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Medicine

外傷性脳損傷のための制御皮質衝撃モデル

doi: 10.3791/51781 Published: August 5, 2014

Introduction

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外傷性脳損傷(TBI)は、脳機能の変化、又は外力​​1によって引き起こされる脳病理の他の証拠として定義される。オーバフローなし、特に米国では、世界中で深刻な健康問題のまま。疾病管理予防センターによると、少なくとも170万のTBiSは、すべての傷害に関連した死亡の30.5%になり、米国で毎年起こる。 2000年には、直接医療費とのTBiSの間接的なコストは、米国だけで推定765億ドルとなりました。前の数十年の技術と治療の進歩がオーバフローなしで苦しむ人々の生活の質と長さを改善しているものの、有効な医薬品または予防治療は現在存在しません。により複雑さと組織病変、細胞死、および軸索変性を含むのTBiSの広い及ぶ影響​​で、どの2つの負傷者が同一ではありません。このように、動物には、現在のTBIのモデルを正確に再現していませんTBIのすべての側面は、ヒトにおいて見られる。しかし、動物モデルは、さらにのTBiSの臨床症状を理解するのを期待して、TBIの様々な影響を調査するために必要なほとんど同一の傷害を生成する能力を提供します。

制御皮質衝撃(CCI)モデルでは、動物の露出硬膜に物理的な衝撃を配信するためにインパクト方式を使用しています。これは、軽度から人間が経験と同様の深刻なまでのTBiSを誘導する。この損傷は、第2のフェレットを特徴とし、それ以降3,4ラット、マウス5-7、およびヒツジ8で使用するために適合させた。最初に特性化するので、損傷部位は正中線2,9と横皮質10上の両方に置かれています。 CCIはオーバフローなしのための効果や治療の可能性を調査する簡単かつ正確な方法を提供します。

CCIモデルに加えて、流体打楽器および体重降下モデルは同時であるmmonlyのTBiSを生成するために使用される。しかし、これらのモデルより少ない傷害パラメータを制御、人間のTBiSでは見られないhistopathalogical変化をもたらす、マウス3,5,10中の事故死の高い発生率を含めて、本制限は、。爆風モデルものTBiSを生成するために使用される。爆風モデルは機械的衝撃後に見histopathalogical変化を再現していませんが、このモデルは、正確に、特に軍関係者11が経験したのTBiSを生み出すん。制御皮質衝撃モデルは、インパクト5時、速度、深さなどの変形パラメータを正確に制御するため、制御が容易である。このような精度はより実現可能動物のグループ全体でほぼ同一の傷害を複製することができます。最も重要なことは、CCIは、人間のTBiS 12に見られるような機能を持つのTBiSを再生する。しかし、病理学ちゃんの完全なスペクトルを再現する完全に成功している単一の動物モデルは存在しないTBIの後に観察GES。さらなる研究は、完全TBI後に生じる急性および慢性の変化を明らかにすることが必要である。

プライマリとセカンダリの負傷:負傷の2つのタイプがTBI後に発生する。主な損傷はインパクトの瞬間に発生し、治療上の処置に敏感ではありません。しかし、最初の損傷後も持続二次傷害は治療13の対象となります。制御皮質衝撃モデルは、このように研究者が二次的傷害の可能性のある長期的な効果のためのTBIと潜在的な治療処置の効果を調査することができ、主要な傷害を生成します。 CCIモデルを使用して潜在的な研究の分野は、神経細胞死、脳浮腫、神経発生、血管作用、histopathalogical変化、記憶障害や3,13-16などが含まれます。

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Protocol

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動物ケア
雄のC57 BL / 6マウスを基に収容された食物および水を自由にアクセスでき、無料で12分の12時間の明/暗サイクルで維持した。このプロトコルで使用される動物は、10〜12週齢であった。すべての手順は、インディアナ大学の動物実験委員会によって承認されたプロトコルの下で実施された。

1。手術の準備

  1. ケタミン/キシラジン混合物(87.7 mg / mlのケタミンおよび12.3 mg / mlのキシラジン)を使用して、マウスを麻酔し、IP注射を介して(1ミリリットル/ kg)を管理します。
  2. 耳の間にマウスの頭を剃る。
  3. 手術中に乾燥を防ぐために、マウスの目に石油系ゼリーを適用します。
  4. 10%のヨウ素とパイパンエリアを清掃してください。その後、ヨウ素をきれいに70%エタノールを使用しています。
  5. 耳のバーやバイトプレートを使用し、定位フレームにマウスの頭を固定します。脳が安定していることを確認してください。

2。頭蓋骨切除術

  • はさみで頭の真ん中に縦切開を加えます。左側に皮を保持するために止血剤を使用しています。
  • 頭蓋骨を露出するために骨に血液や組織を除去するために綿棒を使用してください。さらさ頭蓋骨は1分間乾燥させます。
  • 圧力をかけると、頭蓋骨は不動のままであることを確実にするために鉗子を使用してください。解剖学的ラムダ(尾の態様)とブレグマ(前頭面)を特定します。直径4mmと離れて正中線から0.5ミリメートルでラムダとブレグマの中心に円を描く。
  • マークされた円に沿ってカットしてドリルを使用してください。そっと骨ほこりを吹き飛ばす。硬膜の損傷を防ぐために骨を完全に貫通してドリルダウンしないでください。
  • 骨を除去し、硬膜を露出させ鉗子を使用してください。
  • 3。インパク

    衝撃装置は、衝撃パラメータを設定するコントロールボックス、インパクションを実行するためのアクチュエータと、行為を確保する定位フレームを含むインパクト用uatorとマウスの頭部。

    1. 手術前に3メートル/秒アクチュエータの速度を事前に設定してください。
    2. 別の傷害の重大度を誘導するために様々な変形の深さを事前に設定してください。 0.0〜0.2ミリメートル0.5〜1.0 mmであり、1.2〜2.0ミリメートルの変形深さはそれぞれ、軽度、中等度、重度のTBiSをもたらすであろう。このプロトコルは、3メートル/秒の速度を利用して1ミリメートルの変形の深さが中等度の脳損傷を達成する方法を説明しました。
    3. 定位フレームにホルダーにアクチュエータを取り付け、オープン頭蓋骨領域の中央にある丸い、アクチュエータのフラットチップ(直径3mm)を確保するためにそれを動かすマイクロマニピュレーターを使用しています。その後、衝突場所の表面に対して平行な角度で先端を調整します。
    4. 先端が衝突部位の表面に接触するまで拡張モデルでアクチュエータを下に移動することでゼロ点を確立します。ゼロに定位コントロールパネルのZチャネルを設定します。
    5. インパクター先端を撤回同時に1ミリメートルまでのアクチュエータを移動させながら。
    6. 損傷部位に衝突し、1ミリメートルの変形深さを達成するためにインパクトのボタンを押してください。

    4。傷害のサイト閉鎖

    1. 任意の血液、次の影響を除去するために綿棒アプリケーターを使用していますが、怪我の部分に触れないでください。
    2. 体温を維持するために、暖かいパッドの上にマウスを置きます。
    3. 出血が停止すると、閉じた傷口を縫合。清潔なケージに戻って動物を入れて、それが暖かいパッド上で一晩手術から回復することができます。
    4. 管理ブプレノルフィン0.05〜0.10 mg / kgのSQ手術後2日間、8月12日時間。

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    Representative Results

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    制御皮質衝撃モデルは、軽度から重度までの重症度の範囲のTBiSを生成します。ポストインパクトインパクトサイトで頭蓋膨潤量、出血および頭蓋の歪み速度と変形深さのパラメータに起因する傷害の重症度を明らかにする。軽度のTBiSは、限定された硬膜の侵害に衝突場所と、わずかな出血で頭蓋腫れを引き起こす。適度なTBIは頭蓋腫脹を示し、原因衝突時に硬膜違反( 図1)に出 ​​血が増加。中等度および重度のTBIの差顕微鏡( 図2)を用いて固定した組織上で可視化されるまで区別することは困難であり得る;しかし、重度のTBIは時折、増幅歪みや頭蓋腫れポストへの影響が表示される場合があります。 CCIモデルは、組織変形( 図2)、神経細胞死、および変更を含むhistopathalogicalのTBiSの複数の態様の効果を決定するために使用することができる。

    = FO」jove_content」:キープtogether.withinページ= "常に"> 図1
    図1。適度な外傷性脳損傷のための皮質衝撃モデルを制御した。制御皮質衝撃のための手順は、A)マウスの頭部を安定して耳のバーと口ビットの定位フレームに固定し、この図に示されている。B)左側の頭蓋骨た露光及び4mmの円はブレグマとラムダの中央に描かれた。C)骨が衝撃のための窓を生成するために、ドリルによって除去した。D)アクチュエータを定位フレーム上に取り付けられ、Z軸上のゼロ点があった設置しました。E)は脳組織が ​​歪んと衝撃で出血引き起こされた。F)が出血は衝突後、数分停止し、血液を綿棒で取り除いた。/ ftp_upload/51781/51781fig1highres.jpg "ターゲット=" _blank ">拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。

    図2
    適度な外傷性脳損傷のための図2。組織学。 A)未処置10〜12週齢のマウスの脳を除去した。B)10〜12週齢のマウスの脳を、10〜12週齢のマウスの脳は適度な24時間後に除去したシャム対照。C)として用いたTBI)D。CCIモデルを用いて、10〜12週齢のマウスの脳は、CCIモデルを使用して6週間適度なTBI後に除去した。脳組織内のインデントは、衝撃部位で明らかである。E)ニッスル染色は、正常な組織像を示すためにシャム対照10〜12週齢のマウスの脳で行った。F)ニッスル染色は10〜12週齢で行った持っていたマウス脳CCIモデルを使用して、中程度のTBIを受けた。空洞は深い皮質内に延びる表示されます。 拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。

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    Discussion

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    成功したCCIを引き起こす電子の磁石の影響システムを使用して一貫性のあるのTBiSを発生させるための最も重要なステップは次のとおりです。1)安定的定位フレームにマウスの頭を固定。 2)マウスとの間の骨窓の同じサイズを生成し、頭蓋骨切除術の間に、その下の硬膜を損傷することなく骨を除去する工程; 3)が正しくオープンエリアの中心にインパクトチップを配置し、影響を与える前に、ゼロ点を確立する。

    マウスヘッドがインパクトの前に、非常にしっかりと定位フレームに固定されている必要があります。緩い固定は損傷レベルの大きな変動が生成されます。固定が安定して確保するために、マウスの頭部を定位フレームに固定され、頭蓋骨は不動のままであることを確認されると、頭蓋骨に圧力を適用するために鉗子を使用しています。曝露頭蓋骨の感染を避けるために、予防措置を講ずること。頭蓋骨を露出させた後、制御皮質衝撃手術の最も困難な部分に移動:円形掘削下に硬膜を損傷することなく、頭蓋骨に切る。

    ドリルビットの先端部の最適なサイズは0.5mmである。適した速度は10,000〜20,000 rpmである。しかし、高速化を使用すると、より良い骨窓を開け容易にすることができる。掘削は、特にその骨と硬膜接続されている若いマウスでは、脳に損傷を与える可能性が熱を発生します。脳の損傷を防ぐために、掘削しながら頭蓋骨の表面に生理食塩水を適用します。生理食塩水を適用することは、それが必要な掘削サークルを見るために解剖顕微鏡を使用することになります。マウスが成熟すると、スペースが骨と硬膜の間で開発し、そのための掘削によって発生する熱の影響は最小限の影響が生成されます。

    掘削は、円形の経路に沿ってゆっくりと、常にドリルビットを移動しながら。それ以外の場合は、ビットは、ラインから移動したり、骨を介して直接アクセスし、脳組織に損傷を与える。優しく掘削を検査するために鉗子を用いて骨のウィンドウをタッチします。頭蓋骨EA場合silyは骨と硬膜の間の空間に鉗子の先端の細い動かし、上下に移動します。そして、このようにウィンドウを作成、全体の骨を除去するために持ち上げます。そうすることが、脳組織を傷つける可能性があるため、1つの側面から別の骨を持ち上げないでください。同じサイズの骨窓を作ることは一貫して脳損傷を発生させるために重要である。骨が除去された後に起因する頭蓋内圧、脳はこのように、マイナーの脳変形を生じ、開放領域の外に膨出します。骨のウィンドウサイズが変化すると、脳の変形のレベルは影響部位における脳表面曲線に類似している、異なるであろう。それは骨のウィンドウよりも小さかったため、骨は手術後の影響部位の上に再配置されませんでした。そうすることで、骨が脳組織に直接付着させるであろう。骨窓をシールするために接着剤を適用することは、頭蓋内圧亢進する可能性があります。 3週間新しい膜はワット脳組織を対象と発見されたCCI手術後の​​衝突場所を調べる衝撃部位の外側番目ない脳組織の成長しない。既知の組織学的変化は、骨のカバーがないために発生していません。

    電子衝撃磁石システムは、非常に安定であり、正確に変形速度と深さを制御することができる。しかし、デザインに、インパクト先端に接続されたコイルが印象的ながらシフトすることができるし、衝突場所のシフトを引き起こす。これは他の合併症がなければない、一貫性のない傷害の主要な原因である。衝撃部位をシフトする可能性にもかかわらず、制御された皮質衝撃法は、このようのTBiSの短期および長期の効果を調査するためのCCIの好ましい方法を作り、流体パーカッション、おもり落下方法と比較して制御することがより正確かつ容易に残るだけでなく、可能な治療処置。 TBIの研究のための重要なものの、前の衝撃に頭蓋骨の一部を除去して、CCIモデルの臨床的意義を制限します。

    DES上のプロトコルマウスで適度なTBIを生成する手順をcribes。衝突場所は、希望の損傷の動物や重症度に応じて、直径1〜6ミリメートルの範囲であってもよい。プロトコルは、衝撃先端が直径3mm、頭蓋骨切除術が誤って打撃骨を防止するために実施した直径4mmであった記載はない。衝撃部位の大きさを変えることに加えて、変形のインパクタと深さの速度が必要とされる重大度に到達するように調整することができる。

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    Acknowledgments

    この作品は、インディアナ州脊髄·脳損傷研究費補助金(SCBI 200-12)からの資金によってラルフ·W·グレースM·ショーウォルター研究賞、インディアナ大学の生物学的研究助成、NIHの助成金RR025761と1R21NS072631-01Aをサポートされていました。

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Povidone-iodine 7.5% Purdue product L.P. Surgical scrub
    Cotton tipped applicators Henry Schein 100-6015 Remove blood and debris
    Scissor Fine Science Tools 14084-08 Surgery
    Forcept Fine Science Tools 11293-00 Surgery
    Hemostat Fine Science Tools 13021-12 Surgery
    Rechargeable Cordless Micro Drill Stoelting 58610 Combine with Burrs for generating the bone window
    Burrs for Micro Drill Fine Science Tools 19007-05
    Suture monofilament Ethicon G697 Suture
    tert-Amyl alcohol Sigma 152463-250ML Making 2.5% Avertin
    2,2,2-Tribromoethanol Sigma T48402-25G Making 2.5% Avertin

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    References

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    Romine, J., Gao, X., Chen, J. Controlled Cortical Impact Model for Traumatic Brain Injury. J. Vis. Exp. (90), e51781, doi:10.3791/51781 (2014).More

    Romine, J., Gao, X., Chen, J. Controlled Cortical Impact Model for Traumatic Brain Injury. J. Vis. Exp. (90), e51781, doi:10.3791/51781 (2014).

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