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Medicine

Contrôlée corticale modèle d'impact pour Traumatic Brain Injury

doi: 10.3791/51781 Published: August 5, 2014

Introduction

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Lésion cérébrale traumatique (TBI) est définie comme une altération de la fonction du cerveau, ou d'autres preuves de la pathologie du cerveau, causée par une force extérieure 1. TCC restent un grave problème de santé à travers le monde, notamment aux États-Unis. Selon les Centers for Disease Control and Prevention, au moins 1,7 million de TCC se produisent chaque année aux Etats-Unis résultant de 30,5% de tous les décès liés à des blessures. En 2000, les coûts médicaux directs et les coûts indirects de la TCC ont totalisé un montant estimé à $ 76,5 milliards aux États-Unis seulement. Bien que les progrès technologiques et thérapeutiques depuis des décennies précédentes ont permis d'améliorer la qualité et la durée de vie des personnes souffrant de TCC, aucune pharmaceutique efficace ou des traitements préventifs existent actuellement. En raison de la complexité et des effets de grande portée de TCC, y compris les lésions tissulaires, la mort cellulaire, et la dégénérescence de l'axone, il n'ya pas deux blessures sont identiques; donc, pas de modèle de TBI courant pour animaux reproduit fidèlementtous les aspects de TBI comme on le voit chez les humains. Cependant, les modèles animaux ne fournissent la capacité de produire des blessures presque identiques nécessaires pour enquêter sur divers effets de TBI avec l'espoir de comprendre davantage les manifestations cliniques de la TCC.

Le modèle commandé incidence cortical (CCI) utilise un système d'impact pour fournir un impact physique à la dure-mère d'un animal exposé. Il induit TCC allant de légère à sévère similaires à ceux rencontrés par les humains. Cette blessure a été caractérisée sur le furet 2 et a ensuite été adapté pour une utilisation chez le rat 3,4, souris 5-7, et les moutons 8. Depuis la première caractérisation, le site de la lésion a été placé à la fois au-dessus de la ligne médiane de 2,9 et le cortex latéral 10. CCI fournit une méthode facile et précise d'enquêter sur les effets et les traitements potentiels pour les TCC.

En plus du modèle de CCI, la percussion de fluide et la perte de poids sont des modèles de commonly utilisé pour produire les TCC. Cependant, ces modèles présentent des limitations, y compris les moins de contrôle sur les paramètres de blessures, produire des changements histopathalogical pas vu dans les TCC humaine, et une plus grande incidence de décès accidentel chez les souris 3,5,10. Le modèle de l'onde de choc est également utilisé pour produire des TCC. Bien que le modèle de l'onde de choc ne reproduit pas les changements observés histopathalogical suite d'un choc mécanique, ce modèle ne produit précisément TCC rencontrées notamment par des militaires 11. Le modèle d'impact cortical contrôlé est facile à contrôler grâce au contrôle précis de paramètres de déformation tels que le temps, la vitesse et la profondeur de l'impact 5. Une telle précision permet de reproduire les blessures à peu près identiques à travers tout un groupe d'animaux plus réalisables. Plus important encore, la CCI reproduit TCC avec des caractéristiques observées dans les TCC humaine 12. Cependant, il n'existe pas de modèle animal unique qui est tout à fait réussi à reproduire le spectre complet de pathologique changes observés après TBI. D'autres recherches sont nécessaires pour révéler pleinement les changements aigus et chroniques qui se produisent après TBI.

Deux types de blessures surviennent après un TCC: blessures primaires et secondaires. La lésion primaire se produit au moment de l'impact et n'est pas sensible à des traitements thérapeutiques; Toutefois, les blessures secondaires qui persistent après la blessure initiale sont soumis à des traitements 13. Le modèle d'impact corticale contrôlée produit la lésion primaire, permettant ainsi aux chercheurs d'étudier les effets de la TCC et traitements thérapeutiques potentiels pour les effets potentiellement durables de blessures secondaires. Les domaines de recherche potentiel en utilisant le modèle de la CCI comprennent la mort neuronale, l'oedème cérébral, la neurogenèse, effets vasculaires, les changements histopathalogical, et les déficits de mémoire et plus 3,13-16.

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Protocol

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Protection des animaux
Homme C57 BL / 6 souris ont été logées en groupe et maintenus dans un cycle 12/12 h de lumière / obscurité avec une connexion pour accéder à la nourriture et de l'eau ad libitum. Les animaux utilisés dans ce protocole étaient âgés de 10-12 semaines. Toutes les procédures ont été réalisées selon des protocoles approuvés par le Comité de soins et l'utilisation des animaux de l'Université d'Indiana.

1. Préparation chirurgicale

  1. Anesthésier la souris en utilisant un mélange de kétamine / xylazine (87,7 mg / ml de kétamine et de 12,3 mg / ml de xylazine) et à administrer (1 ml / kg) par injection IP.
  2. Raser la tête de la souris entre les oreilles.
  3. Appliquer une gelée à base de pétrole pour les yeux de la souris afin d'éviter le dessèchement pendant la chirurgie.
  4. Nettoyer la zone rasée avec 10% de l'iode. Ensuite, utilisez 70% d'éthanol pour nettoyer l'iode.
  5. Fixez la tête de la souris dans le cadre stéréotaxique utilisant les barres d'oreilles et la plaque de morsure. S'assurer que le cerveau est stable.

2. Craniectomie

  • Faire une incision longitudinale dans le milieu de la tête avec des ciseaux. Utilisez une pince hémostatique pour maintenir la peau sur le côté gauche.
  • Utilisez un coton-tige pour enlever le sang et les tissus de l'os pour exposer le crâne. Laisser crâne exposé à sécher pendant 1 min.
  • Utilisez une pince pour appliquer la pression et faire en sorte que le crâne reste immobile. Identifier les repères anatomiques Lambda (caudale aspect) et Bregma (aspect le frontal). Dessiner un cercle au centre du bregma et lambda avec un diamètre de 4 mm et de 0,5 mm de la ligne médiane.
  • Utilisez une perceuse pour couper le long du cercle marqué. Soufflez doucement la poussière d'os loin. Ne pas percer complètement à travers l'os pour éviter d'endommager la dure-mère.
  • Utilisez une pince pour retirer les os et exposer la dure-mère.
  • 3. Impaction

    Le système d'impact comprend un boîtier de commande pour définir les paramètres d'impact, un actionneur pour effectuer l'impaction, et un cadre stéréotaxique pour sécuriser l'acteuator et chef de la souris pour l'impact.

    1. Pré-régler la vitesse de l'actionneur à 3 m / sec avant l'intervention chirurgicale.
    2. Prédéfinie différente profondeur de déformation pour induire différents niveaux de gravité des blessures. des profondeurs de déformation de 0.0-0.2 mm, 0,5-1,0 mm et 1,2-2,0 mm entraînerait TCC légers, modérés et sévères, respectivement. Ce protocole a expliqué comment parvenir à une lésion cérébrale modérément sévère avec une profondeur de 1 mm de déformation en utilisant une vitesse de 3 m / sec.
    3. Fixez l'actionneur au titulaire dans le cadre stéréotaxique et d'utiliser les micro-manipulateurs déplacer pour fixer le, bout plat rond de l'actionneur (de 3 mm de diamètre) dans le centre de la zone ouverte du crâne. Puis ajustez la pointe à un angle parallèle à la surface de lieu de l'impact.
    4. Établir le point zéro par déplacement vers le bas de l'actionneur dans le modèle s'étendant jusqu'à la pointe touche la surface du site d'impact. Ensuite, réglez le canal de Z sur le panneau de contrôle stéréotaxique à zéro.
    5. Rétracter la pointe de frappetout en bougeant l'actionneur vers le bas de 1 mm.
    6. Appuyez sur le bouton de l'impact de grève le site de la lésion et d'atteindre une profondeur de 1 mm de déformation.

    4. Blessures fermeture du site

    1. Utilisez applicateurs de coton-tige pour enlever tout effet de sang après, mais ne touchez pas la zone de blessure.
    2. Placez la souris sur un bloc chaud pour maintenir la température du corps.
    3. Une fois le saignement a cessé, suturer la plaie fermée. Mettre l'animal dans la cage propre et lui permettre de se remettre de la chirurgie la nuit sur le pavé chaud.
    4. Administrer buprénorphine 0,05-0,10 mg / kg SQ chaque 8-12 heures pendant 2 jours après la chirurgie.

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    Representative Results

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    Le modèle d'impact corticale contrôlée produit TCC allant de sévérité légère à sévère. Après l'impact de la quantité de gonflement crânien, hémorragie, et la distorsion du crâne sur le site de l'impact, révéler la gravité des blessures résultant des paramètres de vitesse et de profondeur de déformation. TCC légers se traduisent par un gonflement crânien sur le site d'impact et un léger saignement en raison de la violation de la durée limitée. Un TCC modéré présente gonflement crânien et a augmenté de saignement en raison de la dure-violation sur impaction (Figure 1). La différence entre un TCC modéré et sévère peut être difficile de distinguer jusqu'à visualisé sur tissus fixés à l'aide d'un microscope (figure 2); Toutefois, un TBI sévère peut parfois afficher la distorsion très amplifiée et crânienne après l'impact de l'enflure. Le modèle de CCI peut être utilisé pour déterminer les effets de multiples aspects de TCC, y compris une déformation du tissu (figure 2), la mort des neurones, et des changements histopathalogical.

    = "Jove_content" fo: keep-together.within page = "always"> Figure 1
    Figure 1. Modèle d'impact cortical pour lésion cérébrale traumatique modérée contrôlée. La procédure de l'impact cortical contrôlé est illustrée dans cette figure. A) Le chef de la souris a été fixé de manière stable sur le cadre stéréotaxique avec barre de l'oreille et de la bouche bits. B) Le crâne gauche était exposé et 4 mm a été appelée cercle au centre du bregma et lambda. C) L'os a été enlevé par le forage afin de générer une fenêtre pour l'impact. D) L'actionneur a été attaché sur le cadre stéréotaxique et le point zéro sur l'axe Z a été mettre en place. E) Le tissu cérébral a été déformée et causé des saignements avec un impact. F) Le saignement s'est arrêté plusieurs minutes après l'impact et le sang a été enlevé par un coton./ Ftp_upload/51781/51781fig1highres.jpg "target =" _blank "> Cliquez ici pour agrandir l'image.

    Figure 2
    Figure 2. Histologie pour Modéré lésions cérébrales traumatiques. A) Un cerveau de souris vieux 10-12 semaines naïf a été retiré. B) Un cerveau de souris vieux 10-12 semaine a été utilisé comme témoin fictif. C) Le cerveau d'une souris vieux 10-12 semaine a été retiré 24 heures après un modéré TBI en utilisant le modèle de la CCI. D) Le cerveau d'une souris vieux 10-12 semaine a été enlevé 6 semaines après un TCC modéré en utilisant le modèle de la CCI. Un renfoncement dans le tissu cérébral est évident sur ​​le site de l'impact. E) coloration de Nissl a été réalisée sur une commande fictive de cerveau de souris vieux 10-12 semaines pour montrer l'histologie normale. F) coloration de Nissl a été réalisée sur un vieux 10-12 semaines cerveau de souris qui avaitreçu un TCC modéré en utilisant le modèle de la CCI. Une cavité est visible s'étend profondément dans le cortex. Cliquez ici pour agrandir l'image.

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    Discussion

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    Les étapes les plus importantes pour générer des succès TCC cohérentes en utilisant un système d'impact magnétique électronique pour provoquer une CCI sont: 1) fixer de façon stable la tête de la souris dans le cadre stéréotaxique; 2) la génération de la même taille de la fenêtre de l'os entre les souris et l'enlèvement de l'os sans endommager la dure-dessous pendant craniectomy; 3) positionner correctement la pointe de percussion dans le centre de la zone ouverte et établir le point zéro avant d'impacter.

    A la tête de la souris doit être fixé dans le cadre stéréotaxique très bien avant l'impact. Fixation lâche va générer d'importantes variations du niveau de la blessure. Pour assurer la fixation est stable, utiliser une pince pour appliquer une pression sur le crâne une fois la tête de la souris est fixé dans le cadre stéréotaxique et confirmer que le crâne reste immobile. Prendre des mesures de précaution pour éviter l'infection du crâne exposé. Après avoir exposé le crâne, passer à la partie la plus difficile de la chirurgie de l'impact cortical contrôlé: le forage d'un circulairecouper dans le crâne sans endommager la dure-mère en dessous.

    La taille optimale de la pointe de l'outil de forage est de 0,5 mm. La vitesse convenable est 10.000-20.000 rpm; Toutefois, en utilisant une vitesse plus élevée peut faciliter le forage d'un meilleur fenêtre osseuse. Le forage se produire de la chaleur qui peut endommager le cerveau, en particulier chez les jeunes souris dont les os et la durée sont fixés. Pour éviter d'endommager le cerveau, appliquer une solution saline à la surface du crâne pendant le forage. L'application de la solution saline, il sera nécessaire d'utiliser un microscope de dissection afin de voir le cercle percé. Lorsque les souris vieillissent, un espace se développe entre l'os et la durée, ainsi l'effet de la chaleur générée par le forage serait de produire un impact minimal.

    Pendant le forage, déplacer le trépan de forage lentement et en permanence le long d'une trajectoire circulaire. Sinon, le bit peut se déplacer hors de la ligne ou aller directement à travers l'os et endommager le tissu cérébral. Toucher délicatement la fenêtre de l'os en utilisant une pince à inspecter le forage. Si l'EA d'os de crâneSily se déplace de haut en bas, déplacer la pointe fine de la pince dans l'espace entre l'os et la dure-mère. Soulevez ensuite à retirer l'ensemble de l'os, créant ainsi la fenêtre. Ne pas soulever l'os d'un côté à l'autre, car cela peut blesser les tissus du cerveau. Faire fenêtres osseuses de taille identique est essentiel pour générer des lésions cérébrales compatibles. En raison de la pression intracrânienne, le cerveau va bomber de la zone ouverte, une fois l'os enlevé, provoquant ainsi la déformation du cerveau mineur. Si la taille de la fenêtre varie osseuse, le niveau de déformation du cerveau est différente, en étant similaire à la courbe de la surface du cerveau dans le lieu de l'impact. L'os n'a pas été replacée sur le site d'impact suite à une chirurgie car il est plus petit que la fenêtre de l'os. Cela entraînerait l'os d'adhérer directement au tissu cérébral. Appliquer de la colle pour sceller la fenêtre osseuse pourrait entraîner une augmentation de la pression intracrânienne. D'examen d'un site d'impact 3 semaines après une chirurgie de la CCI une nouvelle membrane a été trouvé recouvrant le tissu cérébral wième pas de croissance du tissu cérébral à l'extérieur de l'emplacement de l'impact. Pas de changements histologiques connus se produisent en raison d'un manque de recouvrement des os.

    Le système de l'impact de l'aimant électronique est extrêmement stable et peut contrôler avec précision la vitesse et la profondeur de déformation. Toutefois, en raison de la conception, la bobine relié à la pointe de l'impact peut se déplacer tout en frappant et entraîner un changement de lieu de l'impact. C'est la principale cause de blessures incompatibles, sauf pas d'autres complications. En dépit de la possibilité de déplacer le point d'impact, le procédé de l'impact cortical contrôlé reste plus précise et plus facile à contrôler par rapport à la percussion de fluide et des procédés de chute de poids, ce qui rend l'ICC un procédé préféré pour l'étude à court terme et à long terme des effets de TBIs , ainsi que des traitements thérapeutiques possibles. Bien qu'il soit important pour la recherche TBI, enlever une partie du crâne avant l'impact limite la pertinence clinique du modèle de CCI.

    Le protocole ci-dessus describes la procédure pour produire un TCC modéré dans une souris. Le site d'impact peut aller de 1 à 6 mm de diamètre en fonction de l'animal et de la gravité de la blessure souhaitée. Bien que le protocole indiqué la pointe d'impact est de 3 mm de diamètre, un diamètre de 4 mm craniectomy a été effectuée dans l'os afin d'empêcher la suppression accidentelle. En plus de la modification de la taille du lieu de l'impact, la vitesse de l'impacteur et la profondeur de la déformation peut être ajustée pour atteindre la sévérité nécessaire.

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    Acknowledgments

    Ce travail a été soutenu par un financement du cordon Indiana épinière et cerveau de subventions de recherche de blessures (200-12) SCBI, Ralph W. et Grace M. bourse de recherche Showalter, Indiana University Research Grant biologique, NIH subventions RR025761 et 1R21NS072631-01A.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Povidone-iodine 7.5% Purdue product L.P. Surgical scrub
    Cotton tipped applicators Henry Schein 100-6015 Remove blood and debris
    Scissor Fine Science Tools 14084-08 Surgery
    Forcept Fine Science Tools 11293-00 Surgery
    Hemostat Fine Science Tools 13021-12 Surgery
    Rechargeable Cordless Micro Drill Stoelting 58610 Combine with Burrs for generating the bone window
    Burrs for Micro Drill Fine Science Tools 19007-05
    Suture monofilament Ethicon G697 Suture
    tert-Amyl alcohol Sigma 152463-250ML Making 2.5% Avertin
    2,2,2-Tribromoethanol Sigma T48402-25G Making 2.5% Avertin

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Menon, D. K., Schwab, K., et al. Position statement: definition of traumatic brain injury. Arch Phys Med Rehabil. 91, (11), 1637-1640 (2010).
    2. Lighthall, J. W., Dixon, C. E., et al. Experimental models of brain injury. J Neurotrauma. 6, (2), 83-97 (1989).
    3. Dixon, C. E., Clfton, G. L., et al. A controlled cortical impact model of traumatic brain injury in the rat. J Neurosci Methods. 39, (3), 253-262 (1991).
    4. Scheff, S. W., Baldwin, S. A., et al. Morris water maze deficits in rats following traumatic brain injury: lateral controlled cortical impact. J Neurotrauma. 14, (9), 615-627 (1997).
    5. Smith, D. H., Soares, H. D., et al. A model of parasagittal controlled cortical impact in the mouse: cognitive and histopathologic effects. J Neurotrauma. 12, (2), 169-178 (1995).
    6. Hannay, H. J., Feldman, Z., et al. Validation of a controlled cortical impact model of head injury in mice. J Neurotrauma. 16, (11), 1103-1114 (1999).
    7. Natale, J. E., Ahmed, F., et al. Gene expression profile changes are commonly modulated across models and species after traumatic brain injury. J Neurotrauma. 20, (10), 907-927 (2003).
    8. Anderson, R. W., Brown, C. J., et al. Impact mechanics and axonal injury in a sheep model. J Neurotrauma. 20, (10), 961-974 (2003).
    9. Lighthall, J. W. Controlled cortical impact: a new experimental brain injury model. J Neurotrauma. 5, (1), 1-15 (1988).
    10. Chen, S., Pickard, J. D., et al. Time course of cellular pathology after controlled cortical impact injury. Exp Neurol. 182, (1), 87-102 (2003).
    11. Long, J. B., Bentley, T. L., et al. Blast overpressure in rats: recreating a battlefield injury in the laboratory. J Neurotrauma. 26, (6), 827-840 (2009).
    12. Clark, R. S., Schiding, J. K., et al. Neutrophil accumulation after traumatic brain injury in rats: comparison of weight drop and controlled cortical impact models. J Neurotrauma. 11, (5), 499-506 (1994).
    13. Werner, C., Engelhard, K. Pathophysiology of traumatic brain injury. Br J Anaesth. 99, (1), 4-9 (2007).
    14. Colicos, M. A., Dixon, C. E., et al. Delayed, selective neuronal death following experimental cortical impact injury in rats: possible role in memory deficits. Brain Res. 739, (1-2), 111-119 (1996).
    15. Raghavendra Rao, V. L., Dogan, A., et al. Traumatic brain injury leads to increased expression of peripheral-type benzodiazepine receptors, neuronal death, and activation of astrocytes and microglia in rat thalamus. Exp Neurol. 161, (1), 102-114 (2000).
    16. Gao, X., Chen, J. Moderate traumatic brain injury promotes neural precursor proliferation without increasing neurogenesis in the adult hippocampus. Exp Neurol. 239, 38-48 (2013).
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    Romine, J., Gao, X., Chen, J. Controlled Cortical Impact Model for Traumatic Brain Injury. J. Vis. Exp. (90), e51781, doi:10.3791/51781 (2014).More

    Romine, J., Gao, X., Chen, J. Controlled Cortical Impact Model for Traumatic Brain Injury. J. Vis. Exp. (90), e51781, doi:10.3791/51781 (2014).

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