Medicine

Çocuk Rats için Hafif Travmatik Beyin Hasarı Yeni Bir Model

Published: December 8, 2014 doi: 10.3791/51820

Richelle Mychasiuk¹, Allyson Farran¹, Mariana Angoa-Perez², Denise Briggs², Donald Kuhn², Michael J. Esser¹

¹Alberta Children's Hospital Research Institute, University of Calgary, ²Department of Psychiatry and Behavioral Neurosciences, Wayne State University School of Medicine & John D. Dingell VA Medical Center

Introduction

Orta-şiddetli travmatik beyin hasarı (TBI), çok az teknikler hafif ikna etmek için geliştirilmiştir nesil için pek yaygın olarak kullanılan yöntemler olmasına rağmen, kemirgenlerde kafa yaralanmaları kapattı. Hafif travmatik beyin hasarı (HTBH) üç kat daha sık ¹ kombine orta ve şiddetli beyin hasarı daha olması nedeniyle, HTBH güvenilir bir model araştırması ile ilgili patofizyolojisi, nörobiyolojik ve davranışsal sonuçları ve tedavi stratejileri kolaylaştırmak için gereklidir. Örneğin, 200'ün üzerinde olmuştur son on yılda, mevcut hayvan modellerinde ² sınırlamaları kısmen TBI ³ tedavisi için ilaç klinik araştırmaları başarısız oldu. Modelleme sistemleri öteleme araştırma çalışmaları için oluşturulan zaman, bulguların uygulanabilirliği uygulanan modelin geçerliliği bağlıdır. HTBH / sarsıntının çalışma için, güvenilir bir hayvan modeli sadece biyomekanik güçler yanıtlayanların taklit olmazyaralanma etiyolojisi için Sible, ama aynı zamanda klinik olarak ilgili nüfus tarafından bildirilen ile tutarlı belirtiler neden olur. Çocuk HTBH için yüksek risk altındadır için Ayrıca, en iyi model sistemleri, yetişkin eşdeğer yanı sıra genç ve çocuk kemirgenler için geçerli olacaktır.

Sporcular mTBIs veya sarsıcı beyin yaralanınca hangi koşullar biyomekanik analizler yaralanma için en kritik belirleyici faktörlerin hızlı kafa hızlanma ve yüksek hız etkileri ⁴ olduğunu göstermektedir. Şu anda TBI uyarılması için kullanılan kemirgen modellerinde çoğunluğu kafa ⁵ (inceleme için ^{2 ye} bakınız) veya çok az hareket izin verir. Burada özetlenen modeli, öznenin baş ve vücuda hızlanma / yavaşlama kuvvetleri uygular bir 180 ° dönme ve serbest düşme eşlik fiziksel sınırsız çocuk sıçan kafasına bir yüksek hız etkisini sunar. TBurada HTBH uyarılması için bu modifiye kilo damla tekniği ile ilişkili iki ana avantajı vardır. İlk model (davranışsal sonuçlar ⁶ bakınız tam açıklaması için) beyne herhangi bir açık zarar vermeden semptomolojisine gibi klinik olarak anlamlı sarsıcı üretir. Post-sarsıcı sendromun klinik raporları ile de tutarlı, bu modifiye kilo bırak tekniği heterojen sonuçlar üretir. HTBH gelen etkileri önemli olmasına rağmen, birden fazla sonuç ölçütleri üzerinde incelendiğinde bir HTBH deneyimli kemirgenler arasında önemli farklılıklar vardır. İkinci olarak, yöntem tekrar HTBH ⁷ çalışmasına izin verir. Mevcut TBI modellerin çoğunluğu gibi ciddi yaralanmalara indirebilmek gibi, tüm korteks kapsamlı zarar vermeden tekrarlayan TBI incelemek için genellikle ikinci hasara yol zor ve neredeyse imkansız.

Bu nedenle, sanayii için modifiye kilo damla tekniğini kullanarak birincil gerekçesiHTBH ve ction daha yakından çocuk toplumlarda patofizyoloji ve sarsıntının semptomolojiyi ve tekrarlayan TBI temsil eden bir yaralanma üretmektir. Özellikle çocukluk döneminde artan sporla ilgili HTBH insidansı, düşme ve kazaları otomobil ile, HTBH bu eşsiz kemirgen modeli kolaylıkla çoklu-hit uygulanabilir sarsıcı gibi beyin hasarının çalışma için değerli bir araç ile araştırmacılar sağlar paradigmalar.

Protocol

NOT: Tüm deneyler Hayvan Bakımı Kanada Konseyi çerçevesinde yürütülmüştür ve Calgary Üniversitesi, Hayvan Bakım Etik Komitesi tarafından kabul edildi.

1. Yetiştirme ve Hayvan Hazırlık

Standart üreme protokollerine göre içi standart laboratuar hayvan tedarikçileri veya ırk yavrular hamile fareler Sipariş.
Karanlık döngüsü: Oda ısısı kontrol edilen bir sıçan muhafaza odası (21 ° C) 'de yiyecek ve su ad libitum girişleri, tüm hayvanlar, bir 12:12 saat ışık tutulur.
Yavrular doğum sonrası gün 21 (P21) ulaştığınızda, 3 ya da 4 eşcinsel gruplar annelerinden ve evinden yavrular vazgeçirmek.

Hafif Travmatik Beyin Hasarı (HTBH) Aparatı 2. Set-up

Işlemin başlamasından önce, arzu edilen kütleye değirmen ağırlıkları (örneğin, 150 g) eklenmiştir. Güvenli olta fi olmasını sağlayan ağırlık üst ucuna bir metal kordonuağırlığa duran.
Keskin bir jilet ile kalay folyo Puan. Attı kalay folyo sıçan vücut ağırlığını destekleyen ama ağırlığı ile baş etkisi aşağıdaki sıçan ivme engel olmaz emin olun.
O gergin böylece, bir koleksiyon sünger (38 x 25 x 15 cm ³⁾ (Şekil 1) içeren Teyp şeffaf plastik (38 x 27 x 27 cm ³⁾ yapılan U-şekilli aşamaya attı kalay folyo.
Şeffaf bir plastikten imal kılavuz tüpü altında doğru konumda U-şekilli plastik aşaması yerleştirin.
Bir kelepçe stand yerine plastik kılavuz tüp (2.2 cm çap x 1,5 m) tutun ve attı kalay folyo üzerinde 3,5 cm olacak şekilde kılavuz tüpü yerleştirin.
Ağırlık alt serbestçe 2,5 cm attı kalay folyo üstünde asılı sağlamak ağırlığı metal döngü içinde olta takın.
Güvenli kelepçe stand olta veriyoruz.
NOT: kum midyesi ağırlık hayvan zinciriSıçan toplama sünger etkisi) düşen ise kalay folyo üzerinde 2.5 cm'lik bir yüksekliğe p'nin yeniden isabet engeller.
Olta ile plastik kılavuz tüp aracılığıyla kilo çekin ve 1.0 m altı köşeli anahtar iğne ile yerde tutun.

HTBH 3. İndüksiyon

Sıçanlar usul odasına P30 hareket kafesleri ulaştığınızda.
Izofluran odasında sıçan yerleştirin ve bir pençe veya kuyruk tutam olmayan duyarlı kadar hafifçe sıçan uyutmak.
Hızla düşen ağırlık yolu doğrudan kafa ile attı kalay folyo üzerindeki sıçan göğüs aşağı yerleştirin. Şekil 2 Bkz. Sıçan taşımak veya uyanma attı kalay folyo üzerine yerleştirilebilir önce, bir pençe veya kuyruk tutam olmayan duyarlı kadar izofluran odasına geri dönmek ve tekrar başlamak başlarsa.
Ağırlık plastik kılavuz tüp aracılığıyla dikey düşmek ve kafasına sıçan grev izin, Allen anahtar pimini çekin. The sıçan hızla sırtüstü pozisyonda bir 180 ° dönme ve arazi geçecek.
Hemen toplama sünger sıçan kaldırmak ve bir pamuk uçlu aplikatör ile sıçan başına topikal lidokain uygulamak.
Bir ticari olarak temin edilebilen ısıtma pedi üzerine ayarlayarak ısıtılır, temiz bir kafesi içinde sırt üstü pozisyonda sıçan yerleştirin.
Bir kronometre kullanarak veya dijital zamanlayıcı "zaman sağa" kazanır. Zaman sağa anestezi gelen uyanmak ve yüzüstü pozisyona sırtüstü pozisyondan çevirmek veya yürüyüş başlamak için sıçan tarafından alınan zamandır.
Normal davranış (vb keşfetmek, damat yürüme) kurtarıldı sonra ev kafesine sıçan dönün.
Tekrar bir HTBH gerektiren her ek sıçan 3,2-3,8 adımları.
Tekrarlayan HTBH deneyler için çoklu zaman noktalarında aynı sıçan prosedürü tekrarlayın.

Sham Yaralanma 4. İndüksiyon

Hafifçe AnestBir pençe veya kuyruk tutam olmayan duyarlı kadar izofluran ile sıçan hetize.
Hızla düşen ağırlık yolu doğrudan kafa ile attı kalay folyo üzerindeki sıçan göğüs aşağı yerleştirin.
Plastik kılavuz tüp allen anahtar pimini çekmeden kalay folyo sıçan çıkarın ve bir pamuk uçlu aplikatör ile sıçan başına topikal lidokain uygulamak.
Bir ticari olarak temin edilebilen ısıtma pedi üzerine ayarlayarak ısıtılır, temiz bir kafesi içinde sırt üstü pozisyonda sıçan yerleştirin.
"Zaman-sağa" elde etmek için bir kronometre veya dijital zamanlayıcı kullanın.
Normal davranış (vb keşfetmek, damat yürüme) kurtarıldı sonra ev kafesine sıçan dönün.

Işın Yürüyüş Testi ⁸ ile HTBH 5. Doğrulama

Usul odasına HTBH veya sahte yaralanma dönüş hayvanların indüksiyon sonrası 24 saat.
Temiz bir tutma kafesine sıçan aktarınve ev-kafesin açık uçlu kısmı kirişin dar ucunu karşıya şekilde ışın konik 165 cm dar sonunda sıçan ev kafes yerleştirin.
NOT: konik ışın 165 cm uzunluğundadır. kirişin merkezi platform geniş ucunda 6 cm ve dar sonunda 1.75 cm bir genişliğe sahiptir. merkezi ışın zaman sıçan ayak makbuzları güvenliğini sağlayan çıkıntılar (2 cm genişliğinde ve merkez kiriş altında 2 cm) sahiptir. Test sırasında ışın düşebilir sıçanlara yaralanma riskini azaltmak için kiriş altına köpük dolgu yerleştirin.
Konik kiriş ve pozisyon geniş ucunda bir video kamera yerleştirin / video izlerken araştırmacı açıkça konik kirişin tüm uzunluğu boyunca sıçan hareketlerini görebilirsiniz sağlamak için video kamera yakınlaştırın.
Konik ışın geniş ucunda sıçan yerleştirin ve ev kafes kiriş üzerinde yürümek için teşvik ediyoruz. Sıçan konik ışın haçlar sonra, rei en az 60 saniye boyunca kendi ev-kafeste sıçan bırakınhedef konumu nForce. Bu Deneme # 1 ve analize dahil değildir.
Video kamerayı açın ve fare kiriş-yürüme görevi 4 ek kez (ev kafeste 60 sn takviye dönemleri muhafaza) tamamlamak için izin verir. Sıçan, tüm denemeler tamamlandıktan sonra, kendi ev-kafesine sıçan dönün.
Puan için, meydana ve zaman / süre her deneme için, ışın geçmeye arka bacak ayak-slip sayısını kaydedin. Her bir sıçan için ışın geçmeye arka bacak ayak-bordroları ve zaman ortalama sayısını hesaplamak için bu verileri kullanın.

Representative Results

Yukarıda açıklanan değiştirilmiş ağırlık-bırak tekniği çocuk sıçanlarda hafif travmatik beyin hasarı (HTBH) indüksiyonu için güvenilir bir yöntemdir. 150 g kadar bir darbe ağırlığı kullanarak, bu teknik, başarılı bir şekilde 50-120 g arasında değişir çocuk farelere uygulanmıştır. Buna ek olarak, yöntem kolayca tekrar HTBH çalışması için aynı hayvanlarda tekrar edilebilir. (Şekil 3), tek bir HTBH sergileyin zaman sağa bir artış tecrübe ve görünen hayvanlar uyanma üzerine hayrete rağmen, hızla normal faaliyetlerine devam ve sahte-yaralı hayvanlardan görsel ayırt edilemez. Yaralanma bakarak etkisi ile ilişkili herhangi bir ağrı ortadan kaldırır, topikal lidokain, gerekli tek analjezik hafif olduğunu göz önüne alındığında. Ağrı kesiciler tipik enflamatuar ve geri kazanım işlemlerine müdahale ettiği bilindiğinden, bu araştırma için önemlidir. Açık semptomolojisine eksikliği nedeniyle, kiriş yürüme görevi için güvenilir olduğunuHTBH uyarılmasını doğrulamak için kullanılabilir ol elde edilir. Bir HTBH deneyim değil tüm hayvanlar ışın yürüme görev açıklarının sergileyecek ki, dikkat etmek önemlidir, ama bir sahte yaralanma ile çocuk sıçanlara kıyasla bir grup olarak, bir HTBH ile çocuk fareler çok daha arka bacak ayak-fişleri göstermek (Şekil 4).

Bu modifiye ağırlık bırak tekniği bir diğer önemli özelliği yaralanma indüksiyon sırasında çocuk sıçan uygulanan kısıtlama olmaması. Hızlı dönme hızlanma ve yavaşlama ardından kafasına bakarak darbe sunarak, bu model daha yakından HTBH ve sarsıntı atfedilen biyomekanik güçleri temsil eder. Bu prosedür çocuk veya yetişkin sıçanlarda farelere uygulandığında, mortalite oranları (7/202 çocuk hayvanlar ~ 3.4% ölüm oranı) son derece düşük olup, kafatası kırığı ve kafa içi kanama ^6,7 derece nadirdir. Buna ek olarak, model, klinik açıdan ilişkili sy üretirmptomology. Tek bir HTBH deneyimli Çocuk kemirgenler depresif-benzeri davranışlar artan yönetici fonksiyonu açıkları, ve değişmiş sosyal etkileşimler ^6,9 ile birlikte, denge ve motor davranışları açıkları gösterdi. Benzer şekilde, yetişkin fareler de zaman ⁷ kurtarmak hafif denge ve koordinasyon açıkları görüntüler. Son olarak, HTBH bu modeli kullanarak indüksiyon az anestezi gerektirir ve cerrahi hazırlık veya kafatası içine burrowing içermez. Sonuçlar, bu nedenle cerrahi veya anestezi ile tetiklenen karıştırıcı enflamatuar veya immünolojik etkileri ile önyargılı değil. Ayrıca, açık yaraların hızlı bir toparlanma süresi ve eksikliği kemirgenler HTBH deneyimi kısa bir süre sonra oluşacak ek test paradigmaları başladığını sağlar.

Şekil 1,
Şekil 1: > Tüm ilgili boyutları ile plastik sahne ve tahsilat sünger U-şekilli. 10 cm bir mesafe toplama sünger ve çocuk sıçan sağlamak için plastik aşamasında üst arasında muhafaza edilmelidir C Artoon gösterimi 180'e tamamlamak için yeterli zaman vardır ° dönme.

Şekil 2,
Şekil 2: Yaranın platformun (A) 'Fotografik temsili. Kafa düşen ağırlık altında doğrudan böylece çocuk sıçan attı kalay folyo göğüs aşağı yerleştirilir. yaralanma indüksiyon platformu (B) Yan görünümü. (C) HTBH indüksiyonunda kullanılan ağırlık Fotografik gösteri .

yüklemek / 51.820 / 51820fig3highres.jpg "width =" 500 "/>
Şekil 3: a. HTBH sergileyin önemli bir artış almış bir tek HTBH ve sahte yaralanma yaşadı çocuk sıçanlar (* p <0.01) Rats deneyimli zaman sağa çocuk sıçanlarda arasındaki ortalama farklar grafiksel gösterimi zaman süresi sırtüstü pozisyonda kendilerini sağa gerekiyordu.

Şekil 4,
Şekil 4: Tek bir HTBH ve sahte yaralanma yaşadı çocuk sıçanlar (* p <0.05) deneyimli çocuk fareler tarafından Kiriş Yürüyüş görev sergilenen arka bacak ayak-slip ortalama sayısının grafiksel gösterimi.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Brass Weights	Ginsberg Scientific	7-2500-2	Need to have metal loop attached to base
Alluminum Foil	Alcan		Available at most grocery stores
Masking Tape			Commercially available
U-Shaped Plastic Stand			Constructed by Laboratory
Clamp Stand	Sigma-Aldrich	Z190357
Plastic Guide Tube			Could be constructed or purchased at a hardware store
Fishing Line	Angler 10lb		Purchased from a sporting goods retailer
Isoflurane	Pharmaceutical Partners of Canada	DIN 02237518	Inhalation Anesthetic
Topical Lidocaine (30ml)	Astra Zeneca	DIN 0001694	Xylocaine Jelly 2%
Cotton Swabs			Commercially available
Heating Pad - 3 heat setting			Commercially available
Stop Watch	Sportline	L303	Purchased from a sporting goods retailer
Video Camera	Sony	HDR-CX260V
Sprague Dawley Rats	Charles River Laboratories	SAS SD 40	Male and females ordered from Charles River Laboratories and pups bred in-house
Balance Beam			Constructed by Laboratory

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

DeWitt, D., Perez-Polo, R., Hulsebosch, C., Dash, P., Robertson, C. Challenges in the development of rodent models of mild traumatic brain injury. Journal of Neurotrauma. 30, 688-701 (2013).
Xiong, Y., Mahmood, A., Chopp, M. Animal models of traumatic brain injury. Nature Reviews Neuroscience. 14, 128-142 (2013).
Zhang, Z., Lerner, S., Kobiessy, F., Hayes, R., Wang, K. Systems biology and the anostic approach to drug discovery and development to treat traumatic brain injury. Systems Biology in Drug Discovery and Development: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology. Yan, Q. , Springer Science. Forthcoming.
Viano, D., Casson, I., Pellmen, E. Concussion in profession football: Biomechanics of the struck player - Part 14. Neurosurgery. 61, 313-327 (2007).
Marmarou, A., et al. A new model of diffuse brain injury in rats: Part 1 - Pathophysiology and biomechanics. Journal of Neurosurgery. 80, 291-300 (1994).
Mychasiuk, R., Farran, A., Esser, M. J. Assessment of an experimental rodent model of pediatric mild traumatic brain injury. Journal of Neurotrauma. 31 (8), (2014).
Kane, M., et al. A mouse model of human repetitive mild traumatic brain injury. Journal of Neuroscience Methods. 203, 41-49 (2012).
Schallert, T., Woodlee, M., Fleming, S. Disentangling multiple types of recovery from brain injury. Pharmacology of Cerebral Ischemia. Krieglstein, J., Klumpp, S. , Medpharm Scientific Publishers. Stuttgart. (2002).
Mychasiuk, R., Hehar, H., Farran, A., Esser, M. J. Mean Girls: Sex differences in the effects of mild traumatic brain injury on the social dynamics of juvenile rat play behaviour. Behavioural Brain Research. 259, (2014).
Centers for Disease Control and Prevention. Report to congress on mild traumatic brain injury in the United States: Steps to prevent a serious public health problem. , Centers for Disease Control and Prevention. Atlanta, GA. 1-47 (2003).