Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

प्राथमिक ट्यूमर और / या पूर्व नैदानिक ​​के लिए एसोसिएटेड Metastases और चिकित्सा के नैदानिक ​​विकास के पूर्व vivo उपचार की प्रतिक्रिया

doi: 10.3791/52157 Published: October 2, 2014
* These authors contributed equally

Summary

स्थापित कैंसर कोशिका लाइनों और xenografts पिछले कई दशकों के लिए कैंसर अनुसंधान का मुख्य आधार रहा है. हालांकि, हाल ही में सबूत चिकित्सीय प्रतिक्रिया बहुत ट्यूमर सेल microenvironment से प्रभावित होता है कि पता चलता है. इसलिए, हम दवा के विकास उद्देश्यों के लिए प्राथमिक ट्यूमर नमूनों की एक पूर्व vivo विश्लेषण विकसित किया है.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

प्रभावोत्पादक कैंसर चिकित्सा विज्ञान का विकास बेहद चुनौतीपूर्ण साबित हो गया है. कैंसर कोशिका लाइनों और ट्यूमर explants - और साथ ही xenografts आधे से अधिक एक सदी 1,2,3 के लिए कैंसर अनुसंधान में इस्तेमाल किया गया है. तिथि करने के लिए, दवा संवेदनशीलता और प्रतिरोध दोनों स्थापित कैंसर कोशिका लाइनों में और रोगी व्युत्पन्न xenografts की आणविक विश्लेषण (PDX) अपरिहार्य है. हालांकि, स्थापित कैंसर कोशिका लाइनों में यौगिकों का परीक्षण अक्सर इन विवो प्रभावकारिता के भविष्य कहनेवाला नहीं है, और विशेष रूप से PDX मॉडल में, पशुओं में vivo अध्ययन में इसी बहुत महंगा है और समय लेने वाली है. इन मॉडल प्रणाली, ट्यूमर प्रगति और चिकित्सीय रणनीतियों के जवाब में देशी microenvironment के प्रभाव पर सूचित करने के लिए अर्थात् अक्षमता की सीमाओं, इन विश्लेषण तारीफ करने के लिए अतिरिक्त तरीकों को विकसित करने के लिए अनुसंधान क्षेत्र का नेतृत्व किया है. हाल ही की, बढ़ ध्यान रोगी Tum के पूर्व vivo विश्लेषण की दिशा में भुगतान किया जा रहा हैकैंसर चिकित्सीय प्रतिक्रिया कैंसर कोशिकाओं के अंतर्निहित आणविक संरचना को विशेष नहीं है बल्कि बहुत पारंपरिक संवर्धन तरीकों और द्वारा recapitulated नहीं किया जा सकता है कि ट्यूमर सेल microenvironment 6, 7 एक फीचर से प्रभावित है कि कारण अधिक से अधिक समझने के लिए या explants 4, 5 / या PDX. उपरोक्त संदर्भ में पूर्व vivo विश्लेषण (यानी., आसन्न आसपास के ट्यूमर सेल microenvironment के प्रभाव) बल्कि सेलुलर वियोजन 8, 9 की पूर्व vivo विश्लेषण से, व्यवहार्य प्राथमिक ट्यूमर / मेटास्टेसिस वर्गों के आकलन निकलता है.

हम दोनों रोगी प्राथमिक ट्यूमर के (, सटीक कटा हुआ ताजा ऊतक वर्गों यानी.) और जुड़े मेटास्टेसिस (यानी, लिम्फ नोड्स) ईमानदारी से प्रतिक्रिया पर बताते हैं कि (IC50), बंद लक्ष्य प्रभाव एक पूर्व vivo तकनीक पर यहाँ रिपोर्ट और आणविक के लिए अनुमति देता है प्रतिरोध और प्रतिक्रिया तंत्र का विश्लेषण. Therape के साथ ही, एक correlative विश्लेषणbiomarker और जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल बनाम utic संवेदनशीलता / प्रतिरोध (यानी., उच्च दवा प्रतिक्रिया विशेष जैविक प्रोफाइल के साथ रोगी से मेल खाता है) ब्याज की प्रयोगात्मक दवा के लिए प्रतिक्रिया करने के लिए और अधिक होने की संभावना रोगियों की पहचान करने के प्रयास में किया जा सकता है. एक मल्टी पैरामीटर फैशन में पूर्व vivo तकनीक और मूल्यांकन के आवेदन रोगी चयन और नैदानिक ​​परिणामों के समग्र सुधार की दिशा में आंदोलन है.

पूर्व vivo उपचार प्रतिक्रिया विश्लेषण कैंसर चिकित्सा विज्ञान की preclinical और नैदानिक ​​विकास में एक मानक उपकरण बन सकता है और चिकित्सीय विकास रणनीतियों में एक व्यक्तिगत चिकित्सा दृष्टिकोण की दिशा में एक कदम के रूप में कल्पना की है.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

नोट: रोगी ऊतक खरीद संस्थागत समीक्षा बोर्ड (आईआरबी) के माध्यम से अधिकृत किया गया मेमोरियल स्लोन केटरिंग कैंसर सेंटर में biospecimen और नैदानिक ​​प्रोटोकॉल (प्रोटोकॉल संख्या क्रमश: 09-121 और 11-041,) -approved.

1 ऊतक खरीद

  1. रोगी प्राथमिक ट्यूमर / मेटास्टेसिस की खरीद
    नोट: तिथि करने के लिए, इस प्रोटोकॉल शल्य चिकित्सा द्वारा हटा अग्नाशय, गैस्ट्रिक और स्तन ट्यूमर के प्रकार, और साथ ही, लिंफोमा मेटास्टेसिस पर प्रदर्शन किया गया है.
    1. बाँझ फैल प्रूफ कंटेनर के भीतर कसकर मोहरबंद और बाँझ रिसाव प्रूफ प्लास्टिक नमूना बैग में पैथोलॉजी विभाग के लिए कूरियर या वायवीय ट्यूब सिस्टम द्वारा नमूना देने के लिए सर्जिकल टीम प्रत्यक्ष. कोई formalin या लगानेवाला के साथ नए सिरे से राज्य में नमूना परिवहन के लिए सर्जिकल टीम प्रत्यक्ष.
    2. जो कांग्रेस, बाँझ तकनीक का उपयोग करते हुए ताजा नमूना फसल के लिए पैथोलॉजिस्ट या रोगविज्ञानी सहायक प्रत्यक्षएक लामिना का प्रवाह हुड के तहत बाँझ दस्ताने और उपकरणों की ludes उपयोग.
    3. शल्य चिकित्सा की प्रक्रिया के पूरा होने से 30 मिनट के तहत कड़ाई से रखा है जो खरीद नमूना, की कटाई समय रिकॉर्ड. ठंड ischemia के विचार प्रभाव में ले रहा है,> 30 मिनट 18 की ठंड इस्कीमिक समय के साथ resected नमूनों से नमूने लेने के लिए नहीं है.
    4. एक बाँझ वातावरण बनाए रखने के लिए एक लामिना का प्रवाह हुड में 1.0 सेमी 3 करने के लिए लगभग 0.5 सेमी 3 के एक प्राथमिक ट्यूमर नमूना दूर करने के पैथोलॉजी विभाग के कर्मियों को निर्देशित. जब संभव हो, संभावित खुलकर केंद्रीय परिगलन (कोशिका मृत्यु) से बचने के लिए सूचकांक घाव की परिधि से ट्यूमर के ऊतक का चयन करें.
      नोट: परिगलित ऊतक निम्नलिखित मानदंडों में से किसी ने निहायत पहचानने योग्य हो सकता है: रंग या ऊतक के paleness के नुकसान; परिगलित ऊतक नरम और नाज़ुक है जिसमें ताकत का नुकसान; परिगलित और व्यवहार्य ऊतक के बीच एक स्पष्ट सीमांकन.
    5. Pathologi प्रत्यक्षसेंट या रोगविज्ञानी सहायक नैदानिक ​​मूल्यांकन के लिए ट्यूमर की तत्काल नमूने के बाद अतिरिक्त (शल्य त्यागें) में है कि परिधीय ऊतक प्रदान करने के लिए. लगभग 5 मिलीलीटर 1% एंटीबायोटिक दवाओं (पेनिसिलिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन) युक्त न्यूनतम आवश्यक मीडिया (सदस्य) की युक्त एक 15 मिलीलीटर बाँझ शंक्वाकार अपकेंद्रित्र ट्यूब में नमूना रखें.
    6. उपलब्ध (उदाहरण के लिए, स्तन नमूना की कक्षा पूंछ के लिम्फ नोड), एक ही आकार (0.5 सेमी 3 सेमी 3 से 1.0) के एक निहायत सकारात्मक जुड़े लिम्फ नोड नमूना खरीद और प्राथमिक ट्यूमर की दवा प्रतिक्रिया से तुलना करें तो. प्राथमिक ट्यूमर नमूना तरह, 1% एंटीबायोटिक दवाओं (पेनिसिलिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन) युक्त लगभग 5 मिलीलीटर न्यूनतम आवश्यक मीडिया (सदस्य) की युक्त एक 15 मिलीलीटर बाँझ शंक्वाकार अपकेंद्रित्र ट्यूब में जुड़े लिम्फ नोड नमूना जगह है.
    7. यदि यानी शल्य नमूना परमिट (जैसे, स्तन नमूना), (प्राथमिक ट्यूमर से दूर) को हटाने सामान्य ऊतक का एक नमूना (के आकार,लगभग 5 एमएल हस्तांतरण उद्देश्यों के लिए ही 1% एंटीबायोटिक दवाओं युक्त न्यूनतम आवश्यक मीडिया (सदस्य) की युक्त एक 15 मिलीलीटर बाँझ शंक्वाकार अपकेंद्रित्र ट्यूब में सामान्य घने / रेशेदार स्तन पैरेन्काइमा) और जगह. प्रयोगशाला की सुविधा के लिए स्थानांतरण के बाद, एक में एक cryovial, 'तस्वीर' फ्रीज और स्टोर करने के लिए 'सामान्य' नमूना हस्तांतरण -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर भविष्य आणविक विश्लेषण के लिए.
    8. गीला बर्फ पर सभी नमूनों प्लेस और तुरंत पूर्व vivo ताजा ऊतक सेक्शनिंग के लिए प्रयोगशाला अंतरिक्ष के लिए परिवहन. नहीं अनुभाग सामान्य नमूना करो बल्कि भविष्य आणविक विश्लेषण के लिए डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में एक -80 की दुकान. भविष्य आणविक विश्लेषण के लिए एक -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में एक cryovial, 'तस्वीर' फ्रीज और स्टोर करने के लिए एक प्राथमिक ट्यूमर का हिस्सा है और जुड़े मेटास्टेसिस स्थानांतरण.
  2. नैदानिक ​​अध्ययन से ऊतक की अधिप्राप्ति (जैसे, वैकल्पिक कोर सुई बायोप्सी (CNB))
    नोट: हम रोगियों से ट्यूमर ऊतकों प्राप्तचिकित्सा के शुरू करने से पहले एक सुलभ ट्यूमर मेटास्टेसिस की एक CNB से गुजरना उनकी सहमति दे जो नैदानिक ​​प्रोटोकॉल पर दाखिला लिया. CNBs, आज तक, स्तन, सीमांत क्षेत्र लिंफोमा, मेंटल सेल लिंफोमा, मेटास्टैटिक paraganglioma, गर्भाशय ग्रीवा (स्क्वैमस सेल) और डिम्बग्रंथि के कैंसर के साथ रोगियों पर प्रदर्शन किया गया है.
    1. Interventional रेडियोलोजी या प्रासंगिक विभाग से नैदानिक ​​कर्मियों युक्त बाँझ शंक्वाकार अपकेंद्रित्र ट्यूब एक पूर्व उपचार कोर सुई बायोप्सी प्रदर्शन और एक 15 मिलीलीटर में नमूना जगह है लगभग 5 मिलीलीटर 1% एंटीबायोटिक दवाओं (पेनिसिलिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन) युक्त न्यूनतम आवश्यक मीडिया (सदस्य) के.
    2. गीला बर्फ पर बायोप्सी नमूना प्लेस और तुरंत पूर्व vivo ताजा ऊतक सेक्शनिंग के लिए प्रयोगशाला अंतरिक्ष के लिए परिवहन.

सेक्शनिंग और Vibratome सेटिंग्स के लिए सामग्री की 2. तैयारी

  1. सेक्शनिंग के लिए सामग्री की तैयारी
    1. आगा की 4 जी जोड़कर एक 4% agarose समाधान करेंपीबीएस के 100 मिलीलीटर तक पहुंचे. आटोक्लेव (चक्र सेटिंग्स: तरल, 121 डिग्री सेल्सियस, 30 मिनट, वर्ग इंच प्रति 15 पाउंड) पहला प्रयोग से पहले समाधान. बाद के उपयोग के लिए, agarose आरटी पर solidifies कि ध्यान में रखना प्रत्येक उपयोग करने से पहले (30 सेकंड के अंतराल के लिए उच्च गर्मी) दव्र और उचित ~ 25 डिग्री सेल्सियस (यानी, गर्म स्पर्श करने के लिए) को शांत करने के लिए एक माइक्रोवेव में 4% agarose जगह है.
    2. एक गैर स्थायी ऊतक एम्बेड मीडिया के रूप में 4% agarose का प्रयोग करें. 4% agarose पर्याप्त ठंडा और बाँझ संदंश एक एम्बेड मोल्ड में ऊतक नमूना जगह और 4% agarose में डालना के साथ, एक तरल अवस्था में अभी भी है जब.
    3. एम्बेड मोल्ड के काटने की सतह दीवार पर सीधे ऊतक करीब नमूना (~ 2 मिमी दूरी) नहीं, बल्कि स्थिति. 4% agarose, जल्दी जमना शुरू हो इसलिए उचित जल्दी ऊतक नमूना स्थिति जाएगा. सेक्शनिंग के दौरान, समाधान में रखने के लिए एक 55 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में 4% agarose रखना.
    4. खंड के विश्लेषण के लिए एक 24 अच्छी तरह से थाली करने के लिए, 1 मिलीलीटर हे जोड़ेंप्रत्येक अच्छी तरह से च पूरा मीडिया (यानी, सदस्य + 10% भ्रूण गोजातीय सीरम + 1% एंटीबायोटिक दवाओं). सेक्शनिंग की अवधि में आर टी (~ 25 डिग्री सेल्सियस) पर 24 अच्छी तरह से थाली रखें.
  2. Vibratome सेटिंग्स की तैयारी
    1. हिल सूक्ष्म का प्रयोग, 10 को ब्लेड नमूना दृष्टिकोण जिस गति [10 (2.5 मिमी / सेकंड) 0 (0.00 मिमी / सेकंड)] और ब्लेड [0 (0 हर्ट्ज) की आवृत्ति सेट (100 हर्ट्ज) ]. ऊतक (यानी, घनत्व / दृढ़ता) की बनावट के अनुसार सेटिंग्स समायोजित करें.
    2. आक्रामक ductal कार्सिनोमा के एक प्राथमिक स्तन ट्यूमर के लिए क्रमश: 6 और 3, गति और आवृत्ति के लिए सेटिंग्स समायोजित करें. कम घना / फर्म ट्यूमर के ऊतक के लिए, गति कम होती है और तदनुसार आवृत्ति में वृद्धि.
    3. (- 999 माइक्रोन 1) साधन सीमा के भीतर खंड मोटाई निर्धारित करें. इन विश्लेषण के लिए, 200 मीटर में खंड मोटाई निर्धारित किया है.
    4. नमूना डिस्क था पर तरल चिपकने वाला की एक पतली परत का उपयोग agarose एम्बेडेड नमूना माउंटटी गीला बर्फ में encased है कि मीडिया के एक जलाशय में पानी में डुबोया जाता है.

3 ऊतक सेक्शनिंग, उपचार एवं विश्लेषण

  1. तुरंत पूरा मीडिया के 1 मिलीलीटर के साथ एक बहु अच्छी तरह से थाली में बाँझ संदंश और जगह का उपयोग कर सेक्शनिंग पर सटीक कटा वर्गों निकालें. पर्याप्त वर्गों प्रतिक्रिया और correlative विश्लेषण के लिए अधिग्रहीत कर रहे हैं, मानक ऊतक संवर्धन की स्थिति पर सेट एक टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में उपचार प्रतिक्रिया के लिए बहु अच्छी तरह से थाली जगह है.
  2. सुसंस्कृत कलाकृतियों के लिए विरोध के रूप में खुराक पर निर्भर प्रतिक्रिया की पुष्टि करने के प्रयास में इलाज वर्गों bookend कि कई नियंत्रण वर्गों लो. (- 4 घंटा ~ 2) 18 अच्छी तरह से ठंड इस्कीमिक समय के किसी भी हानिकारक प्रभावों के भीतर, - (40 मिनट ~ 30) ऊतक तेजी सेक्शनिंग प्रदर्शन करना. केवल एक 1 घंटा दशानुकूलन अवधि निम्न वर्गों का उपचार करते हैं.
  3. 1 घंटा दशानुकूलन अवधि के बाद, खुराक (उपचारात्मक प्रासंगिक बढ़ती जोड़ने;
  4. उपचार के बाद, आर टी ओ में 10% बफर formalin और जगह या तो युक्त ट्यूब में ऊतक खंड रखकर बाँझ शर्तों और formalin तय तहत सभी वर्गों को हटाने / एन या 4% paraformaldehyde युक्त ट्यूब में (एक शीशी से 16% paraformaldehyde पतला 2 घंटे के लिए आरटी पर एक अंतिम 4% की एकाग्रता) और जगह के लिए पीबीएस के साथ.
    1. बड़ा ऊतक वर्गों फिक्स (जैसे., ~ 6 मिमी x 4 मिमी) 10% बफर formalin हे में 200 माइक्रोन मोटी / आरटी पर एन. छोटे वर्गों फिक्स (जैसे., 1 मिमी x 1 मिमी) आरटी पर 2 घंटे के लिए 4% paraformaldehyde में 200 माइक्रोन मोटी.
      नोट: लगानेवाला च की मात्रा के कुशल प्रवेश के लिएixative ऊतक की मात्रा 20x किया जाना चाहिए. यह देखते हुए कि उचित निर्धारण उपयोग सभी ऊतक आकार के लिए लगानेवाला के 1 मिलीलीटर के आश्वासन के लिए अत्यंत छोटे ऊतक आकार (जैसे, 6 मिमी 3 ऊतक = 6 μl मात्रा), में इस प्रोटोकॉल का परिणाम है.
    2. निर्धारण के बाद ऊतक नमूनों पैथोलॉजी विभाग के कर्मियों द्वारा एम्बेडेड आयल है. आरोप लगाया स्लाइड पर तेल ब्लॉक नमूना धारा hematoxylin और दाग eosin और मूल्यांकन immunohistochemically (जैसे, apoptosis) हो.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

इस अध्ययन के लिए, पूर्व vivo तकनीक एक गर्मी झटका प्रोटीन 90 अवरोध करनेवाला (Hsp90i) के चिकित्सीय संवेदनशीलता / प्रतिरोध की एक correlative विश्लेषण में इस्तेमाल किया गया था. इस Hsp90i, स्तन कैंसर प्राथमिक ट्यूमर, एक ईआर + आक्रामक ductal कार्सिनोमा (आईडीसी), और संबंधित लिम्फ नोड मेटास्टेसिस के एक पूर्व नैदानिक ​​मूल्यांकन में उपचार प्रतिक्रिया के लिए पूर्व vivo विश्लेषण किया गया   (चित्रा 1). एकाधिक 200 माइक्रोन धारावाहिक वर्गों Hsp90i के वाहन ही और बढ़ती खुराक (0.25, 0.50, 1.0 और 2.5 माइक्रोन) के साथ इलाज किया गया. चित्रा 1 में डेटा formalin तय एक 48 घंटा उपचार अवधि के बाद, आयल एम्बेडेड (FFPE) और hematoxylin और eosin (एच एंड ई) दाग वर्गों का प्रतिनिधित्व करता है. परमाणु morphological परिवर्तन के रूप में देखा 2.5 माइक्रोन इलाज ऊतक खंड apoptosis के एक 40% प्रेरण में हुई जबकि इलाज खंड नियंत्रण (केवल वाहन) व्यवहार्य आईडीसी घोंसले से पता चलता है (यानी, pyknotic नाभिक / APOPtotic मलबे) (चित्रा 1 ए). Apoptosis आगे टर्मिनल deoxynucleotidyl ट्रांस्फ़्रेज़ dUTP निक अंत लेबलिंग (TUNEL) विश्लेषण द्वारा प्राथमिक ट्यूमर में पुष्टि की गई (नहीं दिखाया डेटा). IC50 दवा की एकाग्रता बनाम प्रतिशत apoptosis रेखांकन से प्रतिक्रिया डेटा से गणना की है. गौरतलब है कि निगरानी, ​​Hsp90 सामान्य और कैंसर की कोशिकाओं को 10 दोनों के महत्वपूर्ण संकेत दे रास्ते के प्रोटीन स्थिरीकरण और homeostasis में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है. कैंसर में Hsp90 को लक्षित करने की क्षमता घातक कोशिकाओं भारी खासकर मेटास्टैटिक प्रगति के दौरान सामना दुर्गम वातावरण की जोर देकर राज्यों पर काबू पाने के प्रयास में, Hsp90 की chaperoning समारोह पर निर्भर है कि खोजने पर निर्भर करता है. संक्षेप में, कैंसर की कोशिकाओं को 'oncogenic' Hsp90 11 के लक्ष्य चयनात्मक पूल में जिसके परिणामस्वरूप Hsp90 समारोह पर अत्यधिक निर्भर हो जाते हैं. डालने में, चित्रा 1 ए, जुड़े acini और वाहिनी के साथ आसन्न सौम्य लोब्यूल अनछुए मैं रहताn एक ही 2.5 माइक्रोन Hsp90i इलाज अनुभाग. हमारे ज्ञान करने के लिए, यह इस Hsp90 कैंसर विशिष्टता नेत्रहीन प्राथमिक ट्यूमर और जुड़े मेटास्टेसिस के Hsp90i प्रतिक्रिया आकलन में कब्जा कर लिया है पहली बार है. लिम्फ नोड मेटास्टेसिस प्राथमिक ट्यूमर के आसपास के सौम्य स्तन पैरेन्काइमा भीतर आईडीसी (चित्रा 1 ए) के रूप में जहाजों के आसन्न सौम्य lobules में देखा और जुड़े ही अनछुए सौम्य / सामान्य कोशिकाओं का यह निष्कर्ष (नहीं दिखाया डेटा) कई अलग में recapitulated किया गया है ट्यूमर प्रकार (जैसे, स्तन, गैस्ट्रिक और लिंफोमा मेटास्टेसिस).

इस प्राथमिक ट्यूमर का एक साथ लिम्फ नोड मेटास्टेसिस ही शिथिल जुड़े थे कि आईडीसी घोंसले (चित्रा 1 बी) में एक पूर्ण प्रतिक्रिया देखी गई. TUNEL (चित्रा 1C) द्वारा की पुष्टि के रूप में तंग spheroids, तथापि, व्यवहार्य बने गठन कि आईडीसी घोंसले. पता चला immunofluorescence से व्यवहार्य आईडीसी spheroids की अतिरिक्त विश्लेषणसेल सेल आसंजन अणु, ई cadherin के लगातार या फिर अभिव्यक्ति (चित्रा 1C). यह निष्कर्ष के अनुरूप है लगातार, अधिक अभिव्यक्ति अत्यधिक घातक, घातक भड़काऊ स्तन कैंसर 12, 13 के रूप में परिलक्षित मेटास्टैटिक संभावित या मेटास्टैटिक दक्षता को जोड़ने ई cadherin की. दिलचस्प हालांकि, यह निष्कर्ष इस पत्र के दायरे से बाहर है. हालांकि, यह इन लिम्फ नोड (एल.एन.) आईडीसी spheroids 2 सप्ताह की अवधि के लिए संस्कृति में बनाए रखा गया है कि नोट करने के लिए महत्वपूर्ण है और इस प्रकार पूर्व नैदानिक ​​दवा के विकास में दोनों संवेदनशीलता / प्रतिरोध का अध्ययन करने के पूर्व vivo तकनीक का उपयोग करने की शक्ति को बल देती है.

पूर्व vivo तकनीक भी ट्यूमर 16,17 में लक्ष्य निषेध के सबूत के लिए कोर सुई बायोप्सी (CNBs) पर एक नैदानिक ​​अध्ययन में नियोजित किया गया है. एक पूर्व उपचार कोर सुई बायोप्सी (CNB) प्रक्रिया का प्रदर्शन (चित्रा 2) है जो सहमति, रोगियों. तुलनीयप्राथमिक ट्यूमर के preclinical आकलन करने के लिए, पूर्व vivo तकनीक सुलभ मेटास्टेसिस के CNB में संवेदनशीलता या प्रतिक्रिया का निर्धारण करने के लिए प्रयोग किया जाता है. CNB के एकाधिक 200 माइक्रोन धारावाहिक वर्गों वाहन केवल और Hsp90i की बढ़ती खुराक (0.25, 0.50, 1.0 और 2.5 माइक्रोन) के साथ इलाज किया गया. पूर्व vivo मूल्यांकन में इस्तेमाल किया Hsp90i खुराक की संख्या CNB के आकार से निर्धारित होता है. हालांकि, हर प्रयास ऊपर का सुझाव दिया खुराक के स्पेक्ट्रम का उपयोग करने के लिए किया जाता है. Preclinical पूर्व vivo मूल्यांकन की तरह, प्रतिक्रिया रोगी प्रतिक्रिया में वास्तविक की तुलना में बाद में मूल्यांकन किया और किया जा सकता है (यानी, correlative विश्लेषण, चित्रा 2) के बाद इलाज CNB फार्माकोकाइनेटिक (पी) द्वारा निर्धारित रूप में, यानी, तरल क्रोमैटोग्राफी के माध्यम के रूप में मापा दवा प्रतिधारण मिलकर मास स्पेक्ट्रोमेट्री (नियंत्रण रेखा एमएस / एमएस) रोगी पीईटी इमेजिंग (चित्रा 2) 16,17 में के रूप में अच्छी तरह से विश्लेषण करती है. तिथि करने के लिए, इस सी में पूर्व vivo तकनीक का उपयोग करते हुए विश्लेषणlinical अध्ययन कई ट्यूमर प्रकार (जैसे, स्तन, सीमांत क्षेत्र लिंफोमा, मेंटल सेल लिंफोमा, मेटास्टैटिक paraganglioma, गर्भाशय ग्रीवा और डिम्बग्रंथि के कैंसर) 16, आगे पूर्व vivo तकनीक को लागू 17. पूर्ण correlative विश्लेषण इस तकनीक की उपयोगिता में एक मिसाल है पर प्रदर्शन किया गया है नैदानिक ​​दवा के विकास.

चित्रा 1
एक ईआर + स्तन कैंसर की संख्या 1 पूर्व vivo प्रतिक्रिया विश्लेषण. (; पैमाने बार 100 माइक्रोन Hematoxylin और दाग eosin) (ए, बाएं पैनल) आक्रामक ductal कार्सिनोमा (आईडीसी) की व्यवहार्य घोंसले को प्रदर्शित करता है. (दाग hematoxylin और eosin; पैमाने बार 100 माइक्रोन); Hsp90i के 2.5 माइक्रोन के साथ उपचार (ए, सही पैनल) पर एक 40% apoptotic प्रतिक्रिया ~ की प्रेरण (तीर pyknotic नाभिक / apoptotic मलबे) है. सौम्य lobules जी> (ए, डालने) इलाज के बाद अनछुए रहना (Hematoxylin और दाग eosin; पैमाने बार 200 माइक्रोन). (; पैमाने बार 100 माइक्रोन hematoxylin और eosin दाग), इलाज खंड जबकि (बी, सही पैनल) मेटास्टैटिक आईडीसी के एक क्षेत्र को दिखाने के एक संबद्ध लिम्फ नोड (एल.एन.) (बी, बाएं पैनल) के नियंत्रण apoptosis के एक छोटे स्तर को प्रदर्शित करता है पूरा प्रतिक्रिया के साथ घोंसले (hematoxylin और eosin दाग; पैमाने पर पट्टी, दक्षिणावर्त 2 मिमी, 300 माइक्रोन, 200 माइक्रोन और 200 माइक्रोन). हालांकि, तंग आईडीसी spheroids; TUNEL के विश्लेषण द्वारा दिखाया के रूप में एक ही अनुभाग से (Spheroids सपा) (सी, बाएं पैनल) एक सहवर्ती (पैमाने बार 200 माइक्रोन) (सी, सही पैनल) से अधिक के साथ व्यवहार्य शेष, यदि कोई हो, apoptosis छोटी दिखाने ई cadherin (बढ़ाई 100x) के -expression.> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 2
चित्रा एक नैदानिक ​​अध्ययन में पूर्व vivo तकनीक के कार्यान्वयन के 2 योजनाबद्ध. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

प्रभावोत्पादक चिकित्सकीय रणनीति विकसित करने का प्रयास करते कैंसर जीव महत्वपूर्ण चुनौतियों का सामना. स्थापित कैंसर सेल तर्ज पर विकास में दवाओं का परीक्षण सही ढंग से विवो प्रतिक्रिया में और PDX मॉडल पर विवो प्रयोगों में श्रम गहन और बहुत महंगे हैं प्रतिबिंबित नहीं कर सकते हैं. ऊपर देखते हुए प्राथमिक रोगी के पूर्व vivo तकनीक के आवेदन 15 अब स्थापित कैंसर कोशिका लाइनों और रोगी व्युत्पन्न xenografts (PDX) की आणविक विश्लेषण के बगल में तैनात है, 14 ट्यूमर.

इस पत्र में तकनीक ईमानदारी से प्रतिक्रिया पर (IC50) बताते हैं कि एक नई ऊंचाई तक, बंद लक्ष्य प्रभाव पूर्व vivo तकनीक के आवेदन लेता है और प्रतिरोध और प्रतिक्रिया तंत्र की आणविक विश्लेषण के लिए अनुमति देता है. प्रतिक्रिया डेटा ट्यूमर आणविक प्रोफ़ाइल में ट्यूमर मोल बनाम (यानी, प्रोटीन ट्यूमर बायोमार्कर की अभिव्यक्ति, म्यूटेशन) correlative अध्ययन (प्रतिक्रिया सहसंबद्ध है जबecular प्रोफाइल) रोगी परिणामों में सुधार करने के प्रयास में, एक विशेष दवा के लिए प्रतिक्रिया करने के लिए और अधिक होने की संभावना रोगियों का चयन किया जा सकता है. सबसे महत्वपूर्ण, नैदानिक ​​दवा के विकास (यानी., वैकल्पिक बायोप्सी) में, pretreatment CNB के पूर्व vivo प्रतिक्रिया रोगी जवाब में करने के लिए सहसंबद्ध (और मान्य) किया जा सकता है (यानी, बाद के उपचार CNB) और दवा प्रतिधारण (फार्माकोकाइनेटिक (पी) मूल्यांकन) 16,17. (; Hsp70 प्रेरण यानी, पीडी) और खुराक और 16,17 का समय निर्धारण पर सूचित इस नैदानिक ​​अध्ययन में पूर्व vivo तकनीक का उपयोग ट्यूमर प्रतिक्रिया के रूप में अच्छी तरह से पुष्टि लक्ष्य विशिष्टता का निर्धारण करने में सक्षम था.

पूर्व vivo तकनीक सबसे ठोस ट्यूमर प्रकार के लिए उत्तरदायी है और साथ ही रक्त जनित कैंसर मेटास्टेसिस है (उदाहरण के लिए, लिंफोमा के लिम्फ नोड मेटास्टेसिस) नाबालिग चुनौतियों मौजूद है कि कुछ ट्यूमर प्रकार के लिए प्रोटोकॉल में मामूली समायोजन के साथ. उदाहरण के लिए, अग्न्याशय के ट्यूमर एक उच्च s हो जाते हैंगरीब कैंसर सेल प्रतिनिधित्व किया है कि वर्गों में परिणाम कर सकते हैं जो ट्यूमर सेल अनुपात, को Troma. ट्यूमर का कैंसर सेल समृद्ध क्षेत्रों की खरीद सकल विश्लेषण पर नहीं बनाया जा सकता. इसलिए ट्यूमर नमूना से कई छोटे घन क्षेत्रों (4 / agarose-embedding मोल्ड) एम्बेडेड और एक ट्यूमर कोशिका युक्त पूर्व vivo खंड की संभावना बढ़ती जा रही एक साथ sectioned किया जा सकता है इस संभावित कमी दूर करने के लिए.

हमारे डेटा जोरदार preclinical दवा के विकास (चित्रा 1) में पूर्व vivo तकनीक के उपयोग का समर्थन. प्रतिक्रिया (IC50) के साथ साथ, वर्गों प्रभाव दवा जोखिम secreted कारकों (जैसे, साइटोकिन्स, exosomes), प्रतिरोध और प्रतिक्रिया तंत्र और महत्वपूर्ण बात पर है वैकल्पिक व्यवहार्यता assays, Metabolomics, मिश्रित चिकित्सीय रणनीतियों, के लिए विश्लेषण किया जा सकता दोहराने, बंद लक्ष्य पर सूचित प्रभाव (यानी, सामान्य और सौम्य कोशिकाओं). एक Hsp90i प्रयोग किया जाता है कि इस विशेष अध्ययन में विशेष को लक्ष्यcificity और 'बंद लक्ष्य प्रभाव' की पहचान कुंजी ही घातक परिवर्तन 10 पर कैंसर की कोशिकाओं में पाया 'oncogenic Hsp90' की एक विशिष्ट पूल है कि इस तथ्य पर आधारित है. यह एक पूर्व vivo Hsp90i इलाज खंड की सौम्य lobules अनछुए रह गए, जहां परिणामों खंड (डालने, चित्रा 1 ए) में प्रस्तुत किया है. सीटू (DCIS) में जुड़े ductal कार्सिनोमा (नहीं दिखाया डेटा) अनछुए रह गए, जबकि चित्रा 1 में परिलक्षित एक ही प्राथमिक ट्यूमर के दूसरे खंड में पाया बराबर महत्व के, एक 10 माइक्रोन (उपचारात्मक अप्रासंगिक खुराक) इलाज खंड आईडीसी घोंसले की पूरी प्रतिक्रिया से पता चला . अनुसंधान के इस लाइन में भविष्य जांच इस पत्र के दायरे से बाहर हैं. हालांकि, इस विशेष खोज oncogenic के संबंध में 'घातक परिवर्तन' या आईडीसी नमूनों में जुड़े DCIS के रोग प्रगति, की स्थिति पर बताते हैंHsp90 कामकाज और नशीली दवाओं के विकास में पूर्व vivo तकनीक का उपयोग कर की उपयोगिता का समर्थन करता है chaperoning.

पूर्व vivo तकनीक का एक अतिरिक्त आवेदन ट्यूमर xenograft मॉडल में पूर्व प्रभावकारिता विश्लेषण में उपयोग (यानी., पूर्व vivo PDX की सेक्शनिंग) दवा के विकास में फार्माकोकाइनेटिक / pharmacodynamic (पी / पीडी) शामिल प्रदर्शन करने से पहले, महंगा डेटा निर्धारित करने के लिए है vivo अध्ययन में - के लिए अनुमति देता है एक अधिक सूचित, लागत प्रभावी विवो दवा प्रभावकारिता अध्ययन में.

महत्वपूर्ण कदम और पूर्व vivo तकनीक की क्षमता सीमित कारकों खरीद और सेक्शनिंग हैं. ट्यूमर नमूना की खरीद (यानी., प्राथमिक ट्यूमर / मेटास्टेसिस) व्यवहार्यता का भरपूर साथ ट्यूमर के एक क्षेत्र की पहचान करने के लिए करीब ध्यान के साथ तेजी से किया जाना चाहिए. बड़े ट्यूमर निहायत दिखाई नहीं हैं कि परिगलित केंद्रीय क्षेत्रों के लिए करते हैं. इसलिए, खरीद ऊतक चROM सबसे बाहरी रिम एक व्यवहार्य नमूना प्राप्त करने की संभावना बढ़ जाती है. , सेक्शनिंग इच्छित मोटाई पर सटीक स्लाइस एकत्रित करने के लिए सम्मान के साथ (जैसे., 200 माइक्रोन) बहुत (कारण अत्यंत छोटे आकार के CNBs छोड़कर) ट्यूमर घनत्व / दृढ़ता से प्रभावित है. उदाहरण के लिए, आक्रामक ductal कार्सिनोमा आम तौर पर आक्रामक lobular कार्सिनोमा के विपरीत ज्यादा सघन है. घने ट्यूमर के ऊतक उचित प्रतिरोध प्रदान करता है - स्थायी एम्बेड मीडिया की अनुपस्थिति में - ब्लेड के लिए, कम सघन ट्यूमर के ऊतक नहीं करता है जबकि. कम घने ट्यूमर के ऊतक प्रकार के उदाहरण में शामिल हैं लेकिन आक्रामक lobular कार्सिनोमा, mucinous कार्सिनोमा और गैस्ट्रिक ट्यूमर प्रकार तक सीमित नहीं हैं. इस संभावित सीमा को पार करने के लिए, मुसीबत शूटिंग उपयुक्त ब्लेड गति और आवृत्ति के साथ आवश्यक है. लगातार सटीक कटा खंड मोटाई, सेक्शनिंग प्रक्रिया के दौरान, दवा प्रतिक्रिया का सटीक आकलन के लिए महत्वपूर्ण है.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Vibratome Leica VT1000s Leica 14047235613
UltraPure agarose Invitrogen 16500500 Prepare 4% and 6% before use
Injector blade Ted Pella 121-4
MEM with Penicillin  + Streptomycin Media Core Facilities (MSKCC) The media is prepared at Memorial Sloan Kettering Cancer Center 
Scalpel no. 10 Thermo Scientific 31-200-32
Disposable forceps Cole-Parmer 84011182
Embedding mold Electron Microscopy Science 70181
FBS (heat inactivated) Gemini 100106
24 well plates Corning 3524
Formalin (10%) Sigma Diagnostics SDHT501128 
16% Formaldehyde solution Thermo Scientific 28908
Embedding microsettes Simport M503-2
Ethanol (70%) Fisher Scientific A405P-4
Waterbath Fisher Scientific 15-462-2SQ
Microwave General Electric ModelJES2051DNBB
Adhesive (Ethyl Cyanoacrylate) Sigma-Aldrich E1505-5G
10 mm dishes BD Falcon 353003
15 ml tubes BD Falcon 352096

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Abercrombie, M., Ambrose, E. J. Interference Microscope Studies of Cell Contacts in Tissue Culture. Experimental Cell Research. 15, (58), 332-345 (1958).
  2. Coriell, L. L., McAllister, R. M., Wagner, B. M. Criteria for Determining Malignancy in Tissue-Culture Cell Lines in the Albino Rat. New York Academy of Science. 5, 351-355 (1957).
  3. Paul, J. The Cancer Cell in Vitro: A Review. Cancer Research. 22, 431-440 (1962).
  4. Dean, J. L., et al. Therapeutic response to CDK4/6 inhibition in breast cancer defined by ex vivo analysis of human tumors. Cell Cycle. 11, (14), 2756-2761 (2012).
  5. Bray, K., et al. Bcl-2 Modulation to Activate Apoptosis in Prostate Cancer. Molecular Cancer Research. 7, (9), 1487-1496 (2009).
  6. Quail, D. F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis. Nature Medicine. 19, (11), 1423-1437 (2013).
  7. Nakasone, E. S., et al. Imaging Tumor-Stroma Interactions during Chemotherapy Reveals Contributions of the Microenvironment to Resistance. Cancer Cell. 21, 488-503 (1016).
  8. Shi, Y., Hogue, J., Dixit, D., Koh, J., Olson, J. A. Functional and genetic studies of isolated cells from parathyroid tumors reveal the complex pathogenesis of parathyroid neoplasia. PNAS. 111, (8), 3092-3097 (2014).
  9. Vidal, S. J., et al. Isolation of cancer stem cells from human prostate cancer samples. J. Vis. Exp. (85), e51332 (2014).
  10. Wanping, X., Neckers, L. Targeting the Molecular Chaperone Heat Shock Protein 90 Provides a Multifaceted Effect on Diverse Cell Signaling of Cancer Cells. Clinical Cancer Research. 13, 1625-1629 (2007).
  11. Moulick, K., et al. Affinity-based proteomics reveal cancer-specific networks coordinated by Hsp90. Nature Chemical Biology. 7, (11), 818-826 (1038).
  12. Alpaugh, M. L., Tomlinson, J. S., Ye, Y., Barsky, S. H. Relationship of sialyl-Lewis(x/a) underexpression and E-cadherin overexpression in the lymphovascular embolus of inflammatory breast cancer. American Journal of Pathology. 161, (2), 619-628 (2002).
  13. Chu, K., Boley, K. M., Moraes, R., Barsky, S. H., Robertson, F. M. The paradox of E-cadherin: role in response to hypoxia in the tumor microenvironment and regulation of energy metabolism. Oncotarget. 4, (3), 446-462 (2013).
  14. Vaira, V., et al. Preclinical model of organotypic culture for pharmacodynamic profiling of human tumors. PNAS. 107, (18), 8352-8356 (2010).
  15. Centenera, M. M., Raj, G. V., Knudsen, K. E., Tilley, W. D., Butler, L. M. Ex vivo culture of human prostate tissue and drug development. Nature Reviews Urology. 10, 483-487 (2013).
  16. Jhaveri, K., et al. Heat shock protein 90 inhibitors in the treatment of cancer: current status and future directions. Expert Opinion on Investigational Drugs. 5, 611-628 (2014).
  17. Gerecitano, J. F., et al. Using 124-PU-H71PET imaging to predict intratumoral concentration in patients on a phase I trial of PU-H71. Journal of Clinical Oncology. 31, Suppl . 11076-11 (2013).
  18. Yildiz-Aktas, I., Dabbs, D. J., Bhargava, R. The effect of cold ischemic time on the immunohistochemical evaluation of estrogen receptor, progesterone receptor, and HER2 expression in invasive breast carcinoma. Modern Pathology. 25, 1098-1105 (2012).
प्राथमिक ट्यूमर और / या पूर्व नैदानिक ​​के लिए एसोसिएटेड Metastases और चिकित्सा के नैदानिक ​​विकास के <em>पूर्व vivo</em> उपचार की प्रतिक्रिया
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Corben, A. D., Uddin, M. M., Crawford, B., Farooq, M., Modi, S., Gerecitano, J., Chiosis, G., Alpaugh, M. L. Ex Vivo Treatment Response of Primary Tumors and/or Associated Metastases for Preclinical and Clinical Development of Therapeutics. J. Vis. Exp. (92), e52157, doi:10.3791/52157 (2014).More

Corben, A. D., Uddin, M. M., Crawford, B., Farooq, M., Modi, S., Gerecitano, J., Chiosis, G., Alpaugh, M. L. Ex Vivo Treatment Response of Primary Tumors and/or Associated Metastases for Preclinical and Clinical Development of Therapeutics. J. Vis. Exp. (92), e52157, doi:10.3791/52157 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter