Vi her beskriver hvordan du utfører multi-elektrode array-innspillinger av menneskelig epileptisk kortikale vev. Epileptisk vev reseksjon, slice forberedelse og multi-elektrode array-innspillinger av interiktal og ictal hendelser er vist i detalj.
Epilepsi, berører om lag 1% av befolkningen, består av en gruppe nevrologiske lidelser kjennetegnet ved den periodiske forekomsten av anfall, som forstyrrer normal hjernefunksjon. Til tross for behandling med tilgjengelige antiepileptika målretting nevrale funksjoner, en tredjedel av pasienter med epilepsi er pharmacoresistant. I denne tilstanden, kirurgisk fjerning av hjernen området genererer anfall fortsatt den eneste alternativ behandling. Studere menneskelige epileptiske vev har bidratt til å forstå nye epileptogene mekanismer i løpet av de siste 10 årene. Faktisk disse vev generere spontane interiktal epileptiske utslipp samt farmakologisk indusert ictal hendelser som kan tas opp med klassiske elektrofysiologiske teknikker. Bemerkelsesverdig, multi-elektrode arrays (måle), som er microfabricated enheter embedding en rekke romlig arrangert mikroelektroder, gir en unik mulighet til å samtidig stimulere og rekordstort felt potentials, samt aksjonspotensialer av flere neuroner fra forskjellige områder av vev. Dermed MEAS innspillinger tilbyr en utmerket tilnærming for å studere rom-tid-mønstre av spontan interiktal og fremkalt anfallslignende hendelser og mekanismene bak beslag utbruddet og forplantning. Her beskriver vi hvordan å forberede menneskelige kortikale skiver fra kirurgisk reseksjon vev og å spille inn med MEAs interiktal og ictal lignende hendelser ex vivo.
Epilepsi er en kronisk lidelse der epileptiske anfall, som er forbigående mønstrede utslipp som varer i flere sekunder til titalls sekunder på (EEG) innspillinger forbundet med kliniske manifestasjoner, avbryte en interiktal tilstand, preget av tilstedeværelsen av synkrone nevronale utslipp varige titalls millisekunder og kalte interiktal hendelser 1. Det rammer ca 1% av verdens befolkning, og selv om beslag kontrolleres hos flertallet av pasientene, har omtrent en tredjedel av mennesker med epilepsi ikke viser tilstrekkelig respons på antiepileptika 2. I denne tilstanden, som kalles pharmacoresistant epilepsi og hvis mekanismer har fortsatt å være tydelig identifisert, kirurgisk reseksjon av den spesifikke delen av hjernen identifisert som beslaget-utbruddet sonen er fortsatt den eneste alternativ behandling som gir et positivt utfall for pasientene. Således er de avkuttede prøver fra kirurgi, hvilket ga opporheten til å studere mekanismene for interiktal utslipp og anfalls generering og forplantning, samt pharmacoresistance på levedyktige humane sentralnervevevet ex vivo.
Multi-elektrodegrupper (måle), bestående av et arrangement av rommessig fordelte mikroelektroder, tillate den samtidige stimulering og registrering av elektrofysiologisk aktivitet fra flere steder av vevet, og dermed gi en god tilnærming for å studere spatio-temporale mønstre av spontan og fremkalt aktivitet . Denne teknikken, først anvendt for å overvåke den utviklingsmessige forandringer av neuronal cellekultur-aktivitet 3 og deretter tilpasset for akutt og organotypiske hjernen og ryggmargen skiver 4-6, anses i dag som et verdifullt verktøy for elektrofysiologisk.
Den nåværende protokollen beskriver hvordan å forberede menneskelige kortikale skiver fra kirurgisk reseksjon vev og å spille inn med MEAs pålitelig ex VIvo interiktal og beslag lignende hendelser fra disse skiver. Denne teknikken gir dermed en måte å løse de grunnleggende mekanismene bak epileptiske aktiviteter initiering, spredning og skadevirkninger av antiepileptika hos både via mobil og nettverksnivå. Alle de fremgangsmåter som brukes for å få tak i, fremstille, vedlikeholde og registrere humane skiver er her beskrevet i detalj.
Pharmacoresistant epilepsi er en sjelden tilstand, som kan utforskes i menneskelig vev in vitro. Dette gjør det mulig å studere epileptisk menneskelige cortex, som viser konkrete mangler som bare delvis gjengitt i dyremodeller. Metoden her er beskrevet kan forberede og opptak menneskelige postoperative vev ex vivo med bevart cellular levedyktighet og nettverk slik at de spontant produserer epileptiske aktiviteter. Beholde lignende aktiviteter enn de som er registrert i vivo er avgjørende for å studere mekanismene for dannelsen av patologiske aktiviteter. Videre er slike fremgangsmåter gjør det mulig å utforske humane vev og unngå ikke-perfekte dyremodeller av sykdommen. Men å studere menneskelig vev krever synkronisering mellom nevrokirurger og den eksperimentelle laboratorium. Tissue transport krever spesiell forsiktighet for ikke å være traumatisk. I tillegg er både mengden av prøven og vev begrenset. Til slutt, er tilgang til skikkelige kontroll vev i main bekymring. Med dette preparatet, de postoperative vev spontant produsere interiktal lignende utslipp i normal ACSF 7,8. Ictal-lignende hendelser kan også bli utløst i modifisert, proconvulsive ACSF slik at mekanismene for beslag initiering og overgangen fra interiktal tilstanden til anfall kan undersøkes.
Menneskelig vev kan holdes levedyktig i inntil 10 timer i vilkårene for grensesnitt. Slices ble ansett levedyktig når multi-unit aktivitet eller feltpotensialer ble observert spontant og når slike aktiviteter ble fremkalt av økende oppstemthet gjennom ekstracellulære kalium øker og / eller magnesium nedgang. Selv om variasjon i aktiviteten skjer, som sannsynligvis gjenspeiler forskjeller i patologi og kortikale områder, utforsket vi epileptogene egenskapene til en vev bare hos friske skiver som viser spontan interiktal og vakte ictal utslipp. For å bevare vev vitalitet og aktivitet, er et grensesnitt kammer brukes til å lagre than skiver på 36-37 ° C for å bli frisk før innspilling med MEA system. Faktisk har flere grupper tydelig vist fordelene ved grensesnittet basert lagringssystem, sammenlignet med standard begerglass lagring og viktigheten av temperaturen for bevaring av aktivitet, slik som nettverk spontane skarpe bølgekrusninger eller kolinerge-induserte oscillasjoner 9,10. Interface lagring av skiver har tidligere blitt brukt til å spille epileptisk aktivitet fra menneskelig hippocampus og subicular skiver 1,11. Med dagens MEA teknikk, etter utvinning perioden fra slicing i vilkårene for grensesnitt, er nettverksaktivitet registrert i neddykket forhold, i nærvær av høy strømningshastighet (5-6 ml / min) ved 37 ° C, med MEA system. Den reduserte diameter (1,8 cm) av MEA chip, som avgrenser et kammer med lite volum (<1,5 ml), sammen med den økte strømningshastighet, øker oksygentilførsel av skiven, som er blitt demonstrert å være en kritisk faktor for spontan og pharmacologically-indusert nettverksaktiviteter 9,10. Videre, den reduserte mengden av sirkulerende ACSF muliggjør farmakologisk testing.
Den slicing prosedyren er imidlertid et trauma for vev 12. Både neuronal arkitektur og klorid homeostase synes å være perturbert på vevsoverflaten (50 um). Opprinnelsen av aktivitetene registrert av MEA chips, som sample vevet stort sett overfladisk uten dyp penetrasjon, kan oppstå fra traumatiserte områder. Men våre data viser at de ekstracellulære feltpotensialer oppdages lokalt er registrert i de fleste MEA elektroder og tidligere arbeid viser at de er integrert over en 100 til 200 mikrometer avstand fra innspillingen nettstedet 13, noe som tyder på at beslagene registrert i vår forberedelse er usannsynlig å være produsert av traumatiserte områder. Videre, i studier utført med wolfram elektroder muliggjør dyp penetrasjon, de epileptiske aktiviteter registrert i menneskelig vev er liktil de som er observert hos pasienter med epilepsi 1,7,8.
En annen begrensning av ex vivo vev opptak avbrudd av sammenhengene mellom de ulike hjerneområder, og dermed begrense dynamiske neuromodulations. Dette kan forklare hvorfor i et slikt vev ingen ictal-lignende hendelse er spontant innspilt, men krever å bli utløst av ionisk manipulasjon eller farmakologisk stimulering styrke oppstemthet. Følgelig, i denne protokollen, anfalls-lignende hendelser indusert ved å kombinere en endring i ekstracellulært K + 3-6 mM og en reduksjon av ekstern Mg 2+ fra 1,3 mM til Mg2 + -fri ACSF, for å øke vev eksitabilitet og fjerne Mg 2+ -avhengig NMDA reseptor blokk. Faktisk har det tidligere blitt påvist at epileptiform aktivitet indusert i menneskelige neokortikale og hippocampus skiver ved hjelp av Mg 2+ -fri ACSF ligner elektrografisk anfall registrert in vivo 14. Dessutendet har blitt vist at epileptiske utslipp oppnådd i tinninglappen skiver bli resistente mot klinisk brukte antiepileptika etter langvarig eksponering for Mg 2+ -fri ACSF 15,16, og dermed gi en modell for å undersøke pharmacoresistant anfallslignende hendelser in vitro.
MEAs tillate opptak av begge, potensialer felt og multi-unit virksomhet som består i nerveaksjonspotensialer ex vivo. Dermed MEAs er en kraftig elektroverktøy i forhold til EEG, som utforsker feltpotensialer generert av synkrone aktiviteter av nevronale ensembler in vivo, men ikke gir tilgang til én nervecelle Adferd 17. Selv om nyere mikroelektroder kan spille in vivo multi-unit virksomhet som består i nerveaksjonspotensialer, de er invasiv, så bruken er stort sett begrenset til forskningsformål under intrakranielle innspillinger. Spesielt MEAS opptak representerer en teknikk for valgå studere rom-tid-mønstre av epileptiske hendelser, mekanismene som kontrollerer beslag utbruddet og forplantning og handlingen av klassiske og nye antiepileptika. Bemerkelsesverdig, for å avdekke celletyper og signal grunnlag av epileptiske utladninger, pigge sortering teknikker og farmakologisk testing bør kombineres med MEA teknikker. Selv MEAs kan gi tilgang til individuelle pigger, har de ikke gi informasjon om synaptiske og biofysiske egenskaper. I fremtiden bør andre teknikker kobles til MEA innspillinger for bedre å prøve cellular atferd, nettverksaktiviteter og synaptisk signalering. For eksempel, for å fluorescens-avbildning rakne neuroner eller glial-celler oppførsel, så vel som ion-dynamikk, kan kombineres med Meas opptak. Videre post hoc histologisk analyse kan også avsløre spesifikke forandringer av celletyper, proteiner eller reseptorer slik at plasseringen av de epileptiske aktiviteter kan være korrelert med spesifikke rearrangementer avnervøs struktur. Den MEAs Systemet kan også bygges inn i en patch-clamp set-up å korrelere enkeltceller eller conductances med aktiviteter befolknings. I fremtiden kan optogenetic verktøy også anvendes, forutsatt at humane skiver kan dyrkes på lang sikt, så utført for organotypiske skiver, slik at transfeksjon eller infeksjon av spesifikke celletyper kan utføres.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra ANR (Programme Blanc Neurosciences), FRC (Fédération pour la Recherche sur le Cerveau), City of Paris (Programme Emergence), INSERM og La Pitié Salpêtrière Hospital (translasjonsforskning kontrakt) til NR, fra Neuropôle de Recherche Francilien (Nerf) til ED, fra Université Pierre et Marie Curie UPMC (Programme Convergence) og fra Institut du Cerveau et e la Moelle epiniere (Paris) til GH
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Brain Slice Chamber-2: Interface | AutoMate Scientific, Inc. | S-BSC2 | It requires separate temperature controller |
2-channel Temperature Controller | Multichannel Systems, Germany | TC02 | It allows to plug in and use 2 interface chambers. |
Special cable for connection of TC01 to S-BSC2 with external reference PT100 | Multichannel Systems, Germany | CA3 | The reference PT100 is placed near the slices |
6pin plug-connector with PT100 | Multichannel Systems, Germany | TS-PT100 | External reference for CA3 cable |
MEA workstation for recording data from 120-electrode MEAs | Multichannel Systems, Germany | MEA2100-120 | It includes MEA2100-120 headstage and MEA2100 interface board. www.multichannelsystems.com |
Microelectrode array for MEA2100-120 | Multichannel Systems, Germany | 120MEA200/30 | Electrode spacing: 200 µm; electrode diameter: 30 µm; glass ring: 6 mm high. Different configurations (spacing, diameter, ring) possible. |
Video Microscope Table | Multichannel Systems, Germany | MEA-VMT-1 | Table with a video microscope underneath to image the electrode field of the MEAs in an amplifier placed on top of the table and transfer the image to a computer. |
Perfusion cannula | Multichannel Systems, Germany | PH01 | Heatable perfusion cannula with temperature sensor; temperature can be programmed with TC02 controller |
MC_Rack | Multichannel Systems, Germany | Software for data acquisition and recordings | |
Magnetic Perfusion Holder | Multichannel Systems, Germany | MPH | Magnetic perfusion holder for PH01 element to fix the perfusion cannula and connect the perfusion system to the amplifier's ground |
Neuroexplorer | Nex Technologies | Software for data analysis; info@neuroexplorer.com | |
Peristaltic pump (drive unit) | Gilson | F155001 | 0,01 to 48 rp |
Peristaltic pump (pump head) | Gilson | F117800 | R2 two channel |
Ultrasonic aspirator | Integra Life sciences, USA | Cusa Excel + | It allows blunt subpial dissection of the cortex |
Neuronavigation | Isis Solutions, France | Surgiscope | It allows real time identification of the brain structure on the preoperative MRI |
Vibratome HM 650 V | Microm | Block slicing into 400 μm thick slices |