We describe a technique for measuring aortic stiffness from its pressure-diameter relationship in vivo in mice. Aortic diameter is recorded by ultrasound and aortic pressure is measured invasively with a solid-state pressure catheter. Blood pressure is changed incrementally and the resulting diameter is measured.
Vi presenterar ett protokoll för mätning in vivo aorta stelhet i möss med användning högupplösta ultraljud. Aorta diameter mäts med ultraljud och aorta blodtrycket mäts invasivt med en solid-state tryckkateter. Blodtrycket höjs därefter sänks stegvis genom intravenös infusion av vasoaktiva läkemedel fenylefrin och natriumnitroprussid. Aorta diametern mäts för varje trycksteg för att karakterisera sambandet mellan aorta ascendens tryck-diameter. Stelhet index som härrör från relationen tryck diameter kan beräknas från insamlade data. Beräkning av arteriell överensstämmelse beskrivs i detta protokoll.
Denna teknik kan användas för att undersöka mekanismerna bakom ökad aorta styvhet i samband med hjärt-kärlsjukdom och åldrande. Tekniken ger en fysiologiskt relevant mått på styvhet jämfört med ex vivo metoder eftersom physiological influenser på aortastyvhet ingår i mätningen. Den främsta begränsningen med denna teknik är mätfelet införes från rörelsen av aorta under hjärtcykeln. Denna rörelse kan kompenseras genom att justera placeringen av sonden med aorta rörelse samt gör flera mätningar av förhållandet aortatryck diameter och expanderar den experimentella gruppstorlek.
Ökad aortastyvhet är ett kännetecken för hjärt-kärlsjukdom. Aging 1, röka 2, diabetes 3, hyperlipidemi 4, och andra riskfaktorer för hjärt-kärlsjukdom har visat sig öka aorta styvhet. Epidemiologiska studier har vidare visat aortastyvhet som ett kraftfullt oberoende prediktor för uppkomsten av kranskärlssjukdom och stroke, samt förekomsten av kardiovaskulära händelser och mortalitet 5-8. På grund av den kliniska och betydelse för folkhälsan med ökad aorta styvhet, är aktuell forskning inriktad på att förstå de mekanismer som ligger bakom utvecklingen och utvecklingen av vaskulär styvhet. Stort intresse finns därför i att utveckla exakta mått på kärlstyvhet i experimentella modeller av hjärt-kärlsjukdom.
Ett materials styvhet kan karakteriseras av sin stress töjningssambandet och kvantifieras så elastisk modUlus. En linjär elastiskt material deformeras reversibelt och dess stress ökar proportionellt mot stammen. Aorta och de stora artärerna är olinjära elastiska kroppar: då den sträcks innebär styvhet artären inte vara konstant, men ökar med graden av buk. Denna olinjäritet i de mekaniska egenskaperna hos stora artärerna beror på de olika styvhetsegenskaper hos de belastningsbärande elementen, nämligen elastin och kollagen, som utgör kärlväggen. Elastin är höggradigt töjbar med en elasticitetsmodul av 0,6 MPa. I jämförelse är kollagen mycket hård med en elasticitetsmodul på 1 GPa 9. Den initiala styvhet uppvisas av aorta vid lägre belastningsvärden skrivs elastin medan den höga styvheten ut på höga belastningsvärden beror på kollagen. Load överförs från elastin till kollagen som fartyget utvidgar och denna region av kraftöverförings är där kärlsystemet fungerar. Därför vid fysiologiska tryck, arteriell styvhetberor på bidraget från både elastin och kollagen 10.
Fördelningen och orienteringen av elastin och kollagen varierar genom skiktet inom artärväggen. I media är det elastin, kollagen, och glatta muskelceller buntas i trånga spiraler som är skiktad koncentriskt. Detta arrangemang tillåter artären för att motstå höga belastningar i omkretsriktningen. Adventitia är övervägande kollagen med föga elastin och kollagenfibrerna är organiserade i en nätliknande sätt. Dessa kollagenfibrer är vågiga i ett obelastat tillstånd och räta ut som belastningen ökar. Stelhet ökar när kollagenfibrerna räta ut, vilket därigenom förhindrar artären från översträckning och brista. På grund av den strukturella organisationen och varierande orientering av kollagenfibrer, artärer är anisotropa: stelheten uppvisade beror på om fartyget sträcks i längdriktningen eller perifer 11 In vivo styvhet.s är alltså en sammansättning av aorta s längs- och tvärstyvhet.
Artärstelhet är allmänt kvantifieras in vivo som efterlevnad eller pulsvågshastigheten (PWV). Arteriell överensstämmelse definieras som C = AD / AP där AD är förändringen i diameter och AP är motsvarande förändring av trycket. Lägre värden på efterlevnad indikerar styvare fartyg. Överensstämmelse beräknas från trycket-dimensionen förhållande av artären och är därför ett direkt mått på styvhet. Som styvhet sprids inte jämnt i kärl 12, bör efterlevnaden mätas vid samma / liknande plats i varje ämne att göra meningsfulla jämförelser mellan experimentella grupper.
Skillnaden mellan överensstämmelse och elasticitetsmodul är att elasticitetsmodulen är normaliserad till materialets dimensioner. Efterlevnad speglar därför strukturell styvhet, medan elasticitetsmodul reflects materialstyvhet. Med åldrande, arteriell väggtjockleken ökar och elastin / kollagenförhållande minskar, så både strukturell styvhet och materialstyvhet är större.
Jämfört med efterlevnaden är PWV ett indirekt mått på artärstelhet. PWV är den hastighet med vilken en tryckpuls färdas längs en längd av artär och påverkas av egenskaperna hos kärlväggen. Den Moens-Korteweg ekvation används för att modellera förhållandet mellan PWV och elasticitetsmodul: PWV 2 = Eh / (2 ρ r) där E är inkrementell elasticitetsmodul, h är väggtjockleken, är ρ blodets viskositet, och r är kärlet radie . Ett högre PWV värde föreslår därför en styvare kärl.
Efterlevnad och elasticitetsmodul kan mätas experimentellt ex vivo på en utskurna segment av kärlet. Att fastställa efterlevnaden, är fartyget segmentet monterad på en tryck myograph 13,14. Trycket inuti kärlet ökas stegvis och the resulte förändring i diameter spåras med hjälp av video mikroskopi. Överensstämmelse bestäms via data från tryck diameter. Stegvis elasticitetsmodul kan mätas genom dragprovning. I dessa experiment är fartyget dras isär stegvis och kraftförskjutnings data samlas tills kärlring raster. Stress och påfrestningar värden kan beräknas och plottas för att bestämma inkrementella elasticitetsmodul. Dessa ex vivo metoder kan användas för att utvärdera förändringar i de passiva egenskaper som påverkar styvheten.
In vivo, förutom att väggen innehåll, är vaskulär stelhet påverkas dynamiskt av glatt muskeltonus och blodtryck 13,15,16. PWV är den mest använda metoden för att mäta in vivo aorta styvhet i experimentella modeller. PWV kan bestämmas icke-invasivt använder Doppler ultraljud eller applanationstonometri 17. Tryckpuls mäts vid två separata ställen och den tid som krävs förpulsen att färdas avståndet är pulsvågshastigheten. Eftersom PWV mäts över en längd av aorta, det är ett medelvärde av styvhet. Stora artärer är olinjära elastiska, så styvhet och därmed PWV varierar med artärtryck. Ett högre PWV värde kan därför uppstå ökad styvhet eller förhöjt tryck. PWV värden därför måste normaliseras till blodtrycket att härleda slutsatser om fartygets styvhet. Mätmetoder som innehåller påverkan av blodtrycket med passiva egenskaper kärlväggen och effekterna av vasoaktiva mediatorer som förändrar tonen skulle ge ett fysiologiskt relevant index för artärstelhet. Detta tillvägagångssätt implementeras genom mätning av PWV invasivt med användning av en kateter med två trycksensorer separerade på ett fast avstånd 13. Denna dubbla tryck kateter förs in i aorta och vasoaktiva läkemedel, såsom fenylefrin eller natriumnitroprussid är infunderas intravenöst genomen venkateter för att höja och sänka artärtryck.
Detta protokoll beskriver en metod för att bestämma aorta stelhet in vivo från dess tryck-dimensionen relation i en musmodell. Detta tillvägagångssätt erbjuder flera fördelar jämfört med den invasiva PWV mätningen. Stelhet index, såsom efterlevnad, kan beräknas ur tryckmåttuppgifter som samlats in av denna procedur. Dessutom tillåter denna teknik för mätning av lokalt aorta styvhet eftersom styvhet mäts från en enda plats. Detta tillvägagångssätt är särskilt användbart vid mätning stigande aorta styvhet som den korta längden på denna region gör en PWV mätning svårt att få. Forskning intresse föreligger specifikt i aorta ascendens eftersom dess mekaniska egenskaper påverkar perfusion av krans cirkulationen och hjärt svar på vaskulär dysfunktion.
För att mäta förhållandet av aorta in vivo tryck diameter </em>, är aortaascendens visualiseras och dess diameter mätes genom ultraljudsavbildning. Aorta blodtrycket mäts invasivt med en tryckkateter. Blodtrycket ändras inkrementellt genom intravenös infusion av vasoaktiva läkemedel. Fenylefrin samman blodkärlen och används för att höja aortatrycket. Natriumnitroprussid vidgar blodkärlen och används för att sänka aortatrycket. Systoliskt och diastoliskt aorta diametrar och motsvarande aortatrycket mäts för varje tryckökning. Överensstämmelse kan beräknas från data tryck diameter insamlade.
Mätning diameter på flera inkrement tryck över ett brett intervall av tryckvärden som är nödvändigt för noggrann karakterisering av förhållandet mellan tryck diameter. De övre och undre tryckgränser som kan farmakologiskt inducerade kan variera med experimentgruppen men den ideala intervallet är ca 25 mm Hg till 125 mm Hg diastoliskt och 50 mm Hg till 200 mm Hg systoliskt. Doser på 360 mikrogram / kg / min PE och 240 mikrogram / kg / min SNP framkalla allmänhet gränserna för tryckområdet. Däremot kan doser av PE ökas till 480 mikrogram / kg / min och SNP till 360 mikrogram / kg / min för att verifiera att gränserna har uppnåtts. Arbets koncentrationer av PE och SNP kan minskas för att uppnå steg finare tryck. Eftersom diametern kommer att förändras med aortatrycket, inducera samma tryckvärden mellan djur och experimentgrupper är inte viktigt.
Venösa och arteriell kanyle kan utföras på andra platser med samma outcomes. Svansvenen kanyle kan vara utmanande på grund av den lilla storleken svansvenen. Dessutom är svansvenen icke lätt synliga i mörkt färgade möss. Den femorala venen kan vara kanylerade som ett alternativ. Denna väg kan vara lättare eftersom lårbensvenen är mer tillgänglig. För tryckkateter insättning, förutom lårbensartären, katetern kan införas genom carotis. Den femorala artären är att föredra över halspulsådern, men eftersom bröstregionen förblir intakt för ultraljudavbildning. Lårbensartären kanyle kan vara svårare eftersom lårbensartären är mindre. Med användning av en 1,2 F kateter och införa katetern i det proximala lårbensartären nedanför bukhålan underlättar kanyleprocessen. Att placera några droppar av en vasodilaterande medel såsom lidokain på lårbensartären eller med användning av en kateterinför kan också hjälpa förstora kärlet för att underlätta kateter införing. Tryck kateter ska hanteras och användasenligt tillverkarens instruktioner.
Placering av katetern inuti aortan behöver inte vara konsekvent mellan djur som tryckfallet inuti aortan är obetydlig. Emellertid kan placera katetern i bukaorta vara bättre att minimera interferens med ultraljud av bröstaortan. Vissa ultraljudsstordatorer kan spela in tryck realtid med M-mode spår, vilket ger en tryckmätning för varje diameter mätt på M-läget. Olyckligtvis, eftersom platsen där diametern mäts är inte samma plats som där trycket registreras, existerar en eftersläpning mellan trycket registrerades vid katetern och det faktiska trycket i aorta ascendens. Som ett resultat, kan endast maximalt och mätningar minimidiameter användas för dataanalysen.
Den primära begränsning med denna metod är den osäkerhet i mätningar infördes genom aortan skifta in och ut of ultraljudsplanet under hjärtcykeln. Motion infört felet är gemensam för alla imaging baserade studier, inklusive MRI och CT. Kompensationsstrategier inkluderar använder anatomiska funktioner för att flytta den referensram med rörelsen 18 och genomförs under databehandling. Som rörelsekompensation programvara är inte lätt tillgänglig, har utredaren att vara vaksam om att justera placeringen av sonden för att spåra skiftet i placeringen av aorta som blodtryck stiger och sjunker. Diameter mätningar bör också tas genom centrum av aorta. Emellertid kan bestämma huruvida M-mode inspelning läge passerar genom centrum vara svårt att bedöma på ultraljudsbilden, speciellt med aorta skiftande positioner. Den osäkerhet som införs genom dessa begränsningar uppenbart i graden av spridning i data, såsom framgår i fig 6. Erhålla en bild av tvärsnittet i stället för längsgående axeln för ascending aorta kan vara en lösning. Men att få denna uppfattning kan ibland vara mer utmanande och den resulte M-mode spår kan vara mindre tydlig. Tvärsnitts omkrets från B-modbild kunde mätas i stället för diametern från M-modbild. Men att avgöra när maximal och minimal omkrets har uppnåtts kommer att begränsas av B-mode bildhastighet och kan vara svårare att bedöma än på M-läget.
Göra flera mätningar av tomten den tryck diameter och ökar experiment gruppstorlek kan förbättra noggrannheten av uppgifterna. Data tryck diameter kan samlas in från flera platser längs bröstet. Detta protokoll skulle först utföras med sonden placerad på en plats på bröstet. Aorta skulle då visualiseras med sonden placeras på en annan plats och protokollet upprepas.
Vasoaktiva medel som används för att modulera blodtrycket kan potentiellt påverka aorta smidig muscle ton, vilket i sin tur skulle påverka styvhet. Emellertid har manipulering av aortatrycket genom venöst återflöde visats producera liknande förändringar i invasivt uppmätt PWV som farmakologisk manipulation i råttor. Dessa resultat visar att infusion av vasoaktiva läkemedel verkar i första hand på de perifera motstånds artärer och inte signifikant påverkar aorta glatt muskeltonus 19.
Detta protokoll kan utföras på råttor med några mindre modifikationer. Kistan är rakat före ansökan hårborttagningskräm. En kommersiellt tillgänglig 27 G x ½ "kateter används för läkemedelsinfusion. De läkemedelsdoser som används för att modulera aortatrycket är 40, 80, och 120 | ig / kg / min av PE och 40, 80, och 120 ug / kg / min av SNP.
Förutom aortaascendens, kan regionala skillnader i aorta styvhet bestämmas med detta protokoll. Regional styvhet mätt med denna metod skulle vara mer exakt än genom PWV som mätningar are tagen från en plats som motsätter sig att två platser för PWV. Emellertid är regioner längs aortan som kan mätas med denna teknik begränsade till dem som kan visualiseras genom ultraljud.
Elastisk modul kan också beräknas från data som samlats in av denna metod om man kan få en väggtjockleksmätning. Noggrann mätning in vivo av musen aorta begränsas av upplösnings gränserna för nuvarande ultraljudsteknik. Framtida förbättringar av ultraljudsteknik kan göra in vivo väggtjockleksmätning mer genomförbar. Som ett alternativ, kan utföras tjockleksmätningar ex vivo. Tryck myography skulle ge den mest noggranna mätningar eftersom tjockleken kan mätas vid varje tryckökning.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by a National Heart, Lung, and Blood Institute grant 1RO1-HL-105296-01 (to D.E. Berkowitz) and an Australian Research Council Grant DP110101134 (to A. Avolio).
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Equipment | |||
High-resolution ultrasound machine | Visual Sonics | Vevo2100 | |
13-24 MHz transducer | Visual Sonics | MS250 | Used for imaging rats |
22-55 MHz transducer | Visual Sonics | MS550D | Used for imaging mice |
Imaging Station | Visual Sonics | Imagine Station 1 | |
1.2F Pressure catheter | Transonic | FTH-1211B-0018 | |
SP200 pressure control unit | Transonic | FFS-095-DP01 | |
Standard Infusion Only Harvard Pump 11 Plus syringe pump | Harvard Apparatus | 702208 | |
Isoflurane vaporizer | VetEquip | 911103 | |
Induction chamber | VetEquip | 941443 | |
100% O2 | Airgas | OX USP200 | |
Single Stage Brass 0-50 psi General Purpose Cylinder Regulator CGA540 | Airgas | Y11215B540 | |
Stereo Boom Stand Microscope | National Optical | 420-BMSQ | |
Fiber optic illuminator & light pipe | Cole Palmer | EW-41500-50 | |
Supplies | |||
30G x 1/2" BD PrecisionGlide Needle | BD | 305106 | For tail vein cannulation in mice |
Polyethylene Tubing PE10 | Becton Dickinson | 427401 | For tail vein cannulation in mice |
27Gx1/2" Surfloe winged infusion set | Terumo | SV*27EL | For tail vein cannulation in rats |
Signa Gel Electrode Gel | Parker | 15-25 | Use for ECG recording |
Aquasonic Clear Ultrasound Gel | Parker | 03-08 | Use for ultrasound |
1mL Sub-Q Syringes, 26G x 5/8" | BD | 309597 | |
Nair | Nair | Depilatory cream | |
Histoacryl | TissueSeal | TS1050071FP | Tissue glue |
Braided Silk Suture 6-0 | Teleflex | 104-S | |
Dumostar P55 fine forceps | Roboz | RS-4984 | |
Microscissors | WPI | 501839 | |
Fine scissors | FST | 14060-11 | |
Medium forceps | Ted Pella | 5665 | |
Hemostatic forceps | Roboz | RS-7131 | |
Non-sterile cotton gauze sponge | Fisherbrand | 22-362-178 | |
Cotton tipped applicators | Oritan | 803-WC | |
Label tape | Fisherbrand | 15-901-20 | |
Drugs | |||
Sodium chloride | Sigma Aldrich | S7653 | |
R-Phenylephrine hydrochloride | Sigma Aldrich | P6126 | |
Sodium nitroprusside dihydrate | Sigma Aldrich | 71778 | |
Software | |||
Prism | GraphPad | ||
Excel | Microsoft |