Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Ex Vivo טיפול תגובה של גידולים ראשוניים ו / או הקשורים גרורות לפרה קלינית וקליני של Therapeutics

doi: 10.3791/52157 Published: October 2, 2014
* These authors contributed equally

Summary

קווים הוקמו סרטן התאים וxenografts היו עמוד התווך של מחקר הסרטן בעשורים האחרונים. עם זאת, הראיות האחרונות עולה כי תגובה לטיפול מושפעת במידה רבה על ידי מייקרו-סביבת התאים הסרטניים. לכן, פיתחנו ניתוח vivo לשעבר של דגימות גידול ראשוניות למטרות פיתוח תרופות.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

פיתוח תרופות לסרטן יעילים הוכיח להיות מאוד מאתגר. קווי סרטן תאים וexplants גידול - כמו גם xenografts היו בשימוש במחקר סרטן ליותר ממחצית המאה 1,2,3. עד כה, הניתוח המולקולרי של רגישות לסמים והתנגדות בשתי שורות תאי הסרטן הוקמו וxenografts המופק מחולה (PDX) הוא הכרחי. עם זאת, הבדיקה של תרכובות בשורות תאי הסרטן שהוקמו לא לעתים קרובות חזויה של יעילות in vivo, ומקביל במחקרי vivo בבעלי חיים, במיוחד בדגמי PDX, זה מאוד יקר וגוזל זמן. המגבלות של מערכות מודל אלה, כלומר חוסר היכולת להודיע ​​על ההשפעה של microenvironment הילידים בהתקדמות גידול ותגובה לאסטרטגיות טיפוליות, הובילו את תחום המחקר לפיתוח שיטות נוספות כדי לשבח ניתוחים אלו. של אחרונים, תשומת לב מוגברת משלמת לכיוון ניתוח vivo לשעבר של קיבת חולהאו explants 4, 5 בשל ההבנה הגדולה יותר שתגובה לטיפול בסרטן אינה בלעדית להרכב המולקולרי הגלום של תאי סרטן, אלא מושפעת במידה רבה על ידי מייקרו-סביבת התאים הסרטניים 6, 7 תכונה שלא יכול להיות סכם על ידי שיטות culturing מסורתיות ו / או PDX. ניתוח Ex vivo בהקשר הנ"ל (כלומר., השפעה של microenvironment תאים הסרטני המקיף הסמוך) מרמזת הערכת סעיפים גידול / גרורות עיקריות קיימא, ולא ניתוח vivo לשעבר של בידודים סלולריים 8, 9.

אנו מדווחים כאן על טכניקת vivo לשעבר (כלומר., קטעים שנחתך בדייקנות טריות רקמה) של שני גידולים הראשוניים המטופל וגרורות קשורות (כלומר, בלוטות לימפה) שנאמנות מודיעה על תגובה (IC50), השפעות מחוץ היעד ומאפשר מולקולריים ניתוח של מנגנוני התנגדות ומשוב. בנוסף, ניתוח מתאם של therapeרגישות / התנגדות utic לעומת פרופיל ביטוי סמן ביולוגי והגנטי יכולה להתבצע במאמץ לזהות חולי סיכוי גבוה יותר להגיב לתרופה הניסיונית של עניין (כלומר., תגובת סמים גבוהה תואמת מטופל עם פרופיל ביולוגי מסוים). יישום של טכניקת vivo לשעבר והערכה באופנה רב פרמטר הוא תנועה לכיוון בחירת מטופלים ושיפור כללי של תוצאות קליניות.

Ex vivo ניתוח תגובה לטיפול יכול להיות כלי סטנדרטי בפיתוח הקליני ופרה קליני של תרופות לסרטן והוא חזה כצעד לקראת גישת רפואה מותאמת אישית באסטרטגיות פיתוח טיפוליות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

הערה: רכש רקמות חולה הוסמך באמצעות מועצה לביקורת מוסדית (IRB) -approved Biospecimen ופרוטוקולים קליניים (מספרי פרוטוקול 09-121 ו11-041, בהתאמה) בשעה Memorial Sloan Kettering Cancer Center.

רכש .1 רקמות

  1. רכש של גידול / גרורות ראשוניות מטופל
    הערה: נכון להיום, בפרוטוקול זה בוצע על סוגים הוסרו בניתוח בלבלב, קיבה וסרטן השד, כמו גם, גרורות לימפומה.
    1. כוון את צוות כירורגי כדי לספק את הדגימה על ידי מערכת צינור פנאומטי שליח או למחלקה לפתולוגיה בשקית דגימת פלסטיק דליפת הוכחה בחוזקה אטומה וסטרילי בתוך מיכל הוכחה לשפוך סטרילי. כוון את צוות כירורגי להעביר את הדגימה במדינה הטרי ללא פורמלין או מקבע.
    2. כוון את עוזר פתולוג או פתולוג לקצור את הדגימה הטרי באמצעות טכניקה סטרילית, שincשימוש לרכב של כפפות ומכשירים סטריליים תחת הזרימה למינרית.
    3. רשום את זמן הקציר של דגימת הרכש, אשר נשמרה בקפדנות תחת 30 דקות מסיום ההליך הכירורגי. אם ניקח בחשבון את ההשפעות של איסכמיה הקרה, לא לוקח דגימות מדגימות שעברו כריתה עם זמן איסכמי קר של> 30 דקות 18.
    4. כוון את אנשי פתולוגיה המחלקה כדי להסיר דגימת גידול ראשונית של כ 0.5 סנטימטר 3-1.0 סנטימטר 3 בזרימה למינרית לשמור על סביבת סטרילית. במידת האפשר, לבחור רקמת גידול מהפריפריה של נגע המדד, כדי למנוע נמק מרכזי (מוות של תאים) פרנק פוטנציאלי.
      הערה: רקמת נימקי עשויה להיות מוכרת באופן בוטה על ידי כל אחד מהקריטריונים הבאים: אובדן צבע או החיוורון של הרקמות; איבוד כוח שברקמות נמקית היא רכות ופריכה; תיחום ברור בין הרקמות נמקית ובת קיימא.
    5. כוון את pathologist או עוזר פתולוג כדי לספק רקמות היקפיים שהיא ב( קלפים שנזרקו כירורגית) עודפים לאחר דגימה מיידית של הגידול להערכת אבחון. הנח את הדגימה בצינור צנטריפוגות חרוטי 15 מ"ל סטרילי המכיל כ 5 מ"ל של תקשורת המינימלית חיונית (MEM) המכילה אנטיביוטיקה (1% פניצילין וסטרפטומיצין).
    6. אם זמין (לדוגמא, בלוטות לימפה בבית השחי של זנב של דגימת כריתת שד), להשיג דגימת בלוטות לימפה קשורה בעליל חיובית באותו הגודל (0.5 סנטימטר 3-1.0 סנטימטר 3) ולהשוות לתגובת תרופה של גידול ראשוני. כמו דגימת הגידול הראשונית, למקם את הדגימה הקשורים הבלוטה לימפה בצינור צנטריפוגות חרוטי 15 מ"ל סטרילי המכילה כ 5 מ"ל של מינימום תקשורת חיונית (MEM) המכילה אנטיביוטיקה (1% פניצילין וסטרפטומיצין).
    7. אם גודל של היתרים כירורגית דגימה (לדוגמא, דגימת כריתת שד), להסיר (רחוקה מגידול ראשוני) דגימה של רקמה נורמלית (כלומר,parenchyma נורמלי צפוף / סיבי שד) ומקום בצינור צנטריפוגות חרוטי 15 מ"ל סטרילי המכיל כ 5 מ"ל של תקשורת המינימלית חיונית (MEM) המכילה אנטיביוטיקה 1% למטרות העברה בלבד. בעקבות העברה למתקני המעבדה, להעביר את הדגימה 'הנורמלית' להקפאת cryovial, "הצמד" וחנות במקפיא -80 מעלות צלזיוס לניתוחים מולקולריים עתיד.
    8. מניחים את כל הדגימות על קרח רטוב, ומייד להעביר למרחב המעבדה לחתך רקמה הטרי ex vivo. אל סעיף הדגימה הנורמלית אלא לאחסן במקפיא -80 מעלות צלזיוס לניתוחים מולקולריים עתיד. להעביר חלק מהגידול הראשוני וגרורות קשורות להקפאת cryovial, "הצמד" וחנות במקפיא -80 מעלות צלזיוס לניתוחים מולקולריים עתיד.
  2. רכש של רקמה ממחקרים קליניים (למשל, ביופסיות מחט ליבה אופציונלית (CNB))
    הערה: אנו משיגים רקמות גידול מחוליםנרשם על פרוטוקולים קליניים שנותנים את הסכמתם לעבור CNB של גרורות סרטנית נגישות לפני התחלת טיפול. CNBs, עד היום, בוצעו על חולים עם שד, לימפומה האזור שולית, לימפומה תא מעטפת, paraganglioma גרורתי, צוואר רחם (תאי קשקש) וסרטן השחלות.
    1. כ 5 מ"ל של תקשורת המינימלית חיונית (MEM) המכילה אנטיביוטיקה (1% פניצילין וסטרפטומיצין) יש אנשים קליניים מהתערבותית רדיולוגיה או מחלקה רלוונטית לבצע ביופסיה מחט ליבת טיפול מראש ומניחים את הדגימה ב15 מ"ל צינור צנטריפוגות חרוטי סטרילית המכילים.
    2. הנח את דגימת הביופסיה על קרח רטוב, ומייד להעביר למרחב המעבדה לחתך רקמה הטרי ex vivo.

2 הכנת חומרים להגדרות חתך וVibratome

  1. הכנת חומרים לחתך
    1. בצע פתרון agarose 4% על ידי הוספת 4 גרם של האגאעלה לשל PBS 100 מ"ל. החיטוי (הגדרות מחזור: נוזל, 121 מעלות צלזיוס, 30 דקות, 15 ק"ג לסנטימטר רבוע) הפתרון לפני השימוש ראשון. לשימושים שלאחר מכן, הנח את agarose 4% במיקרוגל לנזל (חום גבוה במשך 30 מרווחי שניות) לפני כל שימוש ולקרר כראוי ל~ 25 ° C (כלומר, חם למגע) מודעת כי agarose מתמצק ב RT.
    2. השתמש agarose 4% כאמצעי תקשורת רקמות הטבעה שאינה קבוע. כאשר agarose 4% יתקרר, והוא עדיין במצב נוזלי, עם מלקחיים סטריליות למקם את דגימת הרקמה בעובש הטבעה ויוצקים בagarose 4%.
    3. מקם את דגימת הרקמה הקרובה (~ מרחק 2 מ"מ), אך לא באופן ישיר על הקיר של עובש הטבעת משטח חיתוך. Agarose 4% יתחיל לגבש במהירות, ולכן כראוי למקם את דגימת הרקמה במהירות. במהלך חתך, לשמור agarose 4% באמבט המים C ° 55 לשמור בפתרון.
    4. לצלחת 24 גם לניתוח סעיף, להוסיף 1 מ"ל of מדיה מלאה (כלומר, אנטיביוטיקה סרום + 1% MEM + 10% שור עוברי) זה טוב. שמור את צלחת 24 גם ב RT (~ 25 ° C) בכל משך הזמן של חתך.
  2. הכנת הגדרות Vibratome
    1. באמצעות microtome הרוטט, להגדיר את המהירות שבה להב גישות הדגימה [0 (0.00 מ"מ / השנייה) ל10 (2.5 מ"מ / שנייה)] ואת התדירות של (Hz 0) להב [0 עד 10 (100 הרץ) ]. התאם את ההגדרות בהתאם למרקם של הרקמה (כלומר, צפיפות / מוצקות).
    2. לגידול שד ראשוני של קרצינומה ductal פולשנית, להתאים את הגדרות ל6 ו -3, מהירות ותדירות בהתאמה. לרקמת גידול פחות צפופה / חברה, להקטין את המהירות ולהגדיל את התדירות בהתאם.
    3. הגדר את עובי הסעיף בגבולות המכשיר (1-999 מיקרומטר). לניתוחים אלו, להגדיר את עובי הסעיף ב200 מיקרומטר.
    4. הר הדגימה מוטבע agarose באמצעות שכבה דקה של דבק נוזלי על tha דיסק הדגימהt הוא טבל במאגר של תקשורת, כי הוא עטוף בקרח רטוב.

.3 רקמות חתך, טיפול וניתוח

  1. הסר את החלקים שנחתך בדייקנות מייד עם חתך באמצעות מלקחיים ומקום סטרילי בצלחת רב גם עם 1 מ"ל של מדיה מלאה. כאשר חלקים מספיקים נרכשים לתגובה וניתוחים גומלים, למקם את הצלחת רב גם לתגובה לטיפול בתרבית רקמת חממה נקבעה בתנאי culturing הרקמה סטנדרטיים.
  2. קח את סעיפי שליטה מרובים שbookend הסעיפים שטופלו במאמץ כדי לאשר תגובה תלוית מינון בניגוד לממצאים בתרבית. לבצע רקמת חתך במהירות (~ 30 - 40 דקות), גם בתוך כל השפעות מזיקות של זמן איסכמי הקר (~ 2 - 4 שעות) 18. בצע טיפול בחלקים רק לאחר תקופת הסתגלות לשעה 1.
  3. לאחר תקופת הסתגלות 1 שעות, להוסיף הגדלת מינון (רלוונטי טיפולי;
  4. בעקבות טיפול, להסיר את כל הסעיפים בתנאים סטריליים ופורמלין לתקן על ידי הצבת קטע הרקמה בצינור המכיל גם 10% פורמלין ומקום שנאגרו ב RT O / N או בצינור המכיל 4% paraformaldehyde (לדלל paraformaldehyde 16% מבקבוקון עם PBS לריכוז סופי של 4%) ומקום בRT עבור שעה 2.
    1. לתקן סעיפי רקמות גדולים יותר (למשל., ~ 6 מ"מ x 4 מ"מ) 200 מיקרומטר עבה ב10% O נאגר פורמלין / N ב RT. לתקן חלקים קטנים יותר (לדוגמא., 1 מ"מ x 1 מ"מ) 200 מיקרומטר עבה בparaformaldehyde 4% עבור שעה 2 ב RT.
      הערה: לחדירה יעילה של מקבע את עוצמת הקול של fixative יש 20x הנפח של רקמה. בהתחשב בכך שתוצאות פרוטוקול זה בגדלים קטנים מאוד רקמות (לדוגמא, 6 מ"מ 3 רקמה = 6 μl נפח), להבטחת שימוש קיבעון הנכון 1 מ"ל של מקבע לכל גדלי הרקמה.
    2. בעקבות קיבעון יש לי דגימות רקמת פרפין מוטבעות על ידי אנשי המחלקה לפתולוגיה. סעיף דגימה בלוקים פרפין על גבי שקופיות טעונות להיות hematoxylin וeosin מוכתם והעריך immunohistochemically (למשל, אפופטוזיס).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

במחקר זה, טכניקת vivo לשעבר הייתה בשימוש בניתוח מתאם של רגישות / התנגדות טיפולית של מעכב חלבון הלם חום 90 (Hsp90i). בהערכה פרה קלינית של Hsp90i זה, גידול הראשוני בסרטן השד, ER + קרצינומה ductal פולשנית (IDC), וגרורות בלוטה לימפה קשורות נותחו vivo לשעבר לתגובה לטיפול   (איור 1). טופלו 200 מיקרומטר קטעי סדרתי מרובה עם רכב בלבד, והגדלת מינון (0.25, 0.50, 1.0 ו2.5 מיקרומטר) של Hsp90i. הנתונים בתרשים 1 מציגים-קבוע פורמלין חלקים, צבעונית משובץ פרפין (FFPE) וhematoxylin & eosin (H & E) לאחר תקופה טיפול 48 שעות. השליטה (הרכב בלבד) סעיף טופל תערוכות קיני IDC קיימא ואילו סעיף הרקמה טופל 2.5 מיקרומטר הביא אינדוקציה 40% מאפופטוזיס כפי שניתן לראות על ידי שינויים מורפולוגיים גרעיניים (כלומר, pyknotic גרעינים / APOPפסולת אפופטוטיים) (איור 1 א). אפופטוזיס אושר נוסף בגידול הראשוני על ידי ניתוח transferase deoxynucleotidyl מסוף תיוג סוף dUTP ניק (TUNEL) (מידע לא מוצג). IC50 מחושב מנתונים תגובה על ידי גרפים אפופטוזיס אחוזים לעומת ריכוז של התרופה. באופן משמעותי, המלווה, Hsp90 ממלא תפקיד מרכזי בייצוב חלבונים והומאוסטזיס של מסלולי איתות קריטיים של תאים נורמלים ותאי סרטן 10. היכולת למקד Hsp90 בסרטן מסתמכת על הממצא שתאים ממאירים תלויים במידה רבה בתפקוד להשגיח של Hsp90, במיוחד במאמץ להתגבר על המדינות הדגישו של סביבות עוינות נתקלו במהלך התקדמות גרורתי. בעיקרו של הדבר, תאי הסרטן להפוך לתלויים במידה רבה על תפקוד Hsp90 וכתוצאה מכך בריכה סלקטיבית למיקוד של Hsp90 'שהעור' 11. בכנס, איור 1 א, lobule השפיר סמוך עם acini ודביק קשורים אליו נותר ללא שינוי in סעיף 2.5 מיקרומטר אותו טופל Hsp90i. למיטב ידיעתנו, זו הפעם הראשונה מסרטן ספציפי Hsp90 זה נתפס מבחינה ויזואלית בHsp90i תגובת הערכה של גידולים ראשוניים וגרורות קשורות. ממצא זה של תאים שפירים ללא שינוי / רגילים כפי שניתן לראות באוניות שפירות סמוכות של IDC (איור 1 א), כמו גם כלי בתוך parenchyma השד השפיר המקיף את הגידול הראשוני וגרורות קשורות בלוטה לימפה (מידע לא מוצג) כבר סכם בכמה שונה סוגי גידולים (למשל, שד, קיבה וגרורות לימפומה).

גרורות בלוטה לימפה המצורפת של גידול ראשוני זה הראתה תגובה מלאה רק בקיני IDC שהיו קשור באופן רופף (איור 1). קיני IDC שנוצרו spheroids ההדוק, עם זאת, נשאר קיימא כפי שאושר על ידי TUNEL (איור 1 ג). ניתוח נוסף של spheroids IDC קיימא על ידי immunofluorescence חשףביטוי מחדש מתמשך או של מולקולת הידבקות תאי תאים, E-cadherin (איור 1 ג). ממצא זה עולה בקנה אחד עם עיקש, על הביטוי של E-cadherin מוסיף ליעילות הפוטנציאלית או גרורתי גרורתי כפי שהיא משתקפת בסרטן הממאיר ביותר, הקטלני השד דלקתי 12, 13. למרות מעניין, ממצא זה הוא מעבר להיקף של מאמר זה. עם זאת, זה משמעותי לציין כי הבלוטה לימפה spheroids (LN) IDC אלה נשמרו בתרבות לתקופה של 2 שבועות ובכך מעניק אמינות לכוחו של שימוש בטכניקה vivo לשעבר ללמוד גם הרגישות / התנגדות בפיתוח תרופות פרה קליני.

טכניקת vivo לשעבר גם כבר מועסק במחקר קליני בביופסיות מחט ליבה (CNBs) ראיות של עיכוב היעד בגידולי 16,17. חולים שיש להם הסכמה, הליך הביופסיה מחט ליבת טיפול מראש (CNB) ביצע (איור 2). השוואהלהערכה פרה הקלינית של גידולים ראשוניים, טכניקת vivo לשעבר משמשת כדי לקבוע רגישות או תגובה בCNB של גרורות נגישות. 200 מיקרומטר סעיפים סידוריים מרובים של CNB טופלו ברכב בלבד ומינונים גוברים (0.25, 0.50, 1.0 ו2.5 מיקרומטר) של Hsp90i. מספר מנות Hsp90i המשמשות בהערכת vivo לשעבר מוכתב על ידי הגודל של CNB. עם זאת, נעשה כל מאמץ כדי להשתמש בספקטרום של מינונים שהוצעו לעיל. כמו ההערכה פרה הקלינית vivo לשעבר, תגובה יכולה להיות מוערכת ומאוחר יותר בהשוואה לבפועל בתגובה מטופל (כלומר, ניתוחים גומלים; איור 2), כפי שנקבע על ידי שלאחר הטיפול CNB הפרמקוקינטי (PK), כלומר, החזקת סמים, כפי שנמדד באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית ספקטרומטריית מסת טנדם (LC-MS / MS) מנתח, כמו גם בתחום ההדמיה PET חולה (איור 2) 16,17. נכון להיום, ניתוחים תוך שימוש בטכניקה vivo לשעבר בג זהמחקר linical שבוצע על סוגי גידולים מרובים (למשל, שד, לימפומה השולית האזור, לימפומה תא מעטפת, paraganglioma גרורתי, צוואר רחם וסרטן השחלות) 16, 17 ניתוח מתאם מלא. יישום טכניקת vivo לשעבר נוסף מדגימה את התועלת של טכניקה זו ב פיתוח תרופות קליני.

איור 1
איור 1 ניתוח תגובת Ex vivo של סרטן השד ER +. (פנל, שמאל) מציג קיני קיימא של קרצינומה ductal פולשנית (IDC) (Hematoxylin וeosin המוכתם; סרגל קנה מידה 100 מיקרומטר). על הטיפול (, פנל מימין) עם 2.5 מיקרומטר של Hsp90i יש אינדוקציה של ~ 40% תגובה אפופטוטיים (גרעיני pyknotic / פסולת אפופטוטיים; חיצים) (Hematoxylin וeosin המוכתם; סרגל קנה מידה 100 מיקרומטר). אוניות שפירים ז> (, להוסיף) יישאר ללא שינוי בעקבות טיפול (Hematoxylin וeosin מוכתם; סרגל קנה מידה 200 מיקרומטר). השליטה של צומת קשורה לימפה (LN) (B, פנל משמאל) מציגה רמה קטנה של אפופטוזיס (Hematoxylin וeosin המוכתם; סרגל 100 מיקרומטר), ואילו הסעיף שטופל (B, לוחות מימין) מראה על שטח של IDC גרורתי קינים עם תגובה מלאה (Hematoxylin וeosin המוכתם; סרגל קנה מידה, בכיוון השעון 2 מ"מ, 300 מיקרומטר, 200 מיקרומטר ו200 מיקרומטר). עם זאת, spheroids IDC ההדוק (Spheroids; Sp) מאותו הסעיף (C, פנל משמאל) מראה מעט, אם בכלל, אפופטוזיס, כפי שמוצג על ידי ניתוח TUNEL נותר קיימא עם נלווה (בסולם בר 200 מיקרומטר) (C, פנל מימין) על פני -expression של E-cadherin (100x הגדלה).> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2 סכמטי של יישום הטכניקה vivo לשעבר במחקר קליני. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

ביולוגים הסרטן מתמודדים עם אתגרים משמעותיים כאשר מנסים לפתח אסטרטגיות טיפוליות יעילות. בדיקת תרופות בפיתוח בשורות תאי הסרטן שהוקמו לא יכולה לשקף באופן מדויק בתגובה vivo ובניסויי vivo על המודלים PDX הן עבודה אינטנסיבית ויקר מאוד. לאור אמור לעיל, היישום של טכניקות vivo לשעבר של מטופל עיקרי גידולים 14, 15 כעת ממוקם ליד הניתוח המולקולרי של שורות תאי הסרטן הוקמו וxenografts המופק מחולה (PDX).

עבודה זו מציגה את היישום של טכניקת vivo לשעבר לגובה חדש שבטכניקה בנאמנות מודיעה על תגובה (IC50), השפעות מחוץ יעד ומאפשרת ניתוח מולקולרי של מנגנוני התנגדות ומשוב. כאשר נתוני תגובה מתואמים לפרופיל המולקולרי של הגידול (כלומר, ביטוי חלבון של סמנים ביולוגיים של גידול, מוטציות) מחקר הגומל (תגובה לעומת mol גידולפרופיל ecular) ניתן להשתמש כדי לבחור חולי סיכוי גבוה יותר להגיב לתרופה מסוימת, במאמץ לשפר את תוצאות מטופל. (הערכה הפרמקוקינטי (PK)) באופן משמעותי ביותר, בפיתוח תרופות קליני (כלומר., ביופסיות אופציונליות), תגובת vivo לשעבר של הטיפול המקדים CNB יכולה להיות מתואמת ל( ומאומתים) בתגובה מטופל (כלומר, לאחר הטיפול CNB) ושמירת סמים 16,17. השימוש בטכניקת vivo לשעבר במחקר קליני זה היה מסוגל לקבוע את תגובת גידול, כמו גם יעד ספציפי לאשר (כלומר, פ"ד; האינדוקציה Hsp70) ולהודיע ​​על מינון ותזמון 16,17.

טכניקת vivo לשעבר ניתנת למרבית הסוגים מוצקים גידול כמו גם גרורות סרטן שמקורן בדם (למשל, גרורות בלוטה לימפה לימפומה) עם שינויים קלים בפרוטוקול לסוגי גידולים מסוימים שמציגים אתגרי קטין. לדוגמא, גידולים של הלבלב נוטים להיות ים גבוהtroma יחס תאים סרטניים, אשר יכול לגרום לחלקים שיש לי ייצוג תאי הסרטן ירוד. רכש של אזורים העשירים של תאים הסרטניים של הגידול לא יכול להתבצע על ניתוח ברוטו. לכן כדי להתגבר על חסרון פוטנציאלי זו אזורי מעוקבים קטנים יותר מרובים מדגימת הגידול יכולים להיות מוטבעים (עובש 4 / הטבעת agarose) ומחולקים בו זמנית להגדיל את ההסתברות של סעיף תא עשיר בגידול vivo לשעבר.

הנתונים שלנו מאוד תומכים בשימוש בטכניקה vivo לשעבר בפיתוח פרה קליני תרופה (איור 1). יחד עם תגובה (IC50), לשכפל את חלקים ניתן לנתח עבור מבחני חלופיים כדאיות, metabolomics, אסטרטגיות טיפוליות קומבינטורית, חשיפה לסמים יש השפעה על גורמים מופרשים (למשל, ציטוקינים, exosomes), מנגנוני התנגדות ומשוב וחשוב מכך, להודיע ​​על מחוץ יעד אפקטים (כלומר, נורמלי ותאים שפירים). במחקר המסוים הזה שמשמש Hsp90i, למקד SPEcificity וזיהוי של 'השפעות מחוץ היעד "הוא מפתח המבוססים על ההנחה שיש בריכה מיוחדת של' Hsp90 שעור 'נמצאה רק בתאים סרטניים על שינוי ממאיר 10. זה מוצג בסעיף התוצאות (להוסיף, איור 1 א) שבו אוניות שפירות של סעיף טופל Hsp90i vivo לשעבר נותרו ללא שינוי. של משמעות שווה, שנמצאה בחלק אחר של אותו הגידול הראשוני באו לידי ביטוי באיור 1, 10 מיקרומטר (מינון טיפולי לא רלוונטי) סעיף שטופל הראה תגובה של קני IDC מלאה ואילו קרצינומה ductal קשורים באתרו (DCIS) נשארה ללא שינוי (מידע לא מוצג) . חקירות עתידיות בקו הזה של מחקר הן מעבר להיקף של מאמר זה. עם זאת, ממצא המסוים הזה מודיע על המצב של "שינוי ממאיר" או התקדמות מחלה של DCIS הקשורים בדגימות IDC, ביחס שבעורHsp90 להשגיח מתפקד ותומך בתועלת של שימוש בטכניקת vivo לשעבר בפיתוח תרופות.

יישום נוסף של טכניקת vivo לשעבר הוא שימוש בניתוח מראש יעילות במודלי xenograft גידול (כלומר., Ex vivo חתך של PDX) בפיתוח תרופות על מנת לקבוע את הפרמקוקינטי / pharmacodynamic נתונים לפני ביצוע מעורב, יקרים (PK / PD) במחקרי vivo - המאפשר ליותר הודיע, חסכוני במחקר יעילות תרופת vivo.

השלבים העיקריים וגורמים מגבילים את הפוטנציאל של טכניקת vivo לשעבר הם רכש וחתך. רכש של דגימת הגידול (כלומר., גידול ראשוני / גרורות) חייב להתבצע בזריזות עם תשומת לב רבה לזיהוי אזור של הגידול בדרגה הגבוהה ביותר של יכולת קיום. גידולים גדולים נוטים להיות אזורים מרכזיים נימקי שאינם גלויים באופן בוטה. לכן, f רקמת רכישהrom השפה החיצונית-ביותר מגדילה הסתברות לקבלת דגימת קיימא. עם כל כבוד לחתך, איסוף פרוסות דיוק בעובי הרצוי (לדוגמא., 200 מיקרומטר) מושפע במידה רבה על ידי צפיפות גידול / מוצקות (לא כולל CNBs בשל הגודל הקטן מאוד). לדוגמא, קרצינומה ductal פולשנית היא בדרך כלל הרבה יותר צפופה בניגוד לקרצינומה אונתית פולשנית. רקמת גידול צפופה מספקת התנגדות מתאימה - בהעדר תקשורת הטבעה קבע - אל הלהב, ואילו רקמת גידול צפופה פחות לא. דוגמאות לסוגי רקמת גידול פחות צפופים כוללות, אך אינם מוגבלות לקרצינומה חודרנית אונתית, קרצינומות mucinous וסוגי הקיבה גידול. כדי להתגבר על מגבלה פוטנציאלית זו, נדרשת במהירות להב מתאימה ותדירות ירי-צרות. עובי חתך פרוס דיוק עקבי, לאורך כל תהליך חתך, הוא קריטי להערכה מדויקת של תגובת תרופה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Vibratome Leica VT1000s Leica 14047235613
UltraPure agarose Invitrogen 16500500 Prepare 4% and 6% before use
Injector blade Ted Pella 121-4
MEM with Penicillin  + Streptomycin Media Core Facilities (MSKCC) The media is prepared at Memorial Sloan Kettering Cancer Center 
Scalpel no. 10 Thermo Scientific 31-200-32
Disposable forceps Cole-Parmer 84011182
Embedding mold Electron Microscopy Science 70181
FBS (heat inactivated) Gemini 100106
24 well plates Corning 3524
Formalin (10%) Sigma Diagnostics SDHT501128 
16% Formaldehyde solution Thermo Scientific 28908
Embedding microsettes Simport M503-2
Ethanol (70%) Fisher Scientific A405P-4
Waterbath Fisher Scientific 15-462-2SQ
Microwave General Electric ModelJES2051DNBB
Adhesive (Ethyl Cyanoacrylate) Sigma-Aldrich E1505-5G
10 mm dishes BD Falcon 353003
15 ml tubes BD Falcon 352096

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Abercrombie, M., Ambrose, E. J. Interference Microscope Studies of Cell Contacts in Tissue Culture. Experimental Cell Research. 15, (58), 332-345 (1958).
  2. Coriell, L. L., McAllister, R. M., Wagner, B. M. Criteria for Determining Malignancy in Tissue-Culture Cell Lines in the Albino Rat. New York Academy of Science. 5, 351-355 (1957).
  3. Paul, J. The Cancer Cell in Vitro: A Review. Cancer Research. 22, 431-440 (1962).
  4. Dean, J. L., et al. Therapeutic response to CDK4/6 inhibition in breast cancer defined by ex vivo analysis of human tumors. Cell Cycle. 11, (14), 2756-2761 (2012).
  5. Bray, K., et al. Bcl-2 Modulation to Activate Apoptosis in Prostate Cancer. Molecular Cancer Research. 7, (9), 1487-1496 (2009).
  6. Quail, D. F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis. Nature Medicine. 19, (11), 1423-1437 (2013).
  7. Nakasone, E. S., et al. Imaging Tumor-Stroma Interactions during Chemotherapy Reveals Contributions of the Microenvironment to Resistance. Cancer Cell. 21, 488-503 (1016).
  8. Shi, Y., Hogue, J., Dixit, D., Koh, J., Olson, J. A. Functional and genetic studies of isolated cells from parathyroid tumors reveal the complex pathogenesis of parathyroid neoplasia. PNAS. 111, (8), 3092-3097 (2014).
  9. Vidal, S. J., et al. Isolation of cancer stem cells from human prostate cancer samples. J. Vis. Exp. (85), e51332 (2014).
  10. Wanping, X., Neckers, L. Targeting the Molecular Chaperone Heat Shock Protein 90 Provides a Multifaceted Effect on Diverse Cell Signaling of Cancer Cells. Clinical Cancer Research. 13, 1625-1629 (2007).
  11. Moulick, K., et al. Affinity-based proteomics reveal cancer-specific networks coordinated by Hsp90. Nature Chemical Biology. 7, (11), 818-826 (1038).
  12. Alpaugh, M. L., Tomlinson, J. S., Ye, Y., Barsky, S. H. Relationship of sialyl-Lewis(x/a) underexpression and E-cadherin overexpression in the lymphovascular embolus of inflammatory breast cancer. American Journal of Pathology. 161, (2), 619-628 (2002).
  13. Chu, K., Boley, K. M., Moraes, R., Barsky, S. H., Robertson, F. M. The paradox of E-cadherin: role in response to hypoxia in the tumor microenvironment and regulation of energy metabolism. Oncotarget. 4, (3), 446-462 (2013).
  14. Vaira, V., et al. Preclinical model of organotypic culture for pharmacodynamic profiling of human tumors. PNAS. 107, (18), 8352-8356 (2010).
  15. Centenera, M. M., Raj, G. V., Knudsen, K. E., Tilley, W. D., Butler, L. M. Ex vivo culture of human prostate tissue and drug development. Nature Reviews Urology. 10, 483-487 (2013).
  16. Jhaveri, K., et al. Heat shock protein 90 inhibitors in the treatment of cancer: current status and future directions. Expert Opinion on Investigational Drugs. 5, 611-628 (2014).
  17. Gerecitano, J. F., et al. Using 124-PU-H71PET imaging to predict intratumoral concentration in patients on a phase I trial of PU-H71. Journal of Clinical Oncology. 31, Suppl . 11076-11 (2013).
  18. Yildiz-Aktas, I., Dabbs, D. J., Bhargava, R. The effect of cold ischemic time on the immunohistochemical evaluation of estrogen receptor, progesterone receptor, and HER2 expression in invasive breast carcinoma. Modern Pathology. 25, 1098-1105 (2012).
<em>Ex Vivo</em> טיפול תגובה של גידולים ראשוניים ו / או הקשורים גרורות לפרה קלינית וקליני של Therapeutics
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Corben, A. D., Uddin, M. M., Crawford, B., Farooq, M., Modi, S., Gerecitano, J., Chiosis, G., Alpaugh, M. L. Ex Vivo Treatment Response of Primary Tumors and/or Associated Metastases for Preclinical and Clinical Development of Therapeutics. J. Vis. Exp. (92), e52157, doi:10.3791/52157 (2014).More

Corben, A. D., Uddin, M. M., Crawford, B., Farooq, M., Modi, S., Gerecitano, J., Chiosis, G., Alpaugh, M. L. Ex Vivo Treatment Response of Primary Tumors and/or Associated Metastases for Preclinical and Clinical Development of Therapeutics. J. Vis. Exp. (92), e52157, doi:10.3791/52157 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter