דגם רומן של טראומטית קל פגיעה מוחית לחולדות לנוער

Summary

The modified weight-drop technique is an easy, cost-effective procedure used for the induction of mild traumatic brain injury in juvenile rats. This novel technique produces clinically relevant symptomology that will advance the study of mild traumatic brain injury (mTBI) and concussion.

Abstract

Despite growing evidence that childhood represents a major risk period for mild traumatic brain injury (mTBI) from sports-related concussions, motor vehicle accidents, and falls, a reliable animal model of mTBI had previously not been developed for this important aspect of development. The modified weight-drop technique employs a glancing impact to the head of a freely moving rodent transmitting acceleration, deceleration, and rotational forces upon the brain. When applied to juvenile rats, this modified weight-drop technique induced clinically relevant behavioural outcomes that were representative of post-concussion symptomology. The technique is a rapidly applied procedure with an extremely low mortality rate, rendering it ideal for high-throughput studies of therapeutics. In addition, because the procedure involves a mild injury to a closed head, it can easily be used for studies of repetitive brain injury. Owing to the simplistic nature of this technique, and the clinically relevant biomechanics of the injury pathophysiology, the modified weight-drop technique provides researchers with a reliable model of mTBI that can be used in a wide variety of behavioural, molecular, and genetic studies.

Introduction

אמנם יש שיטות נפוצות רבות לייצור מתון עד חמורה פגיעה מוחית טראומטית (TBI), מעט מאוד טכניקות פותחו כדי לגרום קל, סגור פגיעות ראש במכרסמים. בשל העובדה שפגיעה מוחית טראומטית קלה (mTBI) הוא פי שלוש יותר נפוץ מאשר פגיעה מוחית בינונית וקשה בשילוב ^1, יש צורך במודל אמין של mTBI כדי להקל על הפתופיזיולוגיה מחקר לגבי, תוצאות נוירו-ביולוגיות והתנהגותיים, ואסטרטגיות טיפוליות. לדוגמא, בחלקו בשל המגבלות של מודלים של בעלי החיים הנוכחיים ^2, בעשור האחרון היו יותר מ -200 ניסויים נכשלו תרופה קליניות לטיפול בTBI ^3. כאשר מערכות דוגמנות נוצרות ללימודי מחקר translational, תחולתו של הממצאים תלויות בתקפותו של המודל מיושם. לצורך המחקר של mTBI / זעזוע מוח, מודל חיה אמין לא רק לחקות את respon הכוחות ביו-המכאניsible לאטיולוגיה פציעה, אלא גם יגרמו תסמינים עקביים עם אלו שדווחו על ידי האוכלוסייה הרלוונטית מבחינה קלינית. יתר על כן, כי ילדים נמצאים בסיכון גבוה במיוחד לmTBI, מערכות דוגמנות אופטימליות תהיה ישימות למכרסמים צעירים ונוער, בנוסף להשווים בוגרים.

ניתוחים ביו-מכאניים של נסיבות שבן ספורטאים ספגו mTBIs או פגיעות מוח מזעזעות עולים כי הגורמים המנבאים הקריטיים ביותר לפגיעה הם האצת ראש מהירה והשפעות ⁴ מהירות גבוהות. רוב המודלים של מכרסמים מועסקים כיום לאינדוקציה של TBI לאפשר תנועה קטנה או לא של הראש ⁵ (לסקירה ראה ^2). המודל המתואר כאן, מספק השפעת מהירות גבוהה לראש של חולדה לנוער חסרת מעצורים פיזי שמלווה בסיבוב 180 מעלות ונפילה חופשית שחל כוחות תאוצה / האטה לראשו של הנושא וגוף. Tהנה שני יתרונות עיקריים הקשורים לטכניקת ירידה במשקל שונה זה לאינדוקציה של mTBI. ראשית, המודל מייצר מזעזע רלוונטיות קליני כמו symptomology מבלי לגרום נזק גלוי למוח (לתיאור מלא של תוצאות התנהגותיות רואים ^6). כמו כן עולה בקנה אחד עם דיווחים קליניים של תסמונת פוסט-מזעזעת, טכניקת ירידה במשקל שונה זה מייצרת תוצאות הטרוגניות. למרות שהתופעות מmTBI הן משמעותיות, יש וריאציה משמעותית בין המכרסמים שחוו mTBI כאשר נבדקו על מדדי תוצאה מרובים. שנית, השיטה מאפשרת הלימוד של mTBI חוזר על עצמו ^7. כמו רוב דגמי TBI קיימים לגרום פציעות חמורות כגון, הוא לעתים קרובות קשה כדי לגרום לפציעה שנייה, וכמעט בלתי אפשרי ללמוד TBI חוזר על עצמו ללא פגיעה נרחבת בכל קליפת המוח.

לכן, הרציונל העיקרי לשימוש בטכניקת הירידה במשקל שונה לתעשייהction של mTBI הוא לייצר פגיעה המייצגת את הפתופיזיולוגיה וsymptomology של זעזוע המוח וTBI חוזר על עצמו באוכלוסיות צעירות יותר מקרוב. עם השכיחות הגוברת של mTBI הקשורים לספורט, נופל, ותאונות דרכים, במיוחד בתקופת ילדות, מודל מכרסם ייחודי זה של mTBI מספק לחוקרים עם כלי רב ערך ללימוד פגיעה מוחית כמו-מזעזעת שיכול להיות מיושם בקלות למספר-להיט פרדיגמות.

Protocol

הערה: כל הניסויים בוצעו בהתאם למועצה הקנדית של טיפול בבעלי חיים ואושרו על ידי אוניברסיטת קלגרי, ועדת האתיקה טיפול בבעלי חיים. 1. גידול והכנת בעלי החיים להזמין חולדות הרות מהספקים סטנדרטיים בעלי חיים במעבדה או גורי גזע בבית על פי פרוטוקולי גידול סטנדרטיים. בית כל בעלי החיים גישה כרצונך מודעת מזון ומים, בחדר בטמפרטורה מבוקרת עכברוש דיור (21 ° C) עם, שנשמרו באור 12:12 hr: מחזור כהה. כאשר גורים מגיעים לאחר הלידה היום 21 (P21), לגמול את הגורים מהאמהות וביתם בקבוצות מאותו המין של 3 או 4. 2. הגדרה-מפגיעה מוחית מכשירים טראומתיים קל (mTBI) לפני תחילתו של הליך, משקולות טחנה למסה הרצויה (למשל 150 גרם). באופן מאובטח לצרף לולאת מתכת לקצה העליון של המשקל המאפשר חוט הדיג להיות fiהיה קבוע למשקל. ציון נייר אלומיניום עם סכין גילוח חד. ודא שנייר אלומיניום הבקיע תומך במשקל הגוף של העכברוש אבל לא יפריע להאצה של העכברוש הבא השפעת הראש עם המשקל. קלטת נייר אלומיניום בשער השלב בצורת U עשוי פלסטיק שקוף (38 x 27 x 27 סנטימטר 3) המכילה ספוג אוסף (38 x 25 x 15 סנטימטר 3) (איור 1), כך שהוא מתוח. מניחים את הבמה פלסטיק בצורת U במיקום הנכון מתחת לצינור המדריך עשוי פלסטיק שקוף. החזק את צינור מדריך פלסטיק (קוטר x 1.5 מ '2.2 סנטימטרים) במקום עם עמדת מהדק ומקם את צינור המדריך כך שזה 3.5 סנטימטרים מעל נייר אלומיניום הבקיע. צרף את חוט הדיג דרך לולאת המתכת למשקל להבטיח שתחתית המשקל תלויה בחופשיות 2.5 סנטימטרים מעל נייר אלומיניום הבקיע. באופן מאובטח לצרף חוט הדיג לדוכן המהדק. הערה: קשירת המשקל לצדפותעמדת p בגובה של 2.5 סנטימטרים מעל נייר האלומיניום מונעת מחדש להיטים בעוד החולדה נופלת מההשפעה לספוג האוסף). משוך את המשקל דרך צינור מדריך פלסטיק עם חוט הדיג ולהחזיק אותו במקום עם סיכת מפתח האלן ב1.0 מ '. 3. אינדוקציה של mTBI כאשר חולדות להגיע P30 כלובי מהלך לחדר פרוצדורליים. מניחים חולדות בחדר isoflurane וקלים להרדים את העכברוש עד שהוא אינו מגיב לקמצוץ כפה או זנב. במהירות מניח את החולדה החזה כלפי מטה על נייר האלומיניום שגמר עם הראש שלה באופן ישיר בדרך של המשקל נופל. ראה איור 2. אם החולדה מתחילה לנוע או השכמה לפני שניתן להציב על נייר אלומיניום כבש, לחזור לתא isoflurane עד שאינו מגיב לקמצוץ כפה או זנב ולהתחיל שוב. משוך את סיכת מפתח אלן, המאפשר למשקל לרדת במאונך דרך צינור מדריך הפלסטיק ולהכות את החולדה על הראש. העכברוש דואר במהירות יעבור סיבוב 180 מעלות ולנחות במצב שכיבה. מייד להסיר את החולדה מהספוג האוסף ולהחיל ידוקאין האקטואלי לראשו של העכברוש עם המוליך כותנה שקצהו. מניחים את החולדה במצב שכיבה בכלוב נקי שמחומם על ידי הגדרת אותו על כרית חימום זמינה מסחרי. שימוש בשעון עצר או שעון עצר דיגיטלי לרכוש את "הזמן לימין". זמן לימין הוא הזמן שלקח לחולדה להתעורר מההרדמה ולהעיף מהמצב שכיבה למצב שכיבה או להתחיל הליכה. להחזיר את החולדה לכלוב-הבית שלה לאחר שהתאוששה התנהגות נורמלית (טיפוח, הליכה, לחקור, וכו '). חזור על שלבים 3.2-3.8 לכל חולדה נוספת הדורשת mTBI. חזור על התהליך באותו העכברוש בנקודות זמן רבות לניסויי mTBI חוזרים ונשנים. 4. אינדוקציה של הפציעה שאם קל anesthetize העכברוש עם isoflurane עד שהוא אינו מגיב לקמצוץ כפה או זנב. במהירות מניח את החולדה החזה כלפי מטה על נייר האלומיניום שגמר עם הראש שלה באופן ישיר בדרך של המשקל נופל. הסר את העכברוש מנייר האלומיניום ללא משיכת סיכת מפתח אלן מצינור פלסטיק המדריך ולהחיל ידוקאין האקטואלי לראש של החולדה עם המוליך כותנה שקצהו. מניחים את החולדה במצב שכיבה בכלוב נקי שמחומם על ידי הגדרת אותו על כרית חימום זמינה מסחרי. השתמש בשעון עצר או שעון עצר דיגיטלי לרכוש את "הזמן לימין". להחזיר את החולדה לכלוב-הבית שלה לאחר שהתאוששה התנהגות נורמלית (טיפוח, הליכה, לחקור, וכו '). 5. אימות של mTBI עם מהלך בדיקת Beam 8 24 שעות אחרי הגיוס של mTBI או בעלי החיים חזרת פציעת דמה לחדר פרוצדורליים. העבר את החולדות לכלוב החזקה נקייהולמקם את הכלוב-הבית של החולדה בסוף הצר של סנטימטר 165 מחודד קורה כך שהחלק הפתוח של הכלוב-הבית עומד בפני הסוף הצר של הקורה. הערה: הקרן מחודדת היא ארוכה 165 סנטימטר. פלטפורמת מרכז הקורה יש רוחב של 6 סנטימטר בסוף הרחב ו1.75 סנטימטר בקצה הצר. יש הקורה במרכז אדנים (רחבים 2 סנטימטר ו -2 סנטימטרים מתחת לקורה במרכז), המספקים בטיחות בעת תלושי הרגל של החולדה. מניחים ריפוד קצף מתחת לקורה כדי להפחית את הסיכון לפגיעה בחולדות שעלולות ליפול הקרן במהלך הבדיקה. הנח מצלמת וידאו בקצה הרחב של הקרן ומיקום המחודדים / להגדיל את מצלמת וידאו על מנת להבטיח שהחוקר צופה בוידאו יכול לראות בבירור את התנועות של החולדה לכל אורכו של הקרן מחודדת. מניחים את החולדה בסוף הרחב של הקרן מחודדת ולעודד אותו ללכת על הקורה לכלוב-הבית שלה. ברגע שהעכברוש חוצה את הקרן מחודדת, לעזוב את החולדה בכלוב-הבית שלה לפחות 60 שניות לרייnForce מיקום היעד. זה מס '1 משפט ולא נכלל בניתוח. הפעל את מצלמת וידאו ובלאפשר העכברוש כדי להשלים את משימת הקורה ההליכה 4 פעמים נוספות (שמירה על תקופות חיזוק 60 שניות בכלוב בבית). ברגע שהחולדה השלימה את כל הניסויים, להחזיר את החולדה לכלוב-הבית שלה. להבקיע, לרשום את המספר של רגל-תלושי רגל אחוריות המתרחשים ואת הזמן / המשך לחצות את הקרן, לכל ניסוי בודד. השתמש בנתונים אלה כדי לחשב את המספר הממוצע של מטר תלושי רגל האחורי וזמן לחצות את הקרן לכל חולדה.

Representative Results

טכניקת הירידה במשקל שונה שתוארה לעיל היא שיטה אמינה לאינדוקציה של פציעה קלה מוח טראומטי (mTBI) בחולדות צעירות. ניצול משקל השפעה של 150 גרם, בטכניקה זו יושמה בהצלחה לחולדות לנוער הנעים 50-120 g. בנוסף, ההליך ניתן לחזור בקלות באותה חיות לחקר mTBI חוזר על עצמו. למרות שבעלי חיים שחווים תערוכת יחיד mTBI עלייה בזמן לימין (איור 3) ומופיעים המומים כשהתעוררו, הם במהירות לחזור לפעילות רגילה והם נבדלים מבחינה ויזואלית מבעלי חיים הפצועים דמה. בהתחשב בכך שהפגיעה היא קלה, לידוקאין האקטואלי אשר מבטל כל כאב הקשורים להשפעה מציצה, הוא משכך הכאבים היחידים שנדרשו. זה חשוב למחקר כתרופות לשיכוך כאבים ידועים להתערב בתהליכים דלקתיים והתאוששות טיפוסיים. בשל חוסר symptomology הגלוי, משימת ההליכה הקרן היא אמינה לol שיכול לשמש כדי לאמת את האינדוקציה של mTBI. חשוב לציין, שלא כל בעלי חיים שחווים mTBI יפגינו גירעונות במשימת ההליכה קורה, אבל כקבוצה, חולדות לנוער עם mTBI להפגין רגל-תלושי רגל משמעותית יותר אחוריות בהשוואה לחולדות לנוער עם פגיעת דמה (איור 4). עוד מאפיין מרכזי של טכניקת ירידה במשקל שונה זו הוא חוסר האיפוק להחיל את החולדה לנוער במהלך האינדוקציה פציעה. על ידי מתן מכה מציצה לראש ואחריו תאוצה סיבובית מהירה והאטה, מודל זה מייצג באופן הדוק יותר הכוחות ביו-המכאניים המיוחס לmTBI וזעזוע המוח. כאשר הליך זה חל על חולדות לנוער או עכברים בוגרים, שיעורי תמותה נמוכים מאוד (7/202 בעלי חיים לנוער ~ 3.4% שיעור תמותה), ושבר בגולגולת ודימום תוך-גולגולתי הם נדירים 6,7 יוצא דופן. בנוסף, המודל מייצר סאי רלוונטיות מבחינה קליניתmptomology. מכרסמים לנוער שחוו mTBI בודד הפגינו גירעונות במאזן התנהגויות ומוטוריות, יחד עם גירעונות בתפקוד ביצועי, עלו התנהגויות כמו דיכאון, ואינטראקציות חברתיות שינו 6,9. באופן דומה, עכברים בוגרים גם להציג גירעונות שיווי משקל וקואורדינציה עדינים שיתאוששו עם זמן 7. לבסוף, אינדוקציה של mTBI באמצעות מודל זה דורשת הרדמה מינימאלית ואינה כרוכה בהכנה כירורגית או מתחפרים לתוך הגולגולת. תוצאות ולכן לא מוטה על ידי השפעות דלקתיות או חיסוניות בלבול מופעלות על ידי הניתוח או הרדמה. יתר על כן, הזמן המהיר התאוששות וחוסר פצעים פתוחים מאפשרים לתחילתו של פרדיגמות בדיקות נוספות להתרחש זמן קצר לאחר מכרסמים לחוות mTBI. איור 1: </strong ייצוג artoon C של בצורה U שלב פלסטיק וספוג אוסף עם כל הממדים הרלוונטיים. מרחק של 10 סנטימטרים חייב להישמר בין ספוג האיסוף והחלק העליון של שלב הפלסטיק כדי להבטיח את החולדה לנוער יש> מספיק זמן כדי להשלים את 180 סיבוב °. איור 2: (א) ייצוג צילום של פלטפורמת האינדוקציה פציעה. עכברוש הנוער ממוקם חזה כלפי מטה על נייר אלומיניום הבקיע כך שהראש הוא ישירות מתחת למשקל נופל. מבט צד (B) של פלטפורמת האינדוקציה פציעה. הפגנת צילום של המשקל המשמש באינדוקציה של mTBI (C) . להעלות / 51,820 / "width =" 500 51820fig3highres.jpg "/> איור 3: ייצוג גרפי של ההבדלים בזמן לימין בין חולדות לנוער הממוצע שחוו mTBI אחת וחולדות לנוער שחוו פציעת דמה (* p <0.01) חולדות שקיבל תערוכת mTBI גידול משמעותי ב. צורך משך הזמן לתקן את עצמם מהמצב שכיבה. איור 4: ייצוג גרפי של מספר מטרים תלושי רגל האחורי הוצגו במשימת ההליכה Beam ידי חולדות צעירות הממוצע שחווה mTBI אחת וחולדות לנוער שחוו פציעת דמה (* p <0.05).

Discussion

Reliable modelling systems are needed to effectively cultivate basic science research that has significant translational validity. In response to rising occurrences and popular media, the investigation of mTBI and concussion has become a priority in many disciplines. However, despite increased research, there have been only incremental improvements in therapeutic strategies and treatment options ³. This lack of progress may be partially due to a discrepancy between the modeling systems employed and actual injury etiology. The majority of studies utilized rodent models that failed to reproduce the important biomechanical forces and appropriate post-injury symptomology. The current human definition of mTBI specifies that the injury results from acceleration and deceleration forces associated with a blunt trauma ¹⁰. The modified weight drop technique described here is therefore an ideal model for the study of mTBI and concussion because it uses a glancing impact to cause rapid rotational acceleration and deceleration to the head of an unrestrained animal, mimicking the biomechanical forces identified in sports-related injuries and automobile accidents. In addition, this model is easily adapted to examine repetitive mTBI, a phenomena that is emerging as a serious medical and socioeconomic issue. Studies indicate that rodents may be exposed to a series of 10 distinct mTBIs with minimal mortality ⁷. Finally, the method is inexpensive and can be carried out rapidly, allowing for high-throughput examination of a many therapeutic compounds and treatment regiments.

Just as with any procedural technique, certain aspects of the protocol are particularly important to the generation of reliable results. First, the tin foil needs to be scored effectively. If the tin foil is not properly scored, the force imparted by the weight during the glancing impact will not be enough to propel the juvenile rat through the tin foil onto the collection sponge. In these situations, the rat will remain in the starting position (chest down on the tin foil) and the mTBI will result from the blunt trauma from the weight impacting the stationary head, not the rotational acceleration and deceleration desired. Second, during the induction of the mTBI and the sham injury, the level of anesthetic applied to each rat should be consistent. Owing to the fact that time-to-right is used as marker of mTBI, the researcher should try to ensure that animals receiving a mTBI and animals receiving a sham injury are exposed to similar levels of anesthetic. A major advantage to this technique over many other TBI procedures is the low level and duration of anesthesiology. However, the juvenile rat needs to be non-responsive to a toe or tail pinch to ensure they do not wake-up on the stage before the injury is induced. Finally, in order to maintain a consistent injury etiology, the positioning of the rat’s head is particularly important. Ideally the weight should impact the center of the dorsal surface of the head. Caution should be taken to avoid positioning the path of the weight too near the caudal/posterior portion of the head, as impacting the brainstem and cerebellum is associated with increased mortality and seizure activity.

Based upon the biomechanical pathophysiology of injury induction and the behavioural outcomes examined, the modified weight-drop technique appears to be a reliable model for the investigation of paediatric mTBI and concussion. Although preliminary studies of this novel model have assessed some basic molecular and structural changes ⁷ future studies will be needed to ascertain how the brain responds to a mTBI with this injury etiology. An in-depth analysis of the neuroanatomical and biological changes that occur at the cellular and epigenetic level would increase model validity and translational applicability. In addition to stimulating the generation of targeted pharmacological therapies, understanding the pathophysiological changes that occur in the brain in response to mTBI and concussion would also direct the research related to clinical biomarkers that have the ability to predict outcomes following injury.

Materials

Brass Weights	Ginsberg Scientific	7-2500-2	Need to have metal loop attached to base
Alluminum Foil	Alcan		Available at most grocery stores
Masking Tape			Commercially available
U-Shaped Plastic Stand			Constructed by Laboratory
Clamp Stand	Sigma-Aldrich	Z190357
Plastic Guide Tube			Could be constructed or purchased at a hardware store
Fishing Line	Angler 10lb		Purchased from a sporting goods retailer
Isoflurane	Pharmaceutical Partners of Canada	DIN 02237518	Inhalation Anesthetic
Topical Lidocaine (30ml)	Astra Zeneca	DIN 0001694	Xylocaine Jelly 2%
Cotton Swabs			Commercially available
Heating Pad – 3 heat setting			Commercially available
Stop Watch	Sportline	L303	Purchased from a sporting goods retailer
Video Camera	Sony	HDR-CX260V
Sprague Dawley Rats	Charles River Laboratories	SAS SD 40	Male and females ordered from Charles River Laboratories and pups bred in-house
Balance Beam			Constructed by Laboratory