For å motvirke patogen formidling, vertsceller omorganisere sin cytoskeleton å fordeler bakterier og indusere autofagi. Ved hjelp av Shigella-infeksjon av vevskulturceller, vert og patogen determinants bak denne prosessen er identifisert og karakterisert. Ved hjelp av sebrafisk modeller av Shigella-infeksjon, er rollen oppdaget molekyler og mekanismer undersøkt in vivo.
Shigella flexneri er en intracellulær patogen som kan flykte fra phagosomes å nå cytosol, og polymer verten aktin cytoskjelettet å fremme sin motilitet og formidling. Ny arbeid har vist at proteiner som er involvert i aktin-baserte motilitet er også knyttet til autophagy, en intracellulær degradering prosess avgjørende for celle autonom immunitet. Påfallende, kan vertsceller hindre aktin-baserte motilitet av S. flexneri ved compartmentalizing bakterier i 'septin bur' og oppgi dem til autofagi. Disse observasjonene tyder på at en mer fullstendig forståelse av septins, en familie av trådformede GTP-bindende proteiner, vil gi ny innsikt i prosessen med autofagi. Denne rapporten beskriver protokoller for å overvåke autofagi-cytoskjelett interaksjoner forårsaket av S. flexneri in vitro ved hjelp av vevskultur-celler og in vivo ved hjelp av sebrafisk larver. Disse protokollene aktiver etterforskning av intracellulære mechanisms som styrer bakteriespredning på molekyl, cellulær, og hele organismen nivå.
Shigella flexneri, en Gram-negative invasiv enteropatogene bakterier, kan flykte fra phagosomes til cytosol, og polymer verten aktin cytoskjelettet å unngå cytosolic immunresponser og fremme intra og inter bevegelse 1,2. Til tross for forståelsen av aktin-baserte motility in vitro 3,4, hvilke mekanismer begrenser bakteriespredning in vivo er ikke blitt fullstendig definert. Dette er kritisk for en mer fullstendig forståelse av medfødt immunitet og vert forsvar.
Septins, en svært konservert familie av proteiner blant metazoans, er guanosine trifosfat (GTP) -binding proteiner som montere inn hetero oligomeric komplekser og danner upolare filamenter som forbinder med cellemembraner og cytoskjelettet 5,6. Nyere arbeider har oppdaget at infiserte vertsceller kan hindre Shigella aktin basert bevegeligheten ved compartmentalizing bakterier rettet mot autophAGY inne 'septin bur', avslører den første cellulære mekanisme som motvirker aktin basert motilitet 7,8. Et stort åpent felt av etterforskningen nå ligger i 'septin biologi og infeksjon'. Septin montering, indusert av en rekke patogener (f.eks, Listeria monocytogenes 7,9,10, Mycobacterium marinum 7,8, Candida albicans 11), kan fremstå som et sentralt tema i vertsforsvar 5,12.
Autofagi, en svært konservert intracellulær nedbrytning prosessen, blir sett på som en viktig del av celle-autonome immunitet på grunn av sin evne til å levere cytosoliske bakterier til lysosome 13,14. Men til rollen bakteriell autofagi in vivo begrense eller fremme bakteriell replikering fortsatt dårlig forstått 15,16. Sebrafisk (Danio rerio) har dukket opp som et virveldyr modell for studiet av infeksjoner fordi det er optisk tilgjengeligpå larvestadier når det medfødte immunsystemet er allerede funksjonell 17,18. Nyere arbeider har preget mottakelighet av sebrafisk larver til S. flexneri, et paradigme for bakteriell autofagi 15, og har brukt den Shigella -zebrafish infeksjon modell for å studere manipulering av autofagi for antibakteriell behandling in vivo 19.
Denne rapporten gir nye verktøy og metoder for å studere S. flexneri interaksjoner med autofagi og cytoskjelettet. I et første trinn, å overvåke protokoller autophagy-cytoskjelettet interaksjoner er beskrevet ved hjelp av Shigella infeksjon av human epitelial cellelinje HeLa. For å vurdere rollen autofagi-cytoskjelett interaksjoner på Shigella-infeksjon prosessen in vitro, metoder manipulere autofagi og cytoskjelett komponenter (ved hjelp av siRNA eller farmakologiske reagenser) er gitt. Ny arbeid har vist at ved hjelp av Shigella-infeksjon of sebrafisk larver, kan tilsvarende analyser anvendes for å studere den cellebiologi for infeksjon in vivo. Protokoller for å forberede og infisere sebrafisk larver er detaljert, og vurdere verten respons på Shigella-infeksjon in vivo, protokoller for å bestemme verts overlevelse og bakteriell byrden av infiserte larver er gitt. Metoder for å overvåke rekruttering av septin og autofagi markører til Shigella (ved hjelp av enten fast eller levende sebrafisk larver) og metoder for å teste hvilken rolle disse prosessene in vivo [hjelp morfolino- oligonukleotider (injisert i 1-4 cellestadiet embryoer) eller farmakologiske reagenser ( lagt direkte til sebrafisk badevannet)] blir også diskutert. Denne arbeidsprogram er forventet å gi innsikt i de mekanismer som kreves for kontroll av infeksjon av cytosoliske verts responser.
Ved overvåkning autophagy og cytoskjelettet in vitro ved hjelp av vevskultur-celler, kan de protokoller som er beskrevet i avsnitt 1 og 2 anvendes på et bredt utvalg av vev kultur celletyper. Videre, for å følge autofagi (f.eks ATG8 / LC3 + ve autophagosomes) og cytoskjelettet (f.eks., Aktin haler, septin bur) dynamikk i sanntid under Shigella-infeksjon ved bruk av levende bilder kan vevskulturceller være forbigående transfektert ved hjelp GFP-, RFP- eller CFP-merkede konstruksjoner som tidligere beskrevet 7,8. Å øke andelen av celler infisert av Shigella (dvs. vanligvis ønskelig for sanntids analyse med tanke på at Shigella kan invadere 5-30% av HeLa celler ved 100:. En MOI), direkte legge 400 mL av Shigella (OD 600 = 0,3 -0,6) til cellene i 2 ml MEM (serum-sultet) og vent i minst 1,5 timer etter infeksjon for tilstrekkelig bakteriell oppføring, flykte fra phagosome, replikering, autophagy anerkjennelse og septin caging. Alternativt kan man bruke Shigella M90T AfaI stamme som uttrykker adhesin AfaE og har mye høyere invasjons egenskaper i epitel-celler i forhold til M90T stamme 28. Av notatet, den M90T AfaI belastningen har ennå ikke blitt testet in vivo ved hjelp av sebrafisk. Plater av Shigella kolonier kan holdes ved 4 ° C i 2-3 dager og brukt i flere eksperimenter. Imidlertid, over tid, kolonier av Shigella som har mistet virulens-plasmidet kan også absorbere Congo rød og synes å ha beholdt sin virulens-plasmidet. Av denne grunn anbefaler vi å bruke ferske bakterielle aksjer når det er mulig.
Når overvåke cellebiologi for infeksjon in vivo, protokoller beskrevet i kapittel 3 og 4 bruk villtype AB linje sebrafisk. For å overvåke Shigella -leukocyte interaksjoner, kan transgene sebrafisk linjer brukes, f.eks, MPX: GFP eller lyz: DsRed til visuellize nøytrofile 19,29,30 eller MPEG1: mcherry å visualisere makrofager 19,31. For å visualisere autofagi in vivo, kan brukes GFP-LC3 sebrafisk transgen linje 19,24 som beskrevet i kapittel 3.8.
For å forurolige autophagy in vivo, har den effektive morfolino oligonukleotid dose som skal vurderes eksperimentelt basert på dets effektivitet for å hemme transkripsjon spleising eller protein oversettelse. Det anbefales å utføre en titrering eksperiment og for å bekrefte uttømming av RT-PCR (for skjøte morpholino oligonukleotid) eller ved SDS-PAGE (for translasjonell morpholino oligonukleotid) 32. RNA isolert fra sebrafisk embryo eller larver kan utføres ved hjelp guanidiniumtiocyanat-fenol-kloroform ekstraksjon. For å utvinne protein fra sebrafisk larver (8 til 15 larver / rør), mekanisk homogenisere ved hjelp av en støter i 200 ul lyseringsbuffer (1 M Tris, 5 M NaCl, 0,5 M EDTA, 0,01% oktylfenol etylenoksyd kondensate, og proteasehemmer). Sentrifugerør ved 19.000 xg ved 4 ° C i 15 min og Overfør supernatanten til et nytt rør. Legg Laemmli buffer og oppvarming av prøven ved 95 ° C i 15 min. Lysater kan lagres ved -80 ° C inntil det er nødvendig, og kan evalueres ved Western-blotting som beskrevet i seksjon 2.3.
Sebrafisk er en utmerket modell for in vivo medikament søknad. Analyse ved hjelp morfolino- oligonukleotider kan kompletteres med etablerte medikamenter for å manipulere autofagi (f.eks rapamycin og bafilomycin). Uinfiserte og / eller infiserte larver kan behandles med rapamycin (1,5 pM) eller bafilomycin (80 nM) fortynnet i E2 og autophagic fluks kan evalueres ved Western-blotting som beskrevet i 25,33. Konsekvensen av autofagi manipulasjon på utfallet av infeksjonen og overlevelse av infiserte larver kan evalueres som beskrevet i kapittel 3.5.
I tillegg til å studere vertscelledeterminanter, in vitro og in vivo-protokoller kan brukes til å vurdere bakterielle determinants kreves for autofagi anerkjennelse, ved hjelp av bakterielle mutante stammer som er ulikt anerkjent av autofagi, f.eks., Shigella ΔicsA (den Shigella protein ICSA rekrutterer N-WASP og deretter Arp2 / 3 for aktin hale og septin bur formasjon; i sitt fravær det kan være noen aktin haler, ingen septin bur) og ShigellaΔicsB (Shigella unngår autophagic respons via bakteriell effektor protein IcsB, som hindrer rekruttering av autofagi maskiner til ICSA, i sitt fravær det kan være flere septin bur, mer autofagi) 7,8.
Shigella er ikke en naturlig patogen av sebrafisk og vokser optimalt ved 37 ° C. Imidlertid har arbeidet vist at virulens faktorer som kreves for Shigella invasjon, flykte fra phagocytic vakuole og replikering i cytosol kan uttrykkes og er funksjonelle i sebrafisk larver ved 28 ° C 19. 28 ° C er den mest brukte temperatur for sebrafisk oppdrett og standard temperatur for å sikre normal sebrafisk utvikling 23. Påfallende at de viktigste sykdomsfremkallende hendelser som fører til shigellose hos mennesker (dvs. makrofag celledød, invasjon og multiplikasjon innen epitelceller, celle-til-celle spredning, inflammatorisk ødeleggelse av verts epitel) reproduseres for sebrafisk-modellen av Shigella-infeksjon 19.
Autophagy og cytoskjelett gener er ubikvitært uttrykt, og har et bredt spekter av biologiske funksjoner. Muse studier har vist at utstansing av essensiell autophagy 26 eller septin gener 5 er i sin spede dødelig, og det er sannsynlig at noen av disse genene vil også være avgjørende for sebrafisk utvikling (selv om dette problem kan reduseres ved at sebrafisk har multipleParaloge gener 33). I så fall er det flere alternativer for å overvinne dette problemet, inkludert (i) bruk av farmakologiske reagenser for å regulere autophagy og cytoskjelettet, (ii) morpholinos kan titreres ned, kan (iii) utstansing av gener bli konstruert for bare bestemt celle typer, og / eller (iv) gener involvert i autophagic erkjennelse som ikke er essensielle for utvikling av dyr (f.eks., p62) kan være rettet.
Mens sebrafisk er et ideelt modellsystem for å undersøke autofagi og cytoskjelettet under Shigella-infeksjon, er molekylære verktøy for tiden mangler. Feltet må generere nye verktøy og driv celle spesifikk ekspresjon av proteiner av interesse. Å slå ned uttrykk for autofagi / cytoskjelett gener, er nye morfolino- sekvenser nødvendig, og nye metoder for genomet teknikk (for eksempel, TALEN, CRISPR / Cas9) kan også brukes. I mellomtiden, flere verktøy som tidligere er generert for menneske eller musestudierkan like arbeide for sebrafisk.
De intracellulære bakterier S. flexneri har dukket opp som en eksepsjonell modellorganisme for å ta opp sentrale problemstillinger i biologi, inkludert muligheten av bakterier for å bli gjenkjent av immunsystemet 1,2. Den vertscelle anvender septins å begrense bevegeligheten av S. flexneri og målrette dem til autofagi, en kritisk komponent i celle autonom immunitet 7,8. Disse observasjonene tyder på en ny molekylær rammeverk for å studere autofagi og dens evne til å degradere cytosoliske bakterier. Et stort problem nå er å fullt dechiffrere de underliggende molekylære og cellulære hendelser, og for å validere disse hendelsene som er analysert in vitro under bakteriell infeksjon in vivo ved hjelp av relevante dyremodeller. For å oppnå dette, har sebrafisk er etablert som en verdifull ny vert for analyse av S. flexneri infeksjon 19. Interaksjoner mellom bakterier og vertsceller kan avbildes med høy oppløsning, ogsebrafisk-modellen skulle vise seg nyttig for å forstå cellebiologi av Shigella-infeksjon in vivo. Sebrafisk larver kan brukes til å undersøke hvilken rolle bakteriell autofagi i host forsvar, og arbeidet har vist at at endringen av autofagi kan påvirke verts overlevelse som svar på Shigella-infeksjon 19.
Observasjonene generert fra studie av Shigella, septin caging og autofagi in vitro ved hjelp av vev kultur celler og in vivo ved hjelp av sebrafisk larver kan gi grunnleggende fremskritt i forståelsen av vertsforsvar. De kunne også foreslå utvikling av nye strategier for å bekjempe smittsomme sykdommer.
En kritisk Målet med denne rapporten er å gi mening av de molekylære og cellulære hendelser analysert in vitro (dvs. autofagi, aktin haler, septin caging) under bakteriell infeksjon in vivo i sammenheng med en entire organisme, bruker sebrafisk larver. Hvis ikke er kjent med sebrafisk biologi og håndtering, kan man referere til i dybden protokoller for riktig sebrafisk oppdrett 23 og in vivo analyse av sebrafisk infeksjon 19,35.
The authors have nothing to disclose.
Arbeidet i SM laboratoriet er støttet av en Wellcome Trust Forskning Karriereutvikling Fellowship [WT097411MA].
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number |
Bafilomycin A1 | Sigma-Aldrich | B1793 |
Blebbistatin | Sigma-Aldrich | B0560 |
Borosilicate glass microcapillars | Harvard Apparatus | 30038 |
Coarse manual manipulator | Narishige | M-152 |
Cytochalasin D | Sigma-Aldrich | C6762 |
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Molecular Probes | D1306 |
Dumont #5 fine tweezers | Fine Science Tools | 11254-20 |
Forchlorfeneuron | Sigma-Aldrich | 32974 |
Goat anti-mouse IgG (H+L) antibody | Molecular Probes | N/A |
Goat ant-rabbit IgG (H+L) antibody | Molecular Probes | N/A |
JetPEI transfection reagent | Polyplus transfection | 101-01N |
Latrunculin B | Sigma-Aldrich | L5288 |
LC3 antibody | Novus Biologicals | NB100-2220 |
Low melting agarose | Promega | V2111 |
MatTek glass bottom dish | MatTek corporation | P35G-1.0-14 |
MEM plus L-alanyl-L-glutamine | GIBCO | 41090028 |
MEM non-essential amino acids solution | GIBCO | 11140-035 |
Microinjector | Narishige | IM-300 |
Micropipette puller device | Sutter Instrument Co., Novato, | P-87 |
Mineral oil | Sigma-Aldrich | P35G-1.0-14 |
Monoclonal anti-tubulin, acetylated antibody | Sigma-Aldrich | T6793 |
Nocodazole | Sigma-Aldrich | M1404 |
N-phenylthiourea | Sigma-Aldrich | P7629 |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 |
Phalloidin | Molecular Probes | A12379 |
Phenol red solution | Sigma-Aldrich | P0290 |
Protease inhibitor cocktail | Roche | 4693116001 |
p62/SQSTM1 antibody | Cliniscience | PM045 |
Rapamycin | Sigma-Aldrich | R8781 |
Sodium pyruvate | GIBCO | 11360039 |
Transfection reagent | Life Technologies | 12252-011 |
Vectashield hard set mounting medium containing DAPI | Vector Laboratories | H-1500 |