Ett förfarande för att studera kapaciteten av en alkohol associerad miljösammanhang att utlösa förnyelse av alkoholsökande beteende hos råttor beskrivs.
Miljö sammanhang där droger av missbruk konsumeras kan utlösa begäret, en subjektiv Pavlovian konditionerade svar som kan underlätta drogsökande beteende och snabba återfall i abstinent missbrukare. Vi har utvecklat en metod för att studera beteendemässiga och neurala processer som förmedlar effekterna av sammanhang alkoholsökande beteende hos råttor. Efter acklimatisering till smaken och farmakologiska effekter av 15% etanol i buren, manliga Long-Evans-råttor får Pavlovian diskriminering utbildning (PDT) i konditionekammare. I varje daglig (mån-fre) PDT session, 16 försök vardera av två olika 10 sek auditiv rade stimuli uppstår. Under ett stimulus, CS +, 0,2 ml 15% etanol avges in i en fluidöppning för oral konsumtion. Den andra stimulus, CS-, inte paras ihop med etanol. Över sessioner, inträden i vätskeporten under CS + ökning, medan poster under CS- stabiliseras på en lägre nivå, vilket indikerar att en Predictive association mellan CS + och etanol förvärvas. Under PDT varje kammare är utrustad med en specifik konfiguration av visuella, lukt och taktila kontextuella stimuli. Efter PDT, är utplåning träning genomföras i samma kammare som nu är försedd med en annan konfiguration av kontextuella stimuli. CS + och CS presenteras som tidigare, men etanol är undanhålls, vilket orsakar en gradvis nedgång i poster hamn under CS +. Vid testet är råttorna placeras tillbaka i PDT sammanhang och presenteras med CS + och CS som tidigare, men utan etanol. Denna manipulation utlöser en robust och selektiv ökning av antalet poster hamn gjorts under alkohol prediktiva CS +, utan någon förändring svara under CS. Denna effekt, som kallas kontext inducerad förnyelse, illustrerar den kraftfulla kapacitet sammanhang i samband med alkoholkonsumtion att stimulera alkoholsökande beteende som svar på Pavlovian alkohol ledtrådar.
Återstående nykter är en stor utmaning med personer som lider av alkoholmissbruk störningar inför. Avhållsamhet är en tid av utsatthet för beteende, psykologiska och fysiologiska effekter miljö stimuli som rutinmässigt följer alkohol, vilket kan, genom Pavlovsk beting, blir i samband med berusning 1,2. Exponering för alkohol prediktiva ledtrådar kan framkalla betingade reaktioner som alkohol begäret, som kan främja alkohol söker beteenden som underlättar återfall 3,4.
De stereotypa sekvenser av beteenden som leder till alkoholkonsumtion kan orsaka vissa typer av stimuli för att rutinmässigt upplevt omedelbart före den farmakologiska effekten av alkoholintag. Till exempel syn, lukt och smak av alkohol är sensoriska egenskaper alkohol som tillförlitligt föregår berusning. Förutom sådana signaler, vilka betecknas som "diskret" eller "proximal 'cues, miljö sammanhang där droger regelbundet används kan också provocera begäret 5,6. Exponering för fysiska platser där droger har tidigare använts kan därför vara en kritisk utlösare för återfall 7.
Djurmodeller har utvecklats för att studera de neurala mekanismer som förmedlar effekterna av narkotika i samband sammanhang på drogsökande beteende 8-13. Det förfarande som beskrivs här gör det möjligt att undersöka hur sammanhang i samband med alkoholkonsumtion kan modulera alkoholsökande beteende som framkallas av en diskret, alkohol prediktiva Pavlovian kö.
Pavlovian diskrimineringsutbildning genomförs på en särskild miljö sammanhang där råttor är utbildade för att beteendemässigt skilja mellan två audirade stimuli, en CS + som är ihopkopplad med alkohol och ett CS som inte är. Extinction sessioner förs sedan i ett annat sammanhang, där svar på CS+ Minskar som ett resultat av alkohol undanhålls. Därefter förnyad exponering för alkohol i samband, Pavlovian utbildnings kontext utlöser en selektiv ökning av alkoholsökande beteende framkallas av CS +, utan någon förändring i att svara på CS. Detta resultat, som vi konsekvent har replik 9,14-16, sträcker fynd från instrumentkonditioneförfaranden där läkemedelssammanhang har visat sig stimulera förnyelse av operanta responser i samband med narkotikaleverans 10,13.
Resultat från detta förfarande visar att diskreta miljö stimuli som rutinmässigt följer alkoholleverans kan förvärva förmågan att köra alkoholsökande beteende. De visar också att kontextuella stimuli i samband med förhands tillgänglighet eller avsaknad av alkohol kan vägleda rade beteende svar på diskreta alkohol prediktiva ledtrådar.
Kritiska steg i protokollet
Sammanhang i nuvarande uppgift införliva stimuli som ligger utanför råttan. Däremot kan interoceptive tillstånd råtta vid testet också utgöra ett "sammanhang" som kan påverka förnyelsen 20. Det är därför viktigt att vänja råttorna till eventuella förfaranden som kan inträffa innan förnyelsetest och ändrar sin interoceptive tillstånd, liksom intrakraniella microinfusions eller systemiska injektioner. Dessutom bör tillvänjning till microinfusions eller systemiska injektioner genomföras före både utrotning och PDT sessions, för att förhindra att sådana förfaranden från att bli förknippad med en specifik fas av försöket.
Temporal parametrar, såsom CS varaktighet, CS-US-intervallet, och intertrial intervall (ITI), har länge varit kända för att påverka rade reagera i en mängd olika konditioneringsparadigm 21-26. På samma sätt kan tidsparametrarna påverka observation av förnyelse effekt i vårt förfarande. Varje uppsättning som inte anges i protokollet parametrar bör experimentellt valideras i pilotstudier innan du fortsätter att använda dem i större utredningar.
Ändringar och felsökning
Tidigare forskning har funnit att mängden etanol som råttor konsumerar i buren kan variera som en funktion av leverantören som råttor köps 17,27. Leverantören är därför en viktig faktor för denna fas av studien. Likaså bör valet av råttstam vara considered noga, eftersom det finns många rapporter om stamskillnader i etanolförbrukning 28-31.
Tidigare arbete i en aversiv konditione paradigm har visat att utvecklingsålder av råttor påverkar observation av förnyelse av en Pavlovsk betingad rädsla svar 32. Avsaknaden av en förnyelse effekt hos mycket unga råttor (yngre än postnatal dag 20) har föreslagits bero på nedsatt kodning av kontextuell information 33. Den utvecklingsålder av råttor som skall användas i föreliggande förfarande bör därför beaktas.
Förnyelse av Pavlovian konditionalkoholsökande beteende har observerats vid 10% 9,16, 15% 14, eller 20% 15 etanollösningar användes under buren etanol åtkomst och PDT faser av försöket. Forskare kan använda någon av dessa koncentrationer av etanol för att fastställa detta förfarande i sin laboratortalet.
Under förvärv av Pavlovian diskriminering träning är det viktigt att kontrollera vätskeportar efter varje session för att säkerställa att all etanol som levererades har förbrukats. Lämnar råttor i kamrarna konditione för ytterligare 10 – 15 min efter varje session kan ske i början av PDT för att uppmuntra konsumtion av något etanol som inte förbrukades under sessionen. Antalet råttor som lämnar oförbrukat etanol i hamnarna bör minska när PDT skrider. Om vid utgången av PDT råttor är antingen (a) inte konsumerar all etanol och / eller (b) som inte svarar på CS + då dessa ämnen skall tas bort från studien. De flesta råttor tillförlitligt svara mer till CS + än CS. Men vissa råttor reagerar på höga nivåer för både ledtrådar och därmed inte visar tecken på diskriminering. Råttor som uppvisar höga svarar på både CS + och CS under PDT är inte bort från studien. Vår erfarenhet är dessa ämnen visar anmärkningsvärd diskrimineringunder den första utsläckningssession i frånvaro av etanol, vilket antyder att de har höga nivåer av att svara på CS- under PDT drivs av närvaro av etanol i vätskeporten. Dessa ämnen tenderar också att visa robusta förnyelseeffekter.
Begränsningar av förfarandet
Eftersom förnyelse provningen utförs i frånvaro av etanol, poster rade hamnframkallas av CS + gradvis minskar över testsessionen. Därför det totala beloppet av beteende som genereras vid test mot vilka experimentellt inducerade förändringar kan bedömas, är ganska låg. För i denna uppgift svarar tenderar att vara högre i början kontra slutet av testsessionen, är det viktigt att undersöka effekterna av experimentella manipulationer på kondition svara på försök-för-försök.
Noteringar i vätskebehållaren ger huvudberoende mått i denna uppgift. Dock kan en felaktig port post vara registrerat om ett djur är tillräckligt nära i vätskebehållaren för att bryta den infraröda strålen tvärs öppningen av fluidöppning med sina morrhår. Även sällsynta, felaktiga svar är självklart som en dramatisk ökning av den totala port poster i förhållande till ämnet beteende på tidigare sessioner. Videotaping djuren skulle underlätta upptäckt av eventuella felaktiga svar, och möjliggöra en mer ingående analys av de beteenden som uppvisas av råttorna i hela träning och testning.
Betydelsen av teknik i förhållande till befintliga / alternativa metoder
Context-inducerad förnyelse av narkotikasökande beteende är till stor del studeras med hjälp av en instrumental conditioning uppgift där den primära beroende variabeln är en operant respons, till exempel som en hävstång press 8,34 eller näsa peta 12. I föreliggande förfarande, är det läkemedel som söker svar "rade strategin" för vätske port som framkallas av presentationer avCS +. Detta är sannolikt förvärvas genom Pavlovian lärande, vilket är inlärningsprocessen som förmedlar bildandet av associationer mellan stimuli från omgivningen och den farmakologiska effekten av droger av missbruk hos människor.
Framtida applikationer
Denna uppgift kan användas i kombination med neurofarmakologi, optogenetik och neurokemi att studera neurala mekanismer som är involverade i sammanhanget-inducerad förnyelse av Pavlovian konditionerade alkoholsökande beteende 16. Dessutom kan beteendemässiga och neurala mekanismer som reglerar förvärv och utrotning av Pavlovian konditionerade alkoholsökande beteende undersökas. Slutligen kan denna uppgift användas för att utforska manipulationer av utrotning som kan förhindra förnyelse, en viktig inriktning för translationell forskning som syftar till att minska effekterna av drogen i samband miljösammanhang på reaktivitet mot narkotika prediktiva ledtrådar efter cue exponeringsterapi i mänsklig ytterlict.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the National Institute on Alcohol Abuse and Alcoholism (RO1 AA014925 awarded to Dr. Patricia H. Janak at University of California, San Francisco, CA, USA), Fonds de recherche du Quebec – Santé (NC) and the Natural Sciences and Engineering Research Council (NC, 387224-2010). The open-access publication of this article was made possible by sponsorship from Med Associates Inc.
Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Heavy-duty utility cart | Rubbermaid | #4520-88 | Used to transport rats in their home cage from the colony room to the behavior room or other facilities |
Rats, Long-Evans | Harlan | – | Rats weighed 220-240g on arrival |
Ohaus scale | Fisher | #S402421 | For weighing rats; tare the bottom of a plastic container first, then put the rat in it to weigh it |
Beta-chips, aspen | Harlan | #7090A | Bedding for home cage |
Nylabone | Bio-Serv | #K3580 | Enrichment provided in the home cage |
Autoclavable rodent chow | Agribrands, Charles River | #5075 | For feeding rats |
Wire bar cage lid | Ancare | #R20SS2B | Custom made with two slots for bottles |
Cage bottom | Ancare | #R20PC | To house rats |
Stoppers | Ancare | #8.5 | Rubber stoppers to occlude opening in water bottles & graduated cylinders; goes with ball point sipper tubes |
Ball point tubes, 1.5" length | Ancare | #TD-99 | Inserted in stoppers, enables rats to drink from water bottles and graduated cylinders |
Water bottles | Ancare | #FSPC8HT | 473 ml (16 oz) capacity, needs to be occluded with stopper |
Graduated cylinders, 100ml | Fisher | #0300741 | To contain ethanol during alcohol exposure in the home cage; spouted end needs to be cut off to enable occlusion with stoppers |
Mettler scale | Mettler Toledo | #MS6001S | For weighing water bottles and ethanol cylinders |
Polyethylene tubing, 1/32" inner diameter, 1/32" wall thickness, 3/32" outside diameter | Fisher | #14-169-1A | To connect 20 ml ethanol syringe to fluid port |
Needle, 18g, 1.5" length | Fisher | #B305199 | To connect polyethylene tubing to ethanol syringes; needs to be filed |
Syringes, 20ml, Luer-Lok non-sterile | Fisher | #1482316J | To contain ethanol on the fluid pumps; needs to be connected to the polyethylene tubing by a 18g 1 1/2 needle |
Syringes, 60ml, Luer-Lok non-sterile | Fisher | #14-820-11 | To flush polyethylene tubing after PDT sessions |
Single speed syringe pump, 3.33 rpm | Med Associates Inc. | #ENV-018MD | To hold 20 ml ethanol syringes and deliver ethanol |
Fluid port | Med Associates Inc. | #ENV-254-CB | To enable ethanol delivery during PDT sessions; connected to ethanol syringes with polyethylene tubing |
Port entry infrared detector | Med Associates Inc. | #ENV-215M | Fixed on both sides of fluid port; need 2 per fluid port |
Houselight, 28V, 100mA | Med Associates Inc. | #ENV-135M | Provides general lighting in conditioning chamber |
Clicker module | Med Associates Inc. | #ENV-225SM | Auditory stimulus for conditioning chamber |
White noise generator with speaker | Med Associates Inc. | #PHM-100 | Auditory stimulus for conditioning chamber |
Bar floor | Med Associates Inc. | #ENV-009A-GF | To go with modular test chamber |
Bench coat, absorbant | VWR | #89126-790 | Absorbant paper to put in metal tray, needs to be cut to fit the metal tray |
Polycarbonate sheet, 1/8" thick, 12-5/8"x10" | Johnston Plastics | #30102515 | To make smooth transparent floor insert used for context 1. Needs to be cut in 11.5"x12.25" pieces |
Aluminium sheet perforated, 0.063"thick, 48"x96", 0.250" holes x 0.375" centers | Anica Steel | – | To make perforated floor insert used for context 2. Needs to be cut in 11.5"x12.25" pieces |
Black cardboard, 0.053" thick, 28"x44" | Omer DeSerres | #P1909 | To construct panels covering the ceiling, door and back wall of the conditioning chamber in context 1. Needs to be cut to size. Each chamber needs three panels measuring approximately 11.5"x13.25". The panels can be joined by the narrower side using duct tape. |
All-purpose strength duct tape, 1.88"x45yd. | Duck Tape | – | Adhesive material to connect the black cardboard panels used to cover the back wall, ceiling and door in context 1. |
Modular test chamber | Med Associates Inc. | #ENV-009A | Conditioning chamber |
Sound attenuating cubicles | Med Associates Inc. | #ENV-200R3AM | Comes with installed 28V DC fan (#ENV-025F) |
Petri dish | Fisher | #08748B | Bottom only, to contain the sprayed solution that provides the odor stimulus; needs to be centered in the metal tray in conditioning chambers |
PCI interface package | Med Associates Inc. | #DIG-700P2-R2 | Connects tabletop interface cabinet to computer; includes 1 interface card, 1 Decode card, 1 ribbon cable and 1 28V DC power cable |
Large tabletop cabinet and power supply | Med Associates Inc. | #SG-6510D | Used to contain the 12 cards included in the SmartCrtrl 8 Input, 16 Output package |
SmartCtrl 8 Input, 16 Output package | Med Associates Inc. | #DIG-716P2 | Used to connect and control the devices in the conditioning chamber. The package includes all the cables, the interface module and the connection panel. |
Med PC IV software | Med Associates Inc. | #SOF-735 | Software to run programs. Needs to be installed on the computer. |
Monitor LG, 19" LCD | Concordia computer store | #W1942TQ-BF | Computer monitor; to go with computer running Med PC IV |
HP Z200 tower workstation | Concordia computer store | #BZ788US#ABA | Computer on which Med PC IV is run |
Benzaldehyde, ≥99% | Les produits chimiques OMEGA Chemical Company Inc. | #B37-50 | Dilute in tap water for almond context odor |
Lemon oil, cold pressed, California | Sigma Aldrich | #W262528-1KG-K | Dilute in tap water for lemon context odor |
Ethyl alcohol, 95% | Commercial Alcohols | – | Dilute in tap water to desired concentration |