisk (Danio rerio) har vuxit fram som ett ryggradsdjur modell för studier av infektioner eftersom det är optiskt tillgängligtpå larvstadier när det medfödda immunsystemet redan är funktionell 17,18. Senaste arbete har präglat känslighet zebrafisk larver till S. flexneri, ett paradigm för bakteriell autophagy 15, och har använt Shigella -zebrafish infektionsmodell för att studera manipulation av autophagy för antibakteriell behandling in vivo 19.
Denna rapport ger nya verktyg och analyser för att studera S. flexneri interaktioner med autophagy och cytoskelettet. I ett första steg, att protokoll övervaka autophagy-cytoskelettet interaktioner beskrivs med Shigella infektion av det humana epiteliala cellinjen HeLa. För att bedöma vilken roll autophagy-cytoskeleton interaktioner på infektionsprocessen Shigella in vitro metoder manipulera autophagy och cytoskeleton komponenter (med siRNA eller farmakologiska reagenser) tillhandahålls. Nytt arbete har visat att genom användning av Shigella infektion of zebrafisk larver, kan liknande analyser användas för att studera cellbiologin för infektion in vivo. Protokoll för att förbereda och infektera zebrafisk larver är detaljerade, och bedöma värd svar på Shigella-infektion in vivo, protokoll för att bestämma värd överlevnad och bakteriebörda infekterade larver finns. Metoder för att övervaka rekryteringen av Septin och autophagy markörer för att Shigella (antingen fast eller levande zebrafisk larver) och metoder för att testa vilken roll dessa processer in vivo [använder morfolinogrupper oligonukleotider (injiceras i 1-4 cell stadium embryon) eller farmakologiska reagens ( till direkt i zebrafisk badvattnet)] diskuteras också. Detta arbetsprogram förväntas ge insikt i de mekanismer som krävs för kontroll av infektion med cytosoliska värdsvar.
Vid övervakning autophagy och cytoskelettet in vitro med hjälp av vävnadskulturceller, kan protokollen i avsnitt 1 och 2 tillämpas på en mängd olika vävnadsodlingscelltyper. Dessutom, för att följa autophagy (t.ex. ATG8 / LC3 + ve autophagosomes) och cytoskelettet (t.ex.., Aktin svansar, Septin burar) dynamiken i realtid under Shigella-infektion genom att använda levande avbildning, kan vävnadsodlingsceller transient med hjälp GFP-, RFP- eller GFP-märkta konstruktioner som tidigare beskrivits 7,8. För att öka andelen celler infekterade med Shigella (dvs allmänt önskvärt för realtidsanalys med tanke på att Shigella kan invadera 5-30% av HeLa-celler på 100:. 1 MOI), direkt lägga 400 pl av Shigella (OD 600 = 0,3 -0.6) till celler i 2 ml MEM (serumsvältes) och vänta minst 1,5 timmar efter infektion tillräcklig bakterie posten, fly från phagosome, replikering, autophagy erkännande och Septin placering i kasse. Alternativt kan en använd Shigella M90T AfaI stam som uttrycker adhesinet AfaE och har mycket högre invasions förmågor i epitelceller jämfört med M90T-stammen 28. Att notera, det M90T AfaI stammen har ännu inte testats in vivo med hjälp av zebrafisk. Plattor av Shigella-kolonier kan hållas vid 4 ° C under 2-3 dagar och används för flera experiment. Men med tiden, kolonier av Shigella som har förlorat virulens plasmiden kan också absorbera Kongo Röd och verkar ha behållit sin virulensplasmid. Därför rekommenderar vi att använda färska bakteriella lager när det är möjligt.
Vid övervakning av cellbiologi infektions in vivo, protokoll som beskrivs i avsnitt 3 och 4 använder vildtyp AB line zebrafisk. Om du vill övervaka Shigella -leukocyte interaktioner, kan transgena zebrafisk linjer användas, t.ex. mpx: GFP eller LYZ: DsRed till visuellize neutrofiler 19,29,30 eller MPEG1: mCherry att visualisera makrofager 19,31. Att visualisera autophagy in vivo, kan användas GFP-Lc3 zebrafisk transgen linje 19,24 som beskrivs i avsnitt 3.8.
Att störa autophagy in vivo, måste bedömas experimentellt baserat på dess effektivitet för att hämma avskrift skarvning eller protein översättningen den effektiva morpholino oligonukleotiden dos. Det är lämpligt att utföra en titrering experimentet och bekräfta utarmning av RT-PCR (för skarv morfolino oligonukleotid) eller genom SDS-PAGE (för translationell morfolino oligonukleotid) 32. RNA-isolering från zebrafiskembryon eller larver kan utföras med guanidintiocyanat-fenol-kloroform-extraktion. För att extrahera protein från zebrafisk larver (8 till 15 larver / rör), mekaniskt homogenisera med hjälp av en mortelstöt i 200 pl lyseringsbuffert (1 M Tris, 5 M NaCl, 0,5 M EDTA, 0,01% oktylfenol etylenoxid condensate, och proteashämmare). Centrifugera rören vid 19.000 xg vid 4 ° C under 15 minuter och överför supernatanten till ett nytt rör. Lägg Laemmli-buffert och värma provet vid 95 ° C under 15 min. Lysat kan lagras vid -80 ° C tills det behövs, och kan utvärderas genom Western blotting som beskrivs i avsnitt 2.3.
Den zebrafisk är en utmärkt modell för in vivo drogansökan. Analys med hjälp morfolino oligonukleotider kan kompletteras med etablerade läkemedel för att manipulera autophagy (t.ex. rapamycin och bafilomycin). Oinfekterade och / eller infekterade larver kan behandlas med rapamycin (1,5 pM) eller bafilomycin (80 nM) utspädd i E2 och autophagic flussmedel kan utvärderas med Western blotting såsom beskrivits i 25,33. Kan utvärderas Konsekvensen av autophagy manipulation om resultatet av infektionen och överlevnad smittade larver som beskrivs i avsnitt 3.5.
Förutom att studera värdcellbestämningsfaktorer, in vitro och in vivo-protokoll kan användas för att bedöma bakteriefaktorer som krävs för autophagy erkännande, med hjälp av bakteriemutantstammar som differentiellt erkänns av autophagy, t ex., Shigella ΔicsA (Shigella protein ICSA rekryterar N-WASP och sedan Arp2 / 3 för aktin svans och Septin bur bildning, i sin frånvaro kan det inte finnas några aktin svansar, inga Septin burar) och ShigellaΔicsB (Shigella undviker autophagic svar via den bakteriella effektorprotein ICSB, som förhindrar rekrytering av autophagy maskiner till ICSA, i sin frånvaro Det kan finnas fler Septin burar, mer autophagy) 7,8.
Shigella är inte en naturlig patogen av zebrafisk och växer optimalt vid 37 ° C. Däremot har arbetet visat att virulensfaktorer som krävs för Shigella invasion, fly från fagocytiska vakuolen och replikering i cytosol kan uttryckas och är funktionella i zebrafisk larver vid 28 ° C 19. 28 ° C är den mest vanligen använda temperaturen för zebrafisk uppfödning och standardtemperatur för att säkerställa normal zebrafisk utveckling 23. Påfallande är de stora patogena händelser som leder till shigellos hos människor (dvs makrofager celldöd, invasion och multiplikation i epitelceller, cell-till-cell spridning, inflammatorisk förstörelse av värd epitel) troget i zebrafisk modell av Shigella-infektion 19.
Autophagy och cytoskeleton generna ubiquitously uttryckta och har ett brett spektrum av biologiska funktioner. Mus studier har visat att knockout av väsentlig autophagy 26 eller Septin gener 5 är embryonala dödliga, och det är troligt att en del av dessa gener också kommer att vara avgörande för zebrafisk utveckling (även om detta problem kan minskas av att zebrafisk har fleraparaloga gener 33). Om så är fallet, finns det flera alternativ för att övervinna detta problem, inklusive (i) användning av farmakologiska reagens för att reglera autophagy och cytoskelettet, (ii) morpholinos kan titreras ned, kan (iii) knockout av gener utformas för endast specifik cell typer, och / eller (iv) gener involverade i autophagic erkännande som inte är väsentliga för djurens utveckling (t ex., p62) kan riktas.
Medan zebrafisk är en idealisk modellsystem för att undersöka autophagy och cytoskelettet under Shigella-infektion, är molekylära verktyg för närvarande saknas. Fältet måste skapa nya verktyg och drivcellspecifikt uttryck av proteinerna av intresse. För att slå ner uttryck av autophagy / cytoskeleton gener, nya morfolinogrupper sekvenser behövs, och nya metoder för genomteknik (t.ex. TALEN, CRISPR / Cas9) kan också användas. Under tiden, flera verktyg som tidigare genererats för människa eller mus studierkan lika arbete för zebrafisk.
De intracellulära bakterier S. flexneri har vuxit fram som en exceptionell modellorganism för att ta upp viktiga frågor inom biologi, inklusive möjligheten för bakterier att kännas igen av immunsystemet 1,2. Värdcellen sysselsätter septins att begränsa motilitet av S. flexneri och rikta dem till autophagy, en kritisk komponent i cell autonom immunitet 7,8. Dessa observationer antyder en ny molekylär ramverk för att studera autophagy och dess förmåga att nedbryta cytosoliska bakterier. En viktig fråga är nu att till fullo tolka de underliggande molekylära och cellulära händelser, och för att validera dessa händelser som analyserats in vitro under bakteriell infektion in vivo med hjälp av relevanta djurmodeller. För detta ändamål har zebrafisk etablerats som en värdefull ny värd för analys av S. flexneri infektion 19. Interaktioner mellan bakterier och värdceller kan avbildas med hög upplösning, ochzebrafisk modellen bör visa sig vara användbara för förståelse av cellbiologi av Shigella infektion in vivo. Zebrafisk larver kan användas för att undersöka vilken roll bakterie autophagy i värdförsvaret, och arbete har visat att att den störning av autophagy kan påverka värd överlevnad som svar på Shigella-infektion 19.
Observationerna genereras från studier av Shigella, Septin placering i bur och autophagy in vitro med hjälp av vävnadskulturceller och in vivo med hjälp av zebrafisk larver kan ge grundläggande framsteg i förståelsen värdförsvar. De kan också föreslå att utveckla nya strategier för att bekämpa smittsamma sjukdomar.
En kritisk Syftet med denna rapport är att göra känsla av de molekylära och cellulära händelser som analyserats in vitro (dvs. autophagy, aktin svansar, Septin placering i bur) under bakteriell infektion in vivo i samband med en entire organism, med användning av zebrafisk larver. Om inte bekant med zebrafisk biologi och hantering, kan man hänvisa till i djup protokoll för korrekt zebrafisk djurhållning 23 och in vivo analys av zebrafisk infektion 19,35.
The authors have nothing to disclose.
Arbetet i SM laboratoriet stöds av en Wellcome Trust Research Career Development Fellowship [WT097411MA].
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number |
Bafilomycin A1 | Sigma-Aldrich | B1793 |
Blebbistatin | Sigma-Aldrich | B0560 |
Borosilicate glass microcapillars | Harvard Apparatus | 30038 |
Coarse manual manipulator | Narishige | M-152 |
Cytochalasin D | Sigma-Aldrich | C6762 |
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Molecular Probes | D1306 |
Dumont #5 fine tweezers | Fine Science Tools | 11254-20 |
Forchlorfeneuron | Sigma-Aldrich | 32974 |
Goat anti-mouse IgG (H+L) antibody | Molecular Probes | N/A |
Goat ant-rabbit IgG (H+L) antibody | Molecular Probes | N/A |
JetPEI transfection reagent | Polyplus transfection | 101-01N |
Latrunculin B | Sigma-Aldrich | L5288 |
LC3 antibody | Novus Biologicals | NB100-2220 |
Low melting agarose | Promega | V2111 |
MatTek glass bottom dish | MatTek corporation | P35G-1.0-14 |
MEM plus L-alanyl-L-glutamine | GIBCO | 41090028 |
MEM non-essential amino acids solution | GIBCO | 11140-035 |
Microinjector | Narishige | IM-300 |
Micropipette puller device | Sutter Instrument Co., Novato, | P-87 |
Mineral oil | Sigma-Aldrich | P35G-1.0-14 |
Monoclonal anti-tubulin, acetylated antibody | Sigma-Aldrich | T6793 |
Nocodazole | Sigma-Aldrich | M1404 |
N-phenylthiourea | Sigma-Aldrich | P7629 |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 |
Phalloidin | Molecular Probes | A12379 |
Phenol red solution | Sigma-Aldrich | P0290 |
Protease inhibitor cocktail | Roche | 4693116001 |
p62/SQSTM1 antibody | Cliniscience | PM045 |
Rapamycin | Sigma-Aldrich | R8781 |
Sodium pyruvate | GIBCO | 11360039 |
Transfection reagent | Life Technologies | 12252-011 |
Vectashield hard set mounting medium containing DAPI | Vector Laboratories | H-1500 |