En fremgangsmåte for å undersøke kapasiteten av en alkohol forbundet miljøsammenheng for å utløse fornyelse av alkohol-søkende adferd hos rotter, er beskrevet.
Miljø sammenhenger der narkotika av misbruk er fortært kan utløse craving, en subjektiv Pavlovian-betinget reaksjon som kan legge til rette for narkotika-søkende atferd og rask tilbakefall i rusfrie narkotikabrukere. Vi har utviklet en prosedyre for å studere de atferdsmessige og nevrale prosesser som formidler virkningen av sammenheng på alkohol-søkende atferd hos rotter. Etter akklimatisering til smak og farmakologiske effekter av 15% etanol i hjemmet buret, mannlige Long-Evans rotter får Pavlovian diskriminering trening (PDT) i condition kamre. I hvert daglig (man-fre) PDT økt, 16 forsøk hver av to stimuli annerledes 10 sek auditiv klimaanlegg oppstå. I løpet av en stimulans, CS +, 0,2 ml av 15% etanol, overført i en fluidport for oralt inntak. Den andre stimulus, den CS-, er ikke koblet sammen med etanol. Tvers sesjoner, oppføringer i fluidport under CS + økning, mens innlegg under CS- stabilisere seg på et lavere nivå, som indikerer at en Predictive assosiasjon mellom CS + og etanol er ervervet. Under PDT hvert kammer er utstyrt med en bestemt konfigurasjon av visuelle, olfactory og taktile stimuli kontekstuelle. Etter PDT, er utryddelse treningen utføres i samme kammer som nå er utstyrt med en annen konfigurasjon av kontekstuelle stimuli. CS + og CS- presenteres som før, men etanol er holdt tilbake, noe som fører til en gradvis nedgang i havne innlegg under CS +. Ved test, blir rottene plassert tilbake i PDT sammenheng og presentert med CS + og CS- som før, men uten etanol. Dette manipulasjon utløser en robust og selektiv økning i antall havne oppføringer gjort i løpet av alkohol prediktiv CS +, med ingen endring i å svare i løpet av CS-. Denne effekten, referert til som forbindelse-indusert fornyelse, illustrerer den kraftige kapasiteten sammenhenger forbundet med alkohol for å stimulere alkohol økende oppførsel som reaksjon på Pavlovian alkohol signaler.
Resterende edru er en betydelig utfordring for personer som lider av alkoholmisbruk lidelser. Avholdenhet er en tid med sårbarhet for de atferdsmessige, psykologiske og fysiologiske effekten av miljømessige stimuli som rutinemessig følger alkoholbruk, som kan, gjennom Pavlovian condition, blir assosiert med beruselse 1,2. Eksponering for alkohol prediktive signaler kan lokke fram betingede responser som alkohol craving, som kan fremme alkohol søker atferd som letter tilbakefall 3,4.
De stereotype sekvenser av atferd som fører til alkoholforbruk kan føre til visse typer stimuli som skal rutinemessig oppleves umiddelbart før de farmakologiske effektene av alkoholinntak. For eksempel, syn, lukt og smak av alkohol er sensoriske egenskaper av alkohol som pålitelig forut rus. I tillegg til slike signaler, som er referert til som 'diskret' eller 'Proximal 'signaler, miljø sammenhenger der narkotika brukes regelmessig kan også provosere craving 5,6. Eksponering for fysiske steder der narkotika tidligere har vært brukt kan derfor være en kritisk trigger for tilbakefall 7.
Dyremodeller har blitt utviklet for å studere nevrale mekanismer som medierer effekten av narkotika i forbindelse sammenhenger på narkotika-søkende atferd 8-13. Prosedyren beskrevet her åpner for etterforskningen av hvordan sammenhenger knyttet til alkoholforbruk kan modulere alkohol søkende atferd som er utløst av et diskret, alkohol prediktiv Pavlovian stikkordet.
Pavlovian diskriminering treningen foregår i en bestemt miljøsammenheng, hvor rotter er opplært til atferdsmessig skille mellom to auditive klimaanlegg stimuli, en CS + som er sammenkoblet med alkohol, og en CS- som ikke er det. Utryddelse sesjoner blir deretter utført i en annen sammenheng, der svarer til CS+ Avtar som et resultat av alkohol blir tilbakeholdt. Deretter gjenåpning til alkohol forbundet, Pavlovian trening sammenheng utløser en selektiv økning i alkohol-søkende atferd utløst av CS +, med ingen endring i å svare på CS-. Dette resultatet, som vi har konsekvent replikert 9,14-16, strekker funn fra instrument condition prosedyrer der narkotika sammenhenger har blitt funnet å stimulere fornyelse av operante responser i forbindelse med levering av legemidler 10,13.
Resultater fra denne prosedyren viser at diskrete miljømessige stimuli som rutinemessig følger alkohol levering kan skaffe kapasitet til å drive alkohol-søkende atferd. De viser også at kontekstuelle stimuli assosiert med tidligere tilgjengelighet eller fravær av alkohol kan veilede betinget atferdsmessige reaksjoner til diskrete alkohol prediktiv signaler.
Kritiske trinnene i protokollen
Sammenhenger i den foreliggende oppgave innlemme stimuli som er ekstern i forhold til rotte. Imidlertid kan den interoceptive state of the rat ved test også utgjøre en "sammenheng" som kan påvirke fornyelse 20. Det er derfor viktig å tilvenne rotter til alle prosedyrer som kan oppstå før fornyelsen test og endre sine interoceptive tilstand, som intrakranielle microinfusions eller systemiske injeksjoner. Videre bør tilvenning til microinfusions eller systemiske injeksjoner bli gjennomført før både utryddelse og PDT sessions, for å forhindre at slike prosedyrer fra å bli assosiert med en bestemt fase av eksperimentet.
Timelige parametere, slik som CS varighet, CS-US intervall, og intertrial intervall (ITI), har lenge vært kjent for å påvirke betinget reagerer i en rekke condition paradigmer 21-26. Likeledes kan tidsmessige parametere påvirker observasjon av fornyelseseffekten i vår fremgangsmåte. Ethvert sett av andre enn dem som er angitt i protokollen parametere bør eksperimentelt validert i pilotstudier før du fortsetter å bruke disse i større undersøkelser.
Modifikasjoner og feilsøking
Tidligere forskning har funnet at mengden av etanol som rotter forbruker i hjemmet buret kan variere som en funksjon av den leverandøren som rotter er kjøpt 17,27. Leverandør er derfor en viktig faktor for denne fasen av studien. Likeledes bør valget av rotte belastning være considered nøye, da det er mange rapporter om belastningsskader forskjeller i etanolforbruket 28-31.
Før arbeid i en motvilje conditioning paradigmet har vist at utviklings alder av rotter påvirker observasjon av fornyelse av Pavlovian betinget frykt respons 32. Mangelen på en fornyelse effekt i meget unge rotter (yngre enn postnatal dag 20) har blitt foreslått å skyldes nedsatt koding av kontekstuell informasjon 33. Den utviklingsalder rotter som skal brukes i foreliggende fremgangsmåte bør derfor tas i betraktning.
Fornyelse av Pavlovian betinget alkohol-søkende atferd har blitt observert når 10% 9,16, 15% 14, eller 20% 15 etanol løsninger ble brukt under hjemmet buret etanol tilgang og PDT faser av eksperimentet. Forskere kan bruke en hvilken som helst av disse konsentrasjoner av etanol, for det formål å etablere denne prosedyren i sin laboratoritallet.
Under oppkjøpet av Pavlovian diskriminering trening er det viktig å sjekke væske havner etter hver økt for å sikre at all etanol som ble levert har blitt konsumert. Leaving rotter i kondisjoneringskamrene i ytterligere 10 – 15 min etter hver sesjon kan gjøres tidlig i PDT for å oppmuntre til forbruk av en hvilken som helst etanol som ikke er forbrukt i løpet av sesjonen. Antallet rotter forlater unconsumed etanol i havnene bør reduseres som PDT utvikler seg. Hvis det ved utgangen av PDT rotter er enten (a) ikke forbruke all etanol og / eller (b) ikke svarer til CS + da disse fagene skal bli utelatt fra studien. De fleste rotter pålitelig reagerer mer på CS + enn CS-. Imidlertid kan noen rotter svare på et høyt nivå til begge signaler, og dermed ikke viser tegn på diskriminering. Rotter som har høy grad svarer til både CS + og CS- løpet PDT er ikke tatt ut av studien. Vår erfaring er disse fagene viser bemerkelsesverdig diskrimineringunder den første utryddelse økt i fravær av etanol, noe som tyder på at deres høye nivåer av å reagere på CS- under PDT blir drevet av nærvær av etanol i fluidporten. Disse fagene har også en tendens til å vise robuste fornyelses effekter.
Begrensninger ved prosedyren
Fordi fornyelsen prøven utføres i fravær av etanol, betinget port oppføringer fremkalt av CS + gradvis avta over testsesjon. Derfor er den totale mengde av virkemåten genereres ved testen, mot hvilken eksperimentelt induserte endringer kan bli vurdert, er ganske lav. Fordi i denne oppgaven å reagere en tendens til å være høyere ved begynnelsen versus slutten av testsesjon, er det viktig å undersøke effekten av eksperimentelle manipulasjoner på kondisjonert reagerer på en prøve-til-prøvebasis.
Oppføringer i fluidbeholder gi hoved avhengige tiltak i denne oppgaven. Imidlertid kan en feilaktig port oppføringen være registered hvis et dyr er nær nok til det fluidbeholder for å bryte den infrarøde strålen på tvers av åpningen av væskeport med sine værhår. Mens sjeldne, feilaktige svar er opplagt som en dramatisk økning i total port oppføringer i forhold til motivets adferd på tidligere økter. Videoopptak dyrene ville lette påvisning av mulige feilaktige responser, og gir mulighet for en mer raffinert analyse av de virkemåter som frembringes av rottene gjennom trening og testing.
Betydningen av teknikken med hensyn til eksisterende / alternative metoder
Kontekst-indusert fornyelse av narkotika-søkende atferd er i stor grad studert ved hjelp av en instrumental conditioning oppgave der den primære avhengige variabelen er en operant respons, for eksempel en spak trykk 8,34 eller nesen rote 12. I den foreliggende fremgangsmåte, er stoffet økende reaksjon 'betinget tilnærming' til væskeport som er utløst ved hjelp av presentasjoner avCS +. Dette svaret er sannsynligvis ervervet gjennom Pavlovian læring, som er den læringsprosess som formidler dannelsen av assosiasjoner mellom miljømessige stimuli og de farmakologiske effektene av narkotika av misbruk hos mennesker.
Fremtidige søknader
Denne oppgaven kan brukes i kombinasjon med neuropharmacology, optogenetics og neurochemistry å studere nevrale mekanismer som er involvert i kontekst-indusert fornyelse av Pavlovian kondisjonerte alkohol-søkende atferd 16. I tillegg kan atferdsmessige og nevrale mekanismer som regulerer kjøp og utryddelse av Pavlovian kondisjonerte alkohol-søkende atferd undersøkes. Til slutt, kan denne oppgaven brukes til å utforske manipulasjoner av utryddelse som kan hindre fornyelse, en viktig retning for translasjonell forskning rettet mot å redusere virkningen av stoffet assosiert miljømessige sammenhenger på reaktivitet til narkotika prediktive signaler etter cue eksponeringsterapi i menneskelig AddiCTS.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the National Institute on Alcohol Abuse and Alcoholism (RO1 AA014925 awarded to Dr. Patricia H. Janak at University of California, San Francisco, CA, USA), Fonds de recherche du Quebec – Santé (NC) and the Natural Sciences and Engineering Research Council (NC, 387224-2010). The open-access publication of this article was made possible by sponsorship from Med Associates Inc.
Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Heavy-duty utility cart | Rubbermaid | #4520-88 | Used to transport rats in their home cage from the colony room to the behavior room or other facilities |
Rats, Long-Evans | Harlan | – | Rats weighed 220-240g on arrival |
Ohaus scale | Fisher | #S402421 | For weighing rats; tare the bottom of a plastic container first, then put the rat in it to weigh it |
Beta-chips, aspen | Harlan | #7090A | Bedding for home cage |
Nylabone | Bio-Serv | #K3580 | Enrichment provided in the home cage |
Autoclavable rodent chow | Agribrands, Charles River | #5075 | For feeding rats |
Wire bar cage lid | Ancare | #R20SS2B | Custom made with two slots for bottles |
Cage bottom | Ancare | #R20PC | To house rats |
Stoppers | Ancare | #8.5 | Rubber stoppers to occlude opening in water bottles & graduated cylinders; goes with ball point sipper tubes |
Ball point tubes, 1.5" length | Ancare | #TD-99 | Inserted in stoppers, enables rats to drink from water bottles and graduated cylinders |
Water bottles | Ancare | #FSPC8HT | 473 ml (16 oz) capacity, needs to be occluded with stopper |
Graduated cylinders, 100ml | Fisher | #0300741 | To contain ethanol during alcohol exposure in the home cage; spouted end needs to be cut off to enable occlusion with stoppers |
Mettler scale | Mettler Toledo | #MS6001S | For weighing water bottles and ethanol cylinders |
Polyethylene tubing, 1/32" inner diameter, 1/32" wall thickness, 3/32" outside diameter | Fisher | #14-169-1A | To connect 20 ml ethanol syringe to fluid port |
Needle, 18g, 1.5" length | Fisher | #B305199 | To connect polyethylene tubing to ethanol syringes; needs to be filed |
Syringes, 20ml, Luer-Lok non-sterile | Fisher | #1482316J | To contain ethanol on the fluid pumps; needs to be connected to the polyethylene tubing by a 18g 1 1/2 needle |
Syringes, 60ml, Luer-Lok non-sterile | Fisher | #14-820-11 | To flush polyethylene tubing after PDT sessions |
Single speed syringe pump, 3.33 rpm | Med Associates Inc. | #ENV-018MD | To hold 20 ml ethanol syringes and deliver ethanol |
Fluid port | Med Associates Inc. | #ENV-254-CB | To enable ethanol delivery during PDT sessions; connected to ethanol syringes with polyethylene tubing |
Port entry infrared detector | Med Associates Inc. | #ENV-215M | Fixed on both sides of fluid port; need 2 per fluid port |
Houselight, 28V, 100mA | Med Associates Inc. | #ENV-135M | Provides general lighting in conditioning chamber |
Clicker module | Med Associates Inc. | #ENV-225SM | Auditory stimulus for conditioning chamber |
White noise generator with speaker | Med Associates Inc. | #PHM-100 | Auditory stimulus for conditioning chamber |
Bar floor | Med Associates Inc. | #ENV-009A-GF | To go with modular test chamber |
Bench coat, absorbant | VWR | #89126-790 | Absorbant paper to put in metal tray, needs to be cut to fit the metal tray |
Polycarbonate sheet, 1/8" thick, 12-5/8"x10" | Johnston Plastics | #30102515 | To make smooth transparent floor insert used for context 1. Needs to be cut in 11.5"x12.25" pieces |
Aluminium sheet perforated, 0.063"thick, 48"x96", 0.250" holes x 0.375" centers | Anica Steel | – | To make perforated floor insert used for context 2. Needs to be cut in 11.5"x12.25" pieces |
Black cardboard, 0.053" thick, 28"x44" | Omer DeSerres | #P1909 | To construct panels covering the ceiling, door and back wall of the conditioning chamber in context 1. Needs to be cut to size. Each chamber needs three panels measuring approximately 11.5"x13.25". The panels can be joined by the narrower side using duct tape. |
All-purpose strength duct tape, 1.88"x45yd. | Duck Tape | – | Adhesive material to connect the black cardboard panels used to cover the back wall, ceiling and door in context 1. |
Modular test chamber | Med Associates Inc. | #ENV-009A | Conditioning chamber |
Sound attenuating cubicles | Med Associates Inc. | #ENV-200R3AM | Comes with installed 28V DC fan (#ENV-025F) |
Petri dish | Fisher | #08748B | Bottom only, to contain the sprayed solution that provides the odor stimulus; needs to be centered in the metal tray in conditioning chambers |
PCI interface package | Med Associates Inc. | #DIG-700P2-R2 | Connects tabletop interface cabinet to computer; includes 1 interface card, 1 Decode card, 1 ribbon cable and 1 28V DC power cable |
Large tabletop cabinet and power supply | Med Associates Inc. | #SG-6510D | Used to contain the 12 cards included in the SmartCrtrl 8 Input, 16 Output package |
SmartCtrl 8 Input, 16 Output package | Med Associates Inc. | #DIG-716P2 | Used to connect and control the devices in the conditioning chamber. The package includes all the cables, the interface module and the connection panel. |
Med PC IV software | Med Associates Inc. | #SOF-735 | Software to run programs. Needs to be installed on the computer. |
Monitor LG, 19" LCD | Concordia computer store | #W1942TQ-BF | Computer monitor; to go with computer running Med PC IV |
HP Z200 tower workstation | Concordia computer store | #BZ788US#ABA | Computer on which Med PC IV is run |
Benzaldehyde, ≥99% | Les produits chimiques OMEGA Chemical Company Inc. | #B37-50 | Dilute in tap water for almond context odor |
Lemon oil, cold pressed, California | Sigma Aldrich | #W262528-1KG-K | Dilute in tap water for lemon context odor |
Ethyl alcohol, 95% | Commercial Alcohols | – | Dilute in tap water to desired concentration |