Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Travmatik Beyin Hasarı için Kontrollü Kortikal Etki Modeli

doi: 10.3791/51781 Published: August 5, 2014

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Travmatik beyin hasarı (TBI) bir beyin fonksiyonlarında değişiklik, ya da bir dış kuvvet 1 kaynaklanan beyin patoloji diğer delil olarak tanımlanır. TBIs özellikle Amerika Birleşik Devletleri'nde ve dünya çapında önemli bir sağlık sorunu olmaya devam etmektedir. Hastalık Kontrol ve Önleme Merkezlerine göre, en az 1.7 milyon TBIs bütün yaralanmalı bağlı ölümlerin% 30.5 sonuçlanan Birleşik Devletleri'nde yılda meydana gelir. 2000 yılında, doğrudan tıbbi maliyetleri ve TBIs dolaylı maliyetler tek başına ABD'de tahmini 76500000000 $ olarak gerçekleşti. Önceki yıllarda teknolojik gelişmeler ve tedavi TBIs muzdarip olanlar için yaşam kalitesini ve uzunluğunu geliştirilmiş olmasına rağmen, etkili bir ilaç veya koruyucu tedaviler şu anda mevcut. Nedeniyle karmaşıklığı ve doku lezyonları, hücre ölümü ve akson dejenerasyon da dahil olmak üzere TBIs, geniş kapsamlı etkileri, herhangi bir iki yaralanma aynıdır; Böylece, hayvanlar için hiçbir geçerli TBI modeli doğru üretirTBI tüm yönleri olarak insanlarda görülen. Ancak, hayvan modelleri daha TBIs klinik belirtilerini anlamak umuduyla TBI çeşitli etkilerini araştırmak için gerekli hemen hemen aynı yaralanmaları üretme yeteneği sağlarlar.

Kontrol kortikal darbe (CCI) modeli bir hayvanın maruz dura fiziksel etki sunmak için bir darbe sistemi kullanır. Bu hafif insanlar tarafından hissedilen şiddetli benzer değişen TBIs uyarmaktadır. Bu yaralanma ilk olarak gelincik 2 özelliği ve daha sonra 3,4-sıçan, fare 5-7 ve koyun 8 kullanılmak üzere uyarlanmıştır. İlk nitelenmesi, yaralanma site orta hat 2,9 ve lateral kortekse 10 üzerinden hem yerleştirildi. CCI TBIs için ve potansiyel etkisini araştıran tedavi kolay ve doğru bir metot sağlar.

CCİ modeli, sıvı perküsyon ve ağırlık düşümüne ilave olarak modelleri işbirliği vardırmmonly TBIs üretmek için kullanılır. Ancak, bu modeller daha az yaralanma parametreleri üzerinde kontrol, insan TBIs görmedim eden histopatolojik değişiklikleri üreten, ve farelerde 3,5,10 kazayla ölüm insidans dahil mevcut sınırlamalar,. Patlama dalgası modeli aynı TBIs üretmek için kullanılır. Patlama dalgası modeli mekanik etkisi aşağıdaki görülmüştür eden histopatolojik değişiklikleri yeniden olmamasına rağmen, bu modeli doğru özellikle askeri personel 11 deneyimli TBIs üretiyor. Kontrollü kortikal etki modeli nedeniyle, zaman, hız ve etki 5 derinliği olarak deformasyon parametreleri üzerinde tam kontrolü için kontrol etmek kolaydır. Böyle bir doğruluk daha uygulanabilir bütün bir hayvan grubunun genelinde yaklaşık aynı yaralanmaları kopyalayan yapar. En önemlisi, CCI insan TBIs 12 görülen özelliklere sahip TBIs üretir. Ancak, patolojik chan tam spektrum üreyen tümüyle başarılı tek bir hayvan modeli vardırTBI sonrası gözlenen Ges. Daha fazla araştırma tamamen TBI sonra meydana akut ve kronik değişiklikleri ortaya çıkarmak için gereklidir.

Birincil ve ikincil yaralanmalar: yaralanmaları iki tip bir TBI sonrasında görülmektedir. Birincil yaralanma çarpma anında meydana gelir ve terapötik tedaviler duyarlı değildir; Ancak, ilk hasardan sonra devam ikincil yaralanmalar tedavilere 13 tabidir. Kontrollü kortikal etki modeli böylece araştırmacılar ikincil yaralanma potansiyel uzun süreli etkileri için TBI etkilerini ve potansiyel terapötik tedavileri araştırmak için izin, birincil yaralanma üretir. CCI modelini kullanarak potansiyel araştırma alanları nöronal ölüm, serebral ödem, nöron, vasküler etkileri, eden histopatolojik değişiklikleri ve hafıza açıkları ve 3,13-16 daha fazlasını içerir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Hayvan Bakımı
Erkek C57 BL / 6 fareleri, grup yer alır ve yiyecek ve su ad libitum erişmek için serbest olan bir 12/12 saat ışık / karanlık döngüsünde tutuldu. Bu protokolde kullanılan hayvanlar 10-12 haftalık oldular. Tüm prosedürler Indiana Üniversitesi Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanan protokoller altında yapıldı.

1.. Cerrahi Hazırlık

  1. Bir ketamin / ksilazin karışımı (87.7 mg / ml Ketamin ve 12.3 mg / ml Ksilazin) kullanılarak fare anestezisi ve IP enjeksiyon yoluyla (1 ml / kg) uygulanması.
  2. Kulakları arasındaki fare başını tıraş.
  3. Ameliyat sırasında kurumasını önlemek için fare gözlerine petrol bazlı bir jöle uygulanır.
  4. % 10 iyot ile traşlı bölgeyi temizleyin. Sonra iyot temizlemek için% 70 etanol kullanımı.
  5. Kulak çubukları ve lokma plaka kullanılarak stereotaktik çerçeve içinde fare kafasını düzeltin. Beyin kararlı olduğundan emin olun.

2. Kranyektomi

  • Makas ile baş ortasında uzunlamasına bir kesi olun. Sol tarafında kapalı cilt tutmak için bir hemostat kullanın.
  • Kafatası açığa çıkarmak için kemik üzerindeki kan ve doku kaldırmak için bir pamuk uçlu bir aplikatör kullanın. Maruz kafatası 1 dakika kurumasını bekleyin.
  • Baskı uygulamak ve kafatası hareketsiz kalmasını sağlamak için forseps kullanın. Anatomik Simgesel Lambda (kaudal yönü) ve bregmaya (frontal yönü) belirleyin. 4 mm çapında ve uzak orta hat 0.5 mm ve Lambda bregma merkezinde bir daire çizin.
  • Işaretli daire boyunca kesmek için bir matkap kullanın. Nazikçe kemik tozları üflemek. Dura mater zarar görmesini önlemek için kemik yoluyla tamamen delmek yok.
  • Kemiği kaldırmak ve dura mater maruz forseps kullanın.
  • 3. Impaction

    Darbe sistem etkisi parametrelerini ayarlamak için bir kontrol kutusu, çarpmasının gerçekleştirmek için bir çalıştırıcı ve hareket güvenli bir stereotaktik çerçeve içeriretki için uator ve fare kafası.

    1. Ameliyat öncesi 3 m / sn 'ye aktüatörün hızım önceden ayarlanmıştır.
    2. Farklı bir yaralanma ciddiyetinin uyarılması için farklı deformasyon derinliği önceden ayarlanmıştır. 0,0-0,2 mm, 0.5-1.0 mm ve 1,2-2,0 mm deformasyon derinlikleri sırasıyla, hafif, orta ve ağır TBIs neden olacaktır. Bu protokol, 3 m / sn hızı ile 1 mm bir deformasyon derinliğe sahip bir orta şiddetli beyin hasarı ulaşmak için nasıl açıkladı.
    3. Stereotaktik çerçeve içinde sahibine Aktuatörü takın ve açık kafatası alanının merkezinde aktüatör (3 mm çapında) yuvarlak, yassı ucu sabitlemek için hareket mikromanipülatörler kullanın. Daha sonra darbe yeri yüzeyine bir açı paralel ucu ayarlayın.
    4. Ucu darbe sitenin yüzeyine değene kadar uzanan modelinde aktüatörünü aşağı hareket ettirerek sıfır noktası kurmak. Sonra sıfıra stereotaktik kontrol panelindeki Z kanalını ayarlayın.
    5. Çarpma ucu geri çekinAynı anda 1 mm aşağı aktüatörünü hareket ederken.
    6. Yara bölgesi vurur ve 1 mm'lik bir deformasyon derinliği elde etmek için etki düğmesine basın.

    4. Yaralanma Sitesi Kapanış

    1. Herhangi bir kan aşağıdaki etkisini kaldırmak için pamuk uçlu aplikatörler kullanın, ancak yaralanma alana dokunmayın.
    2. Vücut ısısını korumak için sıcak bir pad üzerinde fare yerleştirin.
    3. Kanama durduktan sonra, kapalı yara sütür. Temiz bir kafes içine geri hayvan koyun ve sıcak ped gecede ameliyat kurtarmak için izin verir.
    4. Yönetme Buprenorfin 0.05-0.10 mg / kg SQ ameliyattan sonra 2 gün boyunca her 8-12 saat.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

    Kontrollü kortikal etki modeli hafif şiddetli şiddeti arasında değişen TBIs üretir. Post-darbe kafatası şişme miktarı, kanama, ve darbe yerinde kranial bozulma hızı ve deformasyon derinliği parametreleri kaynaklanan yaralanma şiddetinin ortaya çıkaracaktır. Hafif TBIs nedeniyle sınırlı dura ihlali darbe site ve hafif kanama da kranial şişmesine neden. Bir orta TBI kranial şişme sergiler nedeniyle impaksiyon üzerine dura ihlali (Şekil 1) artmış kanama. Orta ve şiddetli TBI arasındaki fark, bir mikroskop (Şekil 2) kullanılarak sabit dokular üzerinde görüntülendi kadar ayırt etmek zor olabilir; Ancak, ciddi bir TBI bazen güçlendirilmiş bozulma ve kranial şişme sonrası etkisini gösterebilir. CCI modeli doku deformasyona (Şekil 2), nöronal ölüm ve eden histopatolojik değişiklikler dahil olmak üzere TBIs birden çok yönleri, etkilerini belirlemek için kullanılabilir.

    = "Jove_content" fo: keep-together.within-page = "always"> Şekil 1
    Şekil 1.. Orta travmatik beyin hasarı için kortikal darbe modeli Kontrollü. Kontrollü kortikal etkisi için prosedürü bu şekilde gösterilmiştir. A) fare kafası stabil kulak çubuğu ve ağız bit. B ile stereotaktik çerçeve üzerinde sabit olduğunu) Sol kafatası oldu maruz kalan ve 4 mm daire bregma ve lambda merkezinde çizildi. C) kemik etkisi. D) için bir pencere oluşturmak için delme uzaklaştırıldı aktüatör Z-ekseni üzerinde stereotaktik çerçeve ile sıfır noktasına edildi tutturuldu kurmak. E) beyin dokusu bozulmuş ve etkisi. F) ile kanama neden oldu kanama etkisi birkaç dakika sonra durdu ve kan pamuk aplikatör tarafından çıkarıldı./ Ftp_upload/51781/51781fig1highres.jpg "target =" _blank "> büyük resmi görebilmek için buraya tıklayın.

    Şekil 2,
    Orta Travmatik Beyin Yaralanmaları için Şekil 2.. Histoloji. A) saf, 10-12 haftalık, fare beyni çıkarıldı. B) A, 10-12 haftalık, fare beyni, 10-12 haftalık, fare beyni ılımlı 24 saat sonra uzaklaştırılmış, bir sham kontrol. ° C) olarak kullanılmıştır TBI) D. CCİ modelini kullanarak 10-12 haftalık fare beyin CCI modelini kullanarak 6 hafta ılımlı bir TBI sonrası çıkarıldı. Beyin dokusunda bir girinti etki yerinde belirgindir. E) Nissl boyama normal histoloji göstermek için bir sham kontrol, 10-12 haftalık, fare beyni üzerinde gerçekleştirilmiştir. F) Nissl boyama, 10-12 haftalık, üzerinde gerçekleştirilmiştir vardı fare beyinCCİ modelini kullanarak ılımlı TBI aldı. Bir boşluk derin kortekse uzanan görünür. resmi büyütmek için buraya tıklayın.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

    Başarılı bir CCI neden olmak için bir elektronik mıknatıs etki sistemi ile tutarlı TBIs üretilmesi için en önemli adımlar şunlardır: 1) sabit bir şekilde stereotaktik çerçeve içinde fare baş sabitlenmesi; 2) fareler arasında kemik penceresinin aynı boyut ve kraniektomi üretilmesi sırasında bunun altında dura zarar vermeden kemik çıkarılması; 3) doğru açık alanın merkezinde darbe ucu konumlandırılması ve çarpmadan önce sıfır noktasını tesis.

    Bir fare kafası çok sıkı çarpmadan önce stereotaktik çerçeve içinde sabit olmalıdır. Gevşek tespit yaralanma düzeyinde büyük farklılıklar yaratacaktır. Tespit istikrarlı sağlamak için, fare baş stereotaktik çerçeve içinde sabit ve kafatası hareketsiz kalır onaylamak sonra kafatası üzerinde baskı uygulamak için forseps kullanabilir. Maruz kalan kafatası enfeksiyonu önlemek için önlem alın. Kafatası açığa sonra, kontrollü kortikal darbe cerrahisinin en zor kısmını taşımak: bir genelge sondajaltında dura mater zarar vermeden kafatasına kesin.

    Matkap ucunun en uygun boyutu 0.5 mm'dir. Uygun bir hız 10,000-20,000 rpm; Ancak, daha yüksek bir hız kullanarak daha iyi bir kemik pencere sondaj kolaylaştırabilir. Sondaj özellikle kimin kemik ve dura bağlı genç farelerde, beyin zarar verebilir ısı üretecektir. , Beyin hasar görmesini önlemek Sondaj sırasında kafatası yüzeyine tuzlu su uygulamak için. Tuzlu su uygulamak gerekli delinmiş daire görmek için bir mikroskop kullanmak yapacak. Fareler olgun zaman, bir boşluk dolayısıyla sondaj tarafından üretilen ısının etkisi minimal bir etki yaratacak, kemik ve dura arasında gelişir.

    Sondaj, dairesel bir yol boyunca yavaş yavaş ve sürekli matkap taşırken. Aksi halde, biraz çizgi dışı hareket edebilir veya kemik yoluyla doğrudan gitmek ve beyin dokusuna zarar. Yavaşça sondaj incelemek için forseps kullanarak kemik penceresine dokunun. Eğer kafatası kemik adetsily kemik ve dura arasındaki boşluğa forseps ince ucu hareket, yukarı ve aşağı hareket eder. Sonra böylece pencere oluştururken, bütün kemik çıkarmak için yukarı kaldırın. Böylece beyin dokusuna zarar verebilir, çünkü, başka bir taraftan kemik kaldırmayın. Aynı büyüklükte kemik pencere yapımında tutarlı beyin yaralanmaları üretmek için önemlidir. Kemik çıkartıldıktan sonra gelişen intrakranial basınç, beyin böylece küçük beyin deformasyonuna neden açık alan olacak çıkıntı. Kemik pencere boyutu değişiyorsa, beyin deformasyon seviyesi darbe yeri beyin yüzey eğrisine benzer olan, farklı olacaktır. Bu kemik penceresinden daha küçük yaşından beri kemik cerrahisi sonrası darbe yeri üzerinde konumlandırılmış değildi. Aksi kemik beyin dokusunda doğrudan bağlı neden olur. Kemik pencere mühür tutkal uygulamak artan intrakraniyal basınçtaki neden olabilir. 3 haftada bir yeni bir zar w beyin dokusunu kapsayan bulundu CCİ ameliyattan sonra bir darbe siteyi incelerkendarbe sitenin dışında i'inci hiçbir beyin dokusu büyüme. Bilinen bir histolojik değişiklikler nedeniyle kemik kaplamasının eksikliğinden meydana gelir.

    Elektronik mıknatıs etkisi sistem, son derece istikrarlı ve hassas hız ve deformasyon derinliğini kontrol edebilirsiniz. Bununla birlikte, çarpıcı gelmesi nedeniyle tasarımı sayesinde, darbe ucuna bağlı olan bobin kayması ve darbe yeri bir kaymasına neden olur. Bu, başka hiçbir komplikasyon olmadıysa, tutarsız yaralanmalarının başlıca nedenidir. Etkili bir site kaydırılması için olasılığı olmasına rağmen, kontrol kortikal darbe yöntemi böylece TBIs kısa-dönem ve uzun vadeli etkileri araştırmak için CCI tercih edilen bir yöntem yapım sıvı perküsyon ve ağırlık bırakma yöntemleri ile karşılaştırıldığında daha kesin kontrol etmek ve daha kolay kalır , hem de olası terapötik tedaviler. Her ne kadar önemli TBI araştırma için önce darbe kafatası bir kısmım CCI modelinde klinik anlam sınırlar.

    Des Yukarıdaki protokolBir fare, bir orta TBI üretilmesi için prosedürü cribes. Çarpma sahasından istenen yaralanmanın hayvan ve şiddetine bağlı olarak, çapı 1-6 mm arasında değişebilir. Protokol darbe ucu çapı 3 mm, kraniektomi kazara çarpıcı kemik önlemek amacıyla gerçekleştirilmiştir çapı 4 mm olduğunu belirtti rağmen. Darbe yeri boyutunu değiştirerek ek olarak, deformasyon çarpma ve derinlik hız gerektiği şiddetini ulaşmak için ayarlanabilir.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Acknowledgments

    Bu çalışma Indiana Omurilik ve Beyin Hasarı Araştırma Hibeler (SCBI 200-12) fon tarafından desteklenen, Ralph W. ve Grace M. Showalter Araştırma Ödülü, Indiana Üniversitesi Biyolojik Araştırma Grant, NIH hibe RR025761 ve 1R21NS072631-01A.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Povidone-iodine 7.5% Purdue product L.P. Surgical scrub
    Cotton tipped applicators Henry Schein 100-6015 Remove blood and debris
    Scissor Fine Science Tools 14084-08 Surgery
    Forcept Fine Science Tools 11293-00 Surgery
    Hemostat Fine Science Tools 13021-12 Surgery
    Rechargeable Cordless Micro Drill Stoelting 58610 Combine with Burrs for generating the bone window
    Burrs for Micro Drill Fine Science Tools 19007-05
    Suture monofilament Ethicon G697 Suture
    tert-Amyl alcohol Sigma 152463-250ML Making 2.5% Avertin
    2,2,2-Tribromoethanol Sigma T48402-25G Making 2.5% Avertin

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Menon, D. K., Schwab, K., et al. Position statement: definition of traumatic brain injury. Arch Phys Med Rehabil. 91, (11), 1637-1640 (2010).
    2. Lighthall, J. W., Dixon, C. E., et al. Experimental models of brain injury. J Neurotrauma. 6, (2), 83-97 (1989).
    3. Dixon, C. E., Clfton, G. L., et al. A controlled cortical impact model of traumatic brain injury in the rat. J Neurosci Methods. 39, (3), 253-262 (1991).
    4. Scheff, S. W., Baldwin, S. A., et al. Morris water maze deficits in rats following traumatic brain injury: lateral controlled cortical impact. J Neurotrauma. 14, (9), 615-627 (1997).
    5. Smith, D. H., Soares, H. D., et al. A model of parasagittal controlled cortical impact in the mouse: cognitive and histopathologic effects. J Neurotrauma. 12, (2), 169-178 (1995).
    6. Hannay, H. J., Feldman, Z., et al. Validation of a controlled cortical impact model of head injury in mice. J Neurotrauma. 16, (11), 1103-1114 (1999).
    7. Natale, J. E., Ahmed, F., et al. Gene expression profile changes are commonly modulated across models and species after traumatic brain injury. J Neurotrauma. 20, (10), 907-927 (2003).
    8. Anderson, R. W., Brown, C. J., et al. Impact mechanics and axonal injury in a sheep model. J Neurotrauma. 20, (10), 961-974 (2003).
    9. Lighthall, J. W. Controlled cortical impact: a new experimental brain injury model. J Neurotrauma. 5, (1), 1-15 (1988).
    10. Chen, S., Pickard, J. D., et al. Time course of cellular pathology after controlled cortical impact injury. Exp Neurol. 182, (1), 87-102 (2003).
    11. Long, J. B., Bentley, T. L., et al. Blast overpressure in rats: recreating a battlefield injury in the laboratory. J Neurotrauma. 26, (6), 827-840 (2009).
    12. Clark, R. S., Schiding, J. K., et al. Neutrophil accumulation after traumatic brain injury in rats: comparison of weight drop and controlled cortical impact models. J Neurotrauma. 11, (5), 499-506 (1994).
    13. Werner, C., Engelhard, K. Pathophysiology of traumatic brain injury. Br J Anaesth. 99, (1), 4-9 (2007).
    14. Colicos, M. A., Dixon, C. E., et al. Delayed, selective neuronal death following experimental cortical impact injury in rats: possible role in memory deficits. Brain Res. 739, (1-2), 111-119 (1996).
    15. Raghavendra Rao, V. L., Dogan, A., et al. Traumatic brain injury leads to increased expression of peripheral-type benzodiazepine receptors, neuronal death, and activation of astrocytes and microglia in rat thalamus. Exp Neurol. 161, (1), 102-114 (2000).
    16. Gao, X., Chen, J. Moderate traumatic brain injury promotes neural precursor proliferation without increasing neurogenesis in the adult hippocampus. Exp Neurol. 239, 38-48 (2013).
    Travmatik Beyin Hasarı için Kontrollü Kortikal Etki Modeli
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Romine, J., Gao, X., Chen, J. Controlled Cortical Impact Model for Traumatic Brain Injury. J. Vis. Exp. (90), e51781, doi:10.3791/51781 (2014).More

    Romine, J., Gao, X., Chen, J. Controlled Cortical Impact Model for Traumatic Brain Injury. J. Vis. Exp. (90), e51781, doi:10.3791/51781 (2014).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    simple hit counter