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Medicine

Controlled Cortical Impact-Modell für traumatische Hirnverletzung

doi: 10.3791/51781 Published: August 5, 2014

Introduction

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Schädel-Hirn-Trauma (SHT) wird als eine Veränderung in der Gehirnfunktion, oder andere Anzeichen von Gehirnpathologie, durch eine äußere Kraft 1 verursacht wird. TBIs bleiben ein ernsthaftes Gesundheitsproblem in der ganzen Welt, insbesondere in den Vereinigten Staaten. Nach Angaben der Centers for Disease Control and Prevention, werden mindestens 1,7 Millionen TBIs jährlich in den Vereinigten Staaten, was zu 30,5% aller Verletzungen im Zusammenhang mit Todesfällen. Im Jahr 2000 werden die direkten medizinischen Kosten und indirekten Kosten betrugen TBIs einen geschätzten $ 76500000000 in den Vereinigten Staaten allein. Obwohl technologische und therapeutische Fortschritte in der vergangenen Jahrzehnte haben die Qualität und Länge des Lebens für die Leiden von TBIs verbessert, keine wirksame pharmazeutische oder vorbeugende Behandlungen derzeit existieren. Aufgrund der Komplexität und weitreichenden Auswirkungen der TBIs, einschließlich Gewebeläsionen, Zelltod und Axon-Degeneration sind keine zwei identischen Verletzungen; dann keinen Strom TBI Modell für Tiere reproduziertalle Aspekte der TBI in den Menschen gesehen. Allerdings Tiermodellen nicht bieten die Möglichkeit, nahezu identische Verletzungen notwendig, verschiedene Effekte der TBI mit der Hoffnung auf weitere Verständnis der klinischen Manifestationen der TBIs untersuchen zu produzieren.

Die kontrollierte kortikale Auswirkungen (CCI)-Modell verwendet einen Einfluss auf physikalische System Auswirkungen auf die freigelegte Dura eines Tieres liefern. Es induziert TBIs reicht von leichten bis schweren ähnlich denen von Menschen erlebt. Diese Verletzung wurde im Frettchen 2 gekennzeichnet und später zur Verwendung bei der Ratte 3,4, Maus 5-7 und Schafen 8 angepasst. Da die erste Charakterisierung der Verletzungsstelle wurde sowohl über der Mittellinie und 2,9 lateralen Kortex 10 angeordnet. CCI bietet eine einfache und genaue Methode zur Untersuchung der Wirkungen und mögliche Behandlungen für TBIs.

Neben der CCI-Modell, der Flüssigkeit Percussion und Gewichtsabfall Modelle sind Commonly zur TBIs zu produzieren. Allerdings sind diese Modelle vorhanden Einschränkungen, einschließlich weniger Kontrolle über Schädigungsparameter, Herstellung histopathalogical Änderungen nicht in der menschlichen TBIs gesehen, und größere Häufigkeit von Unfalltod in Mäusen 3,5,10. Die Druckwelle Modell wird auch verwendet, um TBIs zu produzieren. Obwohl die Druckwelle Modell nicht die histopathalogical Veränderungen erlebt reproduzieren nach einer mechanischen Aufprall, wird dieses Modell genau produzieren TBIs insbesondere von Militärpersonal 11 erlebt. Die kontrollierte kortikale Wirkungsmodell ist einfach, durch die präzise Kontrolle über Verformungsparameter wie Zeit, Geschwindigkeit und Tiefenwirkung 5 zu steuern. Solche Genauigkeit macht fast identisch replizieren Verletzungen über eine ganze Gruppe von Tieren mehr durchführbar ist. Am wichtigsten ist, CCI reproduziert TBIs mit Funktionen im menschlichen TBIs 12 zu sehen. Allerdings gibt es keine einzige Tiermodell, das bei der Wiedergabe das komplette Spektrum der pathologischen chan ganz erfolgreich istges nach SHT beobachtet. Weitere Forschung ist notwendig, um die akuten und chronischen Veränderungen, die nach SHT auftreten vollständig offenbaren.

Zwei Arten von Verletzungen auftreten, nach einer TBI: primäre und sekundäre Verletzungen. Die primäre Verletzung tritt im Moment des Aufpralls und nicht empfindlich auf therapeutische Behandlungen; jedoch die sekundäre Verletzungen, die nach der ursprünglichen Verletzung bestehen unterliegen Behandlungen 13. Die kontrollierte kortikale Wirkungsmodell erzeugt die Primärverletzung, so dass die Forscher die Auswirkungen der TBI und potenzielle therapeutische Behandlungen für die potentiell langfristige Auswirkungen von Sekundärschäden zu untersuchen. Potenziale der Forschung mit dem CCI-Modell gehören neuronalen Tod, Hirnödem, Neurogenese, vaskuläre Effekte, histopathalogical Änderungen und Gedächtnisdefizite und mehr 3,13-16.

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Protocol

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Tierpflege
Männlich C57 BL / 6 Mäuse wurden in Gruppen untergebracht und in 12/12 Stunden Licht / Dunkel-Zyklus gehalten mit frei, um Nahrung und Wasser ad libitum zugreifen. Die in diesem Protokoll verwendeten Tiere waren 10-12 Wochen alt. Alle Verfahren wurden unter Protokolle, die von Animal Care und Verwenden Ausschuss genehmigt Indiana University durchgeführt.

1. Chirurgische Vorbereitung

  1. Betäuben die Maus mit einer Ketamin / Xylazin-Mischung (87,7 mg / ml Ketamin und 12,3 mg / ml Xylazin) und Verwalten (1 ml / kg) über die IP-Injektion.
  2. Rasieren Sie den Kopf der Maus zwischen den Ohren.
  3. Anwenden eines Erdölbasis Gelee zu den Augen der Maus Austrocknen während der Operation zu verhindern.
  4. Reinigen Sie den rasierten Bereich mit 10% Jod. Dann nutzen Sie 70% Ethanol zu reinigen Sie die Jod.
  5. Befestigen Sie die Maus den Kopf in den stereotaktischen Rahmen mit den Ohr Bars und Bissplatte. Stellen Sie sicher, das Gehirn ist stabil.

2. Craniectomy

  • Machen Sie einen Längsschnitt in der Mitte des Kopfes mit einer Schere. Verwenden Sie eine Gefäßklemme an der Haut weg auf die linke Seite zu halten.
  • Verwenden Sie ein Wattestäbchen, um die Blut-und Gewebe auf dem Knochen, den Schädel freizulegen. Lassen ausgesetzt Schädel 1 min trocknen.
  • Verwenden einer Pinzette, um Druck auszuüben und sicherzustellen, dass der Schädel unbeweglich bleibt. Identifizieren anatomischen Landmarken Lambda (kaudal) und Bregma (Frontalansicht). Zeichnen Sie einen Kreis in der Mitte des Lambda und Bregma mit einem Durchmesser von 4 mm und 0,5 mm von der Mittellinie.
  • Mit einem Bohrer, um entlang der markierten Kreis geschnitten. Blasen Sie sanft Knochenstaub entfernt. Bohren Sie nicht vollständig durch den Knochen schädigen die Dura mater zu verhindern.
  • Verwenden einer Pinzette, um Knochen zu entfernen und setzen die Dura mater.
  • 3. Impaktion

    Die Auswirkungen System umfasst ein Steuerfeld, um Auswirkungen Parameter eingestellt, ein Stellglied, um den Aufprall durchzuführen, und einen stereotaktischen Rahmen, um den Akt zu sichernuator und Mauskopf für Auswirkungen.

    1. Voreingestellte die Geschwindigkeit des Antriebs bis 3 m / sec vor der Operation.
    2. Voreingestellte unterschiedlichen Verformungstiefe, verschiedene Schweregrade Verletzungen verursachen. Deformationstiefen von 0,0-0,2 mm, 0,5-1,0 mm und 1,2-2,0 mm würde, mild, moderat und schwerem SHT führen sind. Dieses Protokoll erläutert, wie man einen mäßig schwerer Hirnverletzung mit einer Verformungstiefe von 1 mm unter Verwendung einer Geschwindigkeit von 3 m / sec zu erreichen.
    3. Befestigen Sie den Antrieb an den Halter in der stereotaktischen Rahmen und mit den Mikromanipulatoren Verschieben in die runde, flache Spitze des Aktors (Durchmesser 3 mm) in der Mitte der offenen Schädelbereich zu sichern. Dann passen Sie die Spitze in einem Winkel parallel zur Oberfläche des Aufprallstelle.
    4. Stellen Sie den Nullpunkt, indem Sie den Antrieb in der Verlängerung Modell, bis die Spitze die Oberfläche der Einschlagstelle berührt. Dann stellen Sie den Z-Kanal auf dem stereotaktischen Bedienfeld auf Null.
    5. Fahren Sie die Schlagspitzewährend gleichzeitig bewegt den Antrieb ab 1 mm.
    6. Drücken Sie die Taste, um die Auswirkungen Verletzungsstelle zu schlagen und erreichen eine Verformungstiefe von 1 mm.

    4. Verletzungsstelle Verschluss

    1. Verwenden Sie Wattestäbchen, um das Blut nach dem Aufprall zu entfernen, aber die Verletzung Bereich nicht berühren.
    2. Legen Sie die Maus auf einer warmen Unterlage, um die Körpertemperatur aufrecht zu erhalten.
    3. Sobald Blutung aufgehört hat, zu nähen die Wunde geschlossen ist. Setzen Sie das Tier zurück in den Käfig sauber und lassen Sie es von der Operation über Nacht auf dem warmen Unterlage zu erholen.
    4. Verwalten Buprenorphin 0,05-0,10 mg / kg jeden SQ 8-12 h für 2 Tage nach der Operation.

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    Representative Results

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    Die kontrollierte kortikale Wirkungsmodell produziert TBIs reichen im Schweregrad von leicht bis schwer. Post-Einfluss die Höhe der Schädel Schwellungen, Blutungen und Hirn Verzerrung an der Einschlagstelle wird die Schwere der Verletzungen von der Geschwindigkeits-und Verformungstiefe Parameter resultieren, zu offenbaren. Mild TBIs führen Schädel Schwellung an der Einschlagstelle und leichte Blutungen aufgrund der begrenzten Dauer Verletzung. Eine moderate TBI zeigt Hirnschwellung und erhöhte Blutungs wegen Verletzung auf Dauer Impaktion (Abbildung 1). Der Unterschied zwischen einem mittelschweren und schweren SHT kann schwierig sein, zu unterscheiden, bis auf festen Gewebe mit einem Mikroskop (Abbildung 2) sichtbar; jedoch kann ein schweren SHT gelegentlich anzuzeigen verstärkt Verzerrung und Hirnschwellung nach einem Aufprall. Die CCI-Modell kann verwendet werden, um die Effekte von mehreren Aspekten der TBIs, einschließlich Gewebe Verformung (Fig. 2), neuronalen Tod und histopathalogical Änderungen zu bestimmen.

    = "Jove_content" fo: keep-together.within-page = "always"> Figur 1
    Abbildung 1. Controlled Cortical Impact-Modell für mittlere Schädel-Hirn-Verletzung. Das Verfahren für die kontrollierte kortikale Auswirkungen wird in dieser Figur dargestellt. A) Die Maus Kopf stabil auf der stereotaktischen Rahmen mit Ohr und Mund bar Bit. B fest) Die linke Schädel ausgesetzt und 4 mm Kreis wurde in der Mitte des Bregma und Lambda gezogen. C) Der Knochen wurde durch die Bohrungen entfernt, um ein Fenster für die Wirkung. D) erzeugen Der Antrieb wurde auf der stereotaktischen Rahmen und den Nullpunkt auf der Z-Achse befestigt war einrichten. E) Das Hirngewebe wurde verzerrt und verursacht Blutungen mit Auswirkungen. F) Die Blutung gestoppt mehrere Minuten nach dem Aufprall und das Blut wurde von Baumwolle Applikator entfernt./ Ftp_upload/51781/51781fig1highres.jpg "target =" _blank "> Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.

    Figur 2
    Abbildung 2. Histologie für Moderate traumatischen Gehirnverletzungen. A) Eine naive 10-12 Wochen alten Maus Gehirn wurde entfernt. B) A 10-12 Wochen alten Maus Gehirn wurde als eine Scheinkontrolle. C) Das Gehirn eines 10-12 Wochen alten Maus wurde 24 Stunden entfernt, nachdem eine moderate TBI mit dem CCI-Modell. D) Das Gehirn eines 10-12 Wochen alten Maus wurde von 6 Wochen nach einer moderaten TBI entfernt mit dem CCI-Modell. Ein Einzug in das Hirngewebe ist an der Stelle des Aufpralls deutlich. E) Nissl-Färbung wurde auf einem Schein-Steuer 10-12 Wochen alten Maus Gehirn durchgeführt, um den normalen Histologie zeigen. F) Nissl-Färbung wurde auf einem 10 bis 12 Wochen alt geführt Gehirn der Maus, die hatteerhielt eine moderate TBI mit dem CCI-Modell. Ein Hohlraum ist sichtbar, die sich tief in der Hirnrinde. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.

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    Discussion

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    Die wichtigsten Schritte für die erfolgreiche Erzeugung konsequente TBIs mit einem elektronischen Magnet Auswirkungen System, um eine CCI verursachen, sind: 1) stabil Fixierung der Maus den Kopf in den stereotaktischen Rahmen; 2) Erzeugen der gleichen Größe des Knochenfensters zwischen Mäusen und Entfernen der Knochen, ohne die Dura unter ihm während craniectomy; 3) die korrekte Positionierung der Schlagspitze in der Mitte der Freifläche und die Gründung der Nullpunkt, bevor er auf.

    Ein Maus-Kopf muss in der stereotaktischen Rahmen sehr eng vor dem Aufprall festgelegt werden. Lose Fixierung werden große Unterschiede in der Verletzungsebene zu generieren. Um sicherzustellen, Fixierung ist stabil, Zange verwenden, um Druck auf den Schädel beantragen, sobald die Mauskopf in der stereotaktischen Rahmen fixiert und bestätigen, dass der Schädel unbeweglich bleibt. Vorbeugende Maßnahmen, um eine Infektion des freiliegenden Schädel vermeiden. Nach Darstellung des Schädels, zu bewegen, um den schwierigsten Teil der Controlled Cortical Auswirkungen Chirurgie: Bohren eines kreisin den Schädel zu schneiden, ohne die Dura mater darunter.

    Die optimale Größe der Bohrerspitze 0,5 mm beträgt. Die geeignete Geschwindigkeit 10.000-20.000 rpm; jedoch mit einer höheren Geschwindigkeit zu erleichtern Bohren eines besseren Knochenfenster. Die Bohrungen werden Wärme, die das Gehirn vor allem bei jungen Mäusen, deren Knochen und Dura befestigt beschädigen können, zu erzeugen. Um eine Beschädigung des Gehirns zu verhindern, gelten Kochsalzlösung auf der Schädeloberfläche beim Bohren. Anwenden von Kochsalzlösung wird es notwendig, ein Binokular zu nutzen, um das gebohrte Kreis sehen. Wenn Mäuse reifen, entwickelt sich ein Raum zwischen dem Knochen und Dura, wodurch die Wirkung der Wärme, die durch Bohren erzeugt würde einen minimalen Einfluss zu erzeugen.

    Während Bohren, langsam und gleichmäßig bewegen Sie den Bohrer auf einer Kreisbahn. Andernfalls kann das Bit von der Linie zu bewegen oder gehen Sie direkt durch den Knochen und das Hirngewebe schädigen. Berühren Sie leicht das Knochenfenster mit einer Pinzette, um die Bohrungen zu untersuchen. Wenn die Schädelknochen easily auf und ab bewegt, bewegen Sie die feine Spitze der Zange in den Raum zwischen dem Knochen und dem Dura. Dann heben Sie den ganzen Knochen zu entfernen, damit das Fenster entsteht. Knochen Heben Sie nicht von einer Seite zur anderen, da dies kann das Hirngewebe zu verletzen. Machen gleich großen Knochenfenster ist entscheidend für die Erzeugung von konsistenten-Hirn-Verletzungen. Aufgrund Hirndruck, wird das Gehirn aus dem offenen Bereich wölben, sobald der Knochen entfernt ist, wodurch geringfügige Verformung Gehirn. Wenn der Knochen Fenstergröße variiert, wird die Höhe der Gehirn Verformung unterschiedlich sein, ähnlich zu der Gehirnoberfläche Kurve in der Auftreffstelle. Der Knochen wurde nicht über der Einschlagstelle nach der Operation neu positioniert, da es kleiner war als die Knochenfenster. Dies würde bewirken, dass der Knochen direkt an das Hirngewebe zu haften. Auftragen von Leim auf die Knochenfenster abdichten könnte in erhöhtem Hirndruck führen. Prüfung von Wirkungen Website 3 Wochen nach einer Operation CCI eine neue Membran wurde gefunden, die das Gehirn Gewebe with kein Hirngewebe Wachstum außerhalb der Aufprallstelle. Keine bekannten histologischen Veränderungen auftreten, aufgrund des Fehlens von Knochenbelag.

    Die elektronische Magnet Auswirkungen System ist äußerst stabil und präzise die Geschwindigkeit und die Verformungstiefe steuern. Aufgrund der Konstruktion kann die Spule mit dem Schlagspitze verbunden verschieben, während auffällig und führen zu einer Verschiebung der Einschlagstelle. Dies ist die Hauptursache von Verletzungen inkonsistent, abgesehen keine weiteren Komplikationen. Trotz der Möglichkeit zur Verschiebung der Einschlagstelle, bleibt die kontrollierte kortikale Auswirkungen Verfahren präziser und leichter zu kontrollieren, im Vergleich zu dem Fluid Percussion und Gewicht fallen Methoden, wodurch CCI eine bevorzugte Methode für die Untersuchung der kurz-und langfristigen Auswirkungen der TBIs sowie mögliche therapeutische Behandlungen. Obwohl die für TBI Forschung, Entfernen eines Teils des Schädels vor Auswirkungen begrenzt die klinische Relevanz der CCI-Modell.

    Das Protokoll des obencribes den Vorgang, um eine moderate TBI in einer Maus zu produzieren. Die Einschlagstelle kann 1-6 mm Durchmesser, je nach Tier und Schwere der Verletzungen gewünschten Bereich. Obwohl das Protokoll erklärte die Schlagspitze betrug 3 mm im Durchmesser, ein 4 mm Durchmesser craniectomy wurde, um zu verhindern, versehentlich fällt Knochen durchgeführt. Zusätzlich zur Veränderung der Größe der Aufprallstelle, kann die Geschwindigkeit des Schlag und Verformungstiefe eingestellt werden, um den Schweregrad erforderlich zu erreichen.

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    Acknowledgments

    Diese Arbeit wurde durch Mittel aus dem Indiana Spinal Cord & Brain Injury Research Grants (SCBI 200-12) unterstützt wird, die Ralph W. and Grace M. Showalter-Forschungspreis, der Indiana University Biological Research Grant, NIH Zuschüsse RR025761 und 1R21NS072631-01A.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Povidone-iodine 7.5% Purdue product L.P. Surgical scrub
    Cotton tipped applicators Henry Schein 100-6015 Remove blood and debris
    Scissor Fine Science Tools 14084-08 Surgery
    Forcept Fine Science Tools 11293-00 Surgery
    Hemostat Fine Science Tools 13021-12 Surgery
    Rechargeable Cordless Micro Drill Stoelting 58610 Combine with Burrs for generating the bone window
    Burrs for Micro Drill Fine Science Tools 19007-05
    Suture monofilament Ethicon G697 Suture
    tert-Amyl alcohol Sigma 152463-250ML Making 2.5% Avertin
    2,2,2-Tribromoethanol Sigma T48402-25G Making 2.5% Avertin

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

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    Romine, J., Gao, X., Chen, J. Controlled Cortical Impact Model for Traumatic Brain Injury. J. Vis. Exp. (90), e51781, doi:10.3791/51781 (2014).More

    Romine, J., Gao, X., Chen, J. Controlled Cortical Impact Model for Traumatic Brain Injury. J. Vis. Exp. (90), e51781, doi:10.3791/51781 (2014).

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