Forskellige murine modeller af midterste cerebral arterie okklusion (MCAO) er meget udbredt i eksperimentel hjerneforskning. Her demonstrerer vi den model af transkraniel permanent distale MCAO der producerer konsekvent kortikal infarkt af en størrelse svarende til skade pålagt af flertallet af de menneskelige iskæmisk slagtilfælde.
Slagtilfælde er den tredje hyppigste årsag til død og den vigtigste årsag til erhvervet voksen handicap i de udviklede lande. Kun meget begrænsede terapeutiske muligheder er tilgængelige for en lille andel af patienter med slagtilfælde i den akutte fase. Aktuel forskning intensivt søger efter nye terapeutiske strategier og fokuserer i stigende grad på den sub-akutte og kroniske fase efter slagtilfælde, fordi flere patienter kan være berettiget til terapeutiske indgreb i en længere tid vindue. Disse forsinkede mekanismer omfatter vigtige patofysiologiske veje såsom post-takts inflammation, angiogenese, neuronal plasticitet og regenerering. For at analysere disse mekanismer og efterfølgende evaluere nye lægemiddelkandidater, der eksperimentelle slagtilfælde modeller med klinisk relevans, lav dødelighed og høj reproducerbarhed efterspurgt. Desuden mus er de mindste pattedyr, hvor en fokalt slagtilfælde læsion kan induceres, og for hvilke et bredt spektrum af transgene modeller ertilgængelige. Derfor beskriver vi her musemodel af transkraniel permanent koagulation af den midterste cerebrale arterie via elektrokoagulation distalt af lenticulostriatal arterier, den såkaldte "koagulation model". Den resulterende infarkt i denne model er placeret hovedsageligt i cortex; den relative infarktvolumen i forhold til hjernens størrelse svarer til størstedelen af de menneskelige slagtilfælde. Desuden modellen opfylder de ovennævnte kriterier for reproducerbarhed og lav dødelighed. I denne video viser vi de kirurgiske metoder for slagtilfælde induktion i "koagulation model", og rapportere histologiske og funktionelle analyseværktøjer.
Slagtilfælde er den tredje hyppigste årsag til død og en af de vigtigste årsager af erhvervet voksen handicap i de udviklede lande 1.. Ca. 80% af denne akutte neurologiske sygdom er forårsaget af hjerneiskæmi følge af en obstruktion af cerebral blodstrøm, mens omkring 15% er forårsaget af en intracerebral blødning 2. Trods igangværende forskning, intravenøs administration af vævsplasminogenaktivator er den eneste godkendte farmakologisk behandling af iskæmisk slagtilfælde indtil videre, og kun tilgængelig for et mindretal af patienter med slagtilfælde på grund af den korte godkendte tidsvindue på 4,5 timer efter strokedebut 3,4. Da der ikke er in vitro-modeller, som kan ordentligt modellere komplekse samspil mellem hjernen, karsystem og systemiske patofysiologiske mekanismer under slagtilfælde, dyremodeller er afgørende for præklinisk slagtilfælde forskning.
Derfor har flere iskæmisk slagtilfælde modeller er udviklet i en variabelETY af arter. En af de mest almindeligt anvendte takts modeller er "filamenter", hvor en sutur glødetråd transient indføres i arteria carotis interna og videresendes indtil spidsen okkluderer oprindelsen af arteria cerebri media (MCA), hvilket resulterer i et stop af blodgennemstrømningen og efterfølgende hjerne infarkt af subkortikale og i tilfælde af langvarig okklusion også kortikale regioner 5,6. I photothrombotic modeller af iskæmisk slagtilfælde, er en fotokemisk okklusion af bestrålede kortikale fartøj opnås efter injektion af en photosensitizer resulterer i små, lokalt afgrænsede læsioner 7. Den permanente okklusion af MCA distale af lenticulostriatal arterier kan opnås ved en ligering af arterien, dets forbigående sammenpresning eller ved permanent koagulation 8,9. Den resulterende infarkt i denne model overvejende påvirker neocortex 10 fordi okklusion af MCA i denne model er distal i forhold til lenticulostriatal arterier, der forsyner basalganglierne.
Da hovedparten af de menneskelige slagtilfælde læsioner er beliggende i det område af den midterste cerebral arterie, alle de fælles takts modeller ligne tillukning af MCA eller én af sine filialer 11. MCA er en af de store arterier, der giver blodtilførsel til hjernen; den hidrører fra den interne halspulsåren, ruter langs sidelinjen sulcus, hvor det så grene og projekter til basalganglierne og de laterale overflader af frontal, parietal og tindingelapperne, herunder den primære motor og sensoriske cortex. Højre og venstre MCA er forbundet til den forreste cerebrale arterier og den bageste kommunikere arterier, der forbinder til de bageste cerebrale arterier, skaber Circle of Willis (figur 1).
Som tidligere rapporteret af Carmichael et al. 11. infarkter modelleret af den distale cerebri Arteri Okklusion (MCAO) model i mus omfatte omkring 10-15% af den halvkugle, og derved efterligne et flertal af de menneskelige slagtilfælde læsioner, som er placeret i det kortikale MCA territorium 11,12. I 1981, Tamura et al. Beskrevet en permanent, transkraniel MCAO koagulation model i rotter 8. Men den model, der er beskrevet af Tamura involverede en proksimal okklusion af MCA med henblik på at omgå de mere distale tvedeling af arterien. Således oprindelige "Tamura-model" inducerer ikke blot corticale men også striatale læsioner, svarende til læsioner opnået ved "filament-model" 6. Her beskriver vi den permanente distale MCAO modellen ved transkraniel elektrokoagulation i mus. Derudover rapporterer vi relaterede histologiske og funktionelle metoder til analyse af udfald af slagtilfælde i denne model. Alle metoder er baseret på standard operationelle procedurer, der er udviklet og anvendt i vores laboratorier.
Den nuværende protokol beskriver den eksperimentelle slag model af distal, permanent MCAO ved transkraniel elektrokoagulation – den såkaldte "koagulation-model". Denne model er i mellemtiden blevet en af de hyppigst anvendte dyremodeller i eksperimentel slagtilfælde forskning 12. Sammenlignet med andre fokale hjerne iskæmimodeller, koagulering model som præsenteret i denne video har den fordel, at en meget kort driftstid på ca 10 minutter, når de udføres af en uddannet videnskabsmand. Derfor kan korte anæstesi tider opnås i denne model, hvilket er et positivt træk af en eksperimentel slagtilfælde model, fordi virkningen af bedøvelsesmidler på neurobeskyttelse og slagtilfælde udfald er velkendt 15.. Som tidligere beskrevet af Carmichael et al. 11. Vi bekræfter, at det resulterende infarktvolumen og lokalisering efter distale permanent MCA koagulation svarer til iskæmiske hjernelæsioner i størstedelen af humanestreger i forhold til hjernens størrelse. Humant slagtilfælde er hovedsageligt små i størrelse med læsioner på ca 5-15% af halvkuglen, baseret på tidligere befolkningsundersøgelser og kliniske imaging forsøg 16-18 i modsætning til omfattende slagtilfælde læsioner med trykstyrke hjerneødem, som forekommer i mindre end 10% af kliniske slagtilfælde 19. Derved kan slagtilfælde læsioner i MCA område på omkring 12% af den halvkugle opnås ved den præsenterede model betragtes som et translationelt relevant slagvolumen. Det skal dog tages i betragtning, at forskellige musestammer eller brugte anæstesi protokoller kan påvirke den resulterende læsion bind 20.
Dødeligheden i observationsperioden efter slagtilfælde induktion i denne model er stort set fraværende. Den samlede dødelighed på mindre end 5% hovedsageligt består af dødsfald i drift på grund af anæstesiologisk komplikationer eller offer, fordi opnåelsen af udelukkelseskriterier. For at berettige den lave variability af denne model og dens fremragende reproducerbarhed, foreslår vi følgende udelukkelseskriterier: 1) Enhver subaraknoidalblødning under operationen. 2) Betjening er længere end 15 min. 3) rekanalisering af MCA efter to forsøg for elektrokoagulering med kun forbigående MCAO. Desuden skal undersøges dagligt efter MCAO (grundlæggende fysiologiske adfærd, pels udseende og kropsvægt) til at styre for smerter, ubehag eller sygdom adfærd dyr.
Kunne gennemføres en række foranstaltninger til analyse af slagtilfælde udfald ligesom laser speckle måling, magnetisk resonans, adfærdsmæssige test eller histologisk analyse. I denne protokol giver vi eksemplariske metoder til opførsel analyse og infarktvolumen analyse. Adskillige test for adfærdsanalyse efter fokal hjerneiskæmi er blevet udviklet og anvendt i eksperimentel slagtilfælde forskning. Egnede test for sensomotoriske dysfunktion tidligere brugt af vores gruppe i denne slagtilfælde model 21,22 vire rotarodtesten 23 klistermærketest 24, Hjørne test 25 og den Cylinder test 13, som er påvist i denne video. Cylinderen test konsekvent skildrer motor asymmetri i den akutte fase efter distal permanent MCAO og registrerer fortløbende genvinde af motorisk funktion også.
På trods af de åbenlyse fordele visse begrænsninger i denne slagtilfælde-modellen skal tages i betragtning. Først er en trepanation af kraniet nødvendig for at koagulere arterien, hvorved der produceres en potentiel adgang for peri-operative infektioner i hjernen, selv om bakterielle infektioner i operationssåret, tidsmæssig muskel eller selve hjernen aldrig blevet opdaget af os selv eller dokumenteret af andre, der bruger denne model. Endvidere kan mekanisk beskadigelse cortex under fremstillingen og koagulering ikke udelukkes, men kan begrænses ved omhyggelig boring og fjernelse af kraniet, konstant befugtning af det kirurgiske sted og minimal ne vendigt elektrokoagulation (se udelukkelseskriterier). Selvom løbet af MCA som afbildet i figur 2 findes i størstedelen af C57BI / 6 mus, beskriver vi i protokollen, hvordan man videre i normale variationer af fartøjet naturligvis at minimere variabilitet model. Desuden foreslår vi brug af flere (3 i tilfælde af forgrening, 2 uden tvedeling af MCA) okklusion sites for at minimere risikoen for en delvis recanalization af MCA, som vores erfaring er en vigtig faktor for variabilitet denne model.
I form af adfærdsmæssige test kan kun mindre adfærdsmæssige mangler påvises i ovennævnte adfærdsmæssige test og funktionel regenerering kan observeres inden for den første uge efter slagtilfælde. Således kan mere avancerede testsystemer med højere følsomhed og kvalitative testparametre som fagmanden nå prøven 27 være mere egnede til at påvise langsigtet funktionelle resultat i denne model.
NDHOLDET "> Endelig, på grund af den permanente koagulation af MCA ingen reperfusion kan opnås, hvilket er en funktion, observeret i en betydelig procentdel af patienter med slagtilfælde på grund af spontan clotlyse eller terapi 28. imidlertid en tidligere beskrevet tromboembolisk slagtilfælde model 26 tilvejebringer mulighed for en gratis slagtilfælde model med reperfusion af cortical hjerne iskæmi. Tilsammen høj reproducerbarhed, er mulig langvarig observation på grund af minimal dødelighed og sammenlignelige relative infarkt volumen og lokalisering i forhold til den menneskelige slagtilfælde skelne "koagulation model" som en værdifuld model for grundforskning og translationel slagtilfælde forskning.The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev finansieret af excellence klynge af den tyske forskningsfond "München Cluster for Systems Neurology (Synergy)" og af Daimler-Benz fundament til AL
Camera Canon Eos 500D | Canon | optics: 18-55 mm; 30 fps; 640×480 video function | |
Mirror | Kristallform | 2677089 | 30×30 cm |
Transparent acrylic glass cylinder | H&S Kunststofftechnik | diameter: 8 cm, height: 25 cm | |
Heating blanket | FHC DC Temperature Controller | ||
Fine Scissors | FST | 15000-00 | |
Mayor Scissors | FST | 1410-15 | |
Forceps | FST | 11616-15 | |
Cotons | NOBA Verbondmitel Danz | 974116 | |
Saline solution | Braun | 131321 | |
Bepanthen pomade | Bayer | ||
Isoflurane | Abbot | B506 | |
Anesthesia system for isoflurane | Drager | ||
Stereomikroskop | Zeiss | Stemi DV4 | |
Electrosurgical device | ERBETOM ICC 80/50 HF-Chirurgiegerät | ||
Drill | Proxxon | D-34343 | |
Ketamine | Inresa Arzneimittel GmbH | ||
Xylacine | Albrecht | ||
5ml Syringe | Braun | ||
Phosphate Buffered Saline PH: 7,4 | Apotheke Innestadt Uni Munchen | P32799 | |
Isopentane | Fluka | 59070 | |
Cryostat | Thermo Scientific CryoStarNX70 | ||
Superfrost Plus Slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
Cresyl violet | Sigma Life Science | C5042-10G | |
Acetic Acid | Sigma Life Science | 695092 | |
Ethanol 70% | CLN Chemikalien Laborbedorf | 521005 | |
Ethanol 96% | CLN Chemikalien Laborbedorf | 522078 | |
Ethanol 99% | CLN Chemikalien Laborbedorf | ETO-5000-99-1 | |
Roti-Histokit mounting medium | Roth | 6638.1 | |
C57Bl/6J mice | Charles River | 000664 |