Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biology

שחזור של לבבות למבוגרים דג הזברה עבור יישומי תפוקה גבוהה

doi: 10.3791/52248 Published: December 12, 2014

Abstract

שימוש במערכת מודל דג הזברה ללימוד פיתוח, התחדשות, ומחלה מתפשטת לכיוון שימוש בלבבות מבוגרים לניתוק תא וטיהור של RNA, DNA, חלבונים ו. כל היישומים האלה דורשים התאוששות המהירה של מספר המשמעותי של לבבות דג הזברה להימנע גן בקרה, חילוף חומרים, ושינויים אחרים שמתחילים אחרי המוות. לב דג הזברה מבוגר נדרש גם ללימוד מבנה לב עבור מגוון רחב של מוטציות וללימוד התחדשות לב. עם זאת, לנתיחה לב דג הזברה המסורתית היא איטית וקשה ודורשת כלים מיוחדים, מה שהופך את הנתיחה בקנה מידה גדולה של לבבות דג הזברה מבוגרים מייגע. שיטות מסורתיות גם נמל את הסיכון של פגיעה בלב במהלך הניתוח. כאן, אנו מתארים שיטה לניתוח לב דג הזברה מבוגר שהיא מהיר, לשחזור, ומשמר את ארכיטקטורת לב. יתר על כן, שיטה זו אינה דורשת כלים מיוחדים, אינו מכאיב לדג הזברה,יכול להתבצע על דגימות טריות או קבועים, וניתן לבצעו בדג זברה צעירה כמו בן חודש. הגישה המתוארת מרחיבה את השימוש בדג הזברה מבוגרת למחקר לב וכלי דם.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

הערה: תמיד להיות בטוח שאישור ועדת IACUC או אתיקה הוא במקום לפני תחילת כל הליך ניסיוני באמצעות דג הזברה.

1. הכינו חומרים כימיים והתקנה

  1. הכן את הפתרונות הבאים. מצא את המתכונים לכל הפתרונות הללו במדריכי דג הזברה סטנדרטיים 10.
    • 500 מיליליטר של מים ביצה
    • 200 מיליליטר של 0.03% Tricaine בביצת מים
    • של נאגר מלוח פוספט 1x 100 מיליליטר (PBS)
    • RBC תמוגה מאגר (אופציונאלי)
    • חיץ יעד של בחירה (מקבע, Trizol, PBS, וכו ') בצינור 1.5 מיליליטר microfuge על קרח
      הערה: מקבע וTrizol רעילים אם הם באים במגע עם עור. ללבוש כפפות בעת טיפול בחומרים אלה.
  2. הכן התקנה לנתיחה:
    1. מקם את מקור מתכווננת אור על מיקרוסקופ לנתח. מניחים את המכסה של 9 סנטימטר צלחת פטרי על הבמה מיקרוסקופ לנתח, ויוצקים שכבה דקה של 1x PBS לזה (המכסה משמש כי המנה עצמה היא עמוקה מדי עבור נתיחה קלה).
    2. מניחים את צלחת פטרי עצמו (לא את המכסה) על הדלפק ליד ההיקף לנתח ויוצקים כ 15 מיליליטר של 1x PBS בזה. להשתמש בזה כדי לשטוף את הלב לאחר נתיחה. לחלופין, להשתמש RBC תמוגה הצפת.
    3. להב מקום גילוח, שני זוגות מלקחיים, microscissors (אופציונאלי), ופיפטה העברה לצד מיקרוסקופ. להשיג מיכל של קרח אם המתת חסד על ידי קירור מהיר נבחרה.
    4. יוצקים 200 מיליליטר של 0.03% Tricaine בביצת מים לתוך כוס זכוכית 250 מיליליטר אם המתת חסד על ידי Tricaine נבחר. הכן תיק Biohazard קטן לסילוק פגרי דג הזברה.

2. הכן דג הזברה

  1. לדגים קבועים, להביא דגים קבועים, לשטוף בPBS, להתקנת מיקרוסקופ.
    1. להרדים את כל דג הזברה מבוגרת על ידי קירור מהיר עם קרח ל> 10 דקות.
    2. שימוש במלקחיים כדי לעשות חור בעור מעל הצפק(מהלב) כדי לסייע לחדירה מקבע, ואז לשים אותם בparaformaldehyde 4% בתקן Buffer 10 לשעה 2 ב RT או O / N ב 4 ° C.
  2. לחלופין, לדגים טריים, דגי המקום להיות מורדמים במכל קטן החזקה ולהביא להתקנת מיקרוסקופ. בהתאם לפרוטוקול הדגים של המתקן הבודד והשימושים במורד הזרם ללב דגים גזורים, להרדים דגים עם Tricaine או להרדים על ידי קירור מהיר לפני עריפת הראש.
    1. כדי להשתמש בקרח, להרים דג אחד עם רשת הדגים והמקום במי קרח עד שהדג מפסיק לנוע, כ -5 דקות.
    2. לחלופין, להשתמש Tricaine, להרים דג אחד עם רשת הדגים ומניחים בכוס של הפתרון עד תנועות זימים להפסיק.
  3. במהירות להרים את הדגים מורדמים על ידי סנפיר הזנב שלה ולהניח אותה בצד שלה בכיסוי צלחת פטרי שהיה מלא ב1x PBS. השתמש במלקחיים כדי להרים את סנפיר חזה ביד אחת, תוך השימוש בrazoלהב r לערוף את הדגים ביד השנייה, רק אחורי לצירופה של סנפיר החזה (איור 1 א). לבצע שלב זה או על ידי מחפש דרך מיקרוסקופ או פשוט ישירות לדמיין את הדגים על הבמה מיקרוסקופ.
    הערה: דגים טריים עדיין מורדמים ידממו לאחר עריפת הראש.

איור 1
איור 1. לנתיחה לב מבוגר דג הזברה מנצלת ציוני דרך אנטומי דג הזברה. (א) כדי לערוף את הדגים, להרים את סנפיר החזה עם מלקחיים ולהשתמש בסכין גילוח נקי חד לאורך הקו המקווקו האדום כפי שמוצג. (ב) כדי לייצב את ראש הדג, מקום שן אחת של המלקחיים בפה הדג ואילו שן האחר טמון פני העין, ולאחר מכן להפעיל את ראש הדג, כך שמשטח הגחון הוא למעלה והן השיניים של המלקחיים יציבות נגד תחתית צלחת פטרי. (C) השתמש בforc החופשיeps לחתוך את הקובץ המצורף של operculum (החץ). (ד) ההרמה זו, אב העורקים הגב גלוי כמבנה לבן עם פס ורוד המציין דם luminal (חץ). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

3. לנתח הלב

  1. דמיין את ראש הדג מתחת למיקרוסקופ. עם אחד מלקחיים, לייצב את ראש הדג על ידי הנחת שן אחת של המלקחיים בפה הדגים, דרך המוח, ואילו שן האחר הוא מחוץ לראש, על פני העין (איור 1). ודא שני השיניים של המלקחיים הן יציבים נגד תחתית צלחת פטרי. מחזיק את ראש הדג בדרך זו, משטח הגחון שלה צריך להיות כלפי מעלה.
  2. ביד השנייה, להשתמש במלקחיים השני לחתוך את הקובץ המצורף הגחון של operculum לגוף (חץ, איור 1 ג). ההרמה מעט זה עם המלקחיים, דאב העורקים orsal יופיעו מתחת למבנה לבן עם פס אדום של דם בלומן של אב העורקים (חץ, 1D איור). חותך את אב העורקים גב עם המלקחיים על ידי צובט את אב העורקים ומושכים כלפי מעלה; לחלופין, להשתמש microscissors לחתוך את אב העורקים הגב.
  3. עכשיו, להשתמש במלקחיים השני לתפוס את סנפיר החזה מבסיסו, ובכלל זה סחוס הגוף בבסיס של הסנפיר, ולהרים את זה ממני. חזור עם סנפיר החזה האחר. מדי פעם, הלב יוצא עם סנפירי החזה, כך לבחון חלקים אלה כדי לוודא שהלב אינו מחובר לפני השלכת אותם.
    הערה: בשלב זה, הלב צריך להיות גלוי, עדיין שלם ומחוברים לראש הדג שנותר (אם כי מדי פעם זה יורד עם סנפירי החזה). הלב יכול להיות מזוהה על ידי צורתו, צבעו הוורוד, והיותו מוקפים בקרום לב פיגמנט. משום המתת חסד של הדגים מתבצע במהירות, לב דגים טרי מורדמים עדיין עשוי להיות מכות slowly.
  4. עזוב את ראש הדג עם המלקחיים הראשונים, כך ששני הידיים מחזיקות מלקחיים וחופשיים. להשתמש בשני המלקחיים כדי להקניט את הלב מקרום הלב. לתפוס את הלב על ידי השארית של אב העורקים הגב תוך קרום הלב הנותר התרחק.
    הערה: אם קבוע או טרי, הלב הוא חזק כדי עדין מושך תוך רקמת חיבור המקיפה היא פריך יותר. לכן, כל רקמת קרום הלב שמסביב יכולה להיות גזור משם עם הלב שנותר ללא פגע.
  5. מחק את פגר דגי שאריות בשקית Biohazard.

4. מכין את הלב ליישומים במורד הזרם

  1. בעזרת מלקחיים, לתפוס את הלב על ידי הקצה של אב העורקים גב / arteriosus bulbus ולמקם את הלב בצלחת הטרי של 1x PBS. לחלופין, להשתמש פיפטה העברה. הזז את הלב הלוך ושוב בPBS על 10x כדי לשטוף כמה שיותר דם ככל האפשר.
  2. עבור יישומים בהם הוא חשוב כדי להסיר את כל possibתאי דם le, לשטוף בצלחת פטרי 9 סנטימטר עם 15 מיליליטר RBC תמוגה הצפת במקום PBS, תוך שימוש באותה תנועת גב ו-ושוב. אם השמירה על מבנה הלב אינה חשובה ליישום במורד הזרם (לדוגמא, מה שהופך את RNA), להשתמש במלקחיים או microscissors כדי לפתוח את חלל הלב ולהקל על השטיפה במרחק של תאי דם.
  3. עבור יישומים בי חדרי לב נפרדים רצויים, להשתמש במלקחיים או microscissors לנתח את arteriosus bulbus, אטריום, והחדר מלבד אחד את השני.
  4. העבר את הלב, או תאים נפרדים, למאגר שהיעד על קרח.
    הערה: יעדים נפוצים כוללים מאגרים לתא דיסוציאציה, paraformaldehyde 4%, או Trizol.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

באמצעות שיטה זו, לב דג הזברה מבוגר יכול להיות גזור בדקות פחות מ 1, בהשוואה ליותר מ -5 דקות בשיטות מסורתיות 8. לבבות גזורים בשיטה זו הם באופן מהימן שלמים (איור 2 א), ואילו שיטות מסורתיות 8 דורשות חיתוך בצורה עיוורת לקרום הלב ולכן בדרך כלל לגרום לניזק או אובדן arteriosus אטריום או bulbus (איור 2). לבבות גזורים לשמור על השלמות המבנית שלהם ומתאימים להיסטולוגיה (איור 2 ג), מיקרוסקופ אלקטרונים (איור 2 ד), כמו גם ליישומים שבם הלב מנותק או כתוש. בידיים שלנו, מנתיחה של 50 לבבות במהלך הניסויים של שבוע, 50 לבבות התקבלו מבני בשלמותה. אנחנו גם לימדתי את הטכניקה הזו לעמית במעבדה שהיה חסר ניסיון בנתיחת דג הזברה. 9 מתוך 9 לבבות גזורים על ידי העמית למתחילים היו גם structurally ללא פגע. שיטה זו מתאימה לנתיחה לנערים ישנים יותר מבוגר מן 1 חודש, ועבור מבוגרים מכל הגילים.

איור 2
לבבות איור 2. גזור במצב תקינים ולשמור על שלמות ארכיטקטונית. (א) בדקות פחות מ 1, לב דג הזברה מבוגר עם אטריום שלם (A), חדר (V), וarteriosus bulbus (BA) יכול להיות גזור מדגים מורדמים. ניתוחי לב (B) למבוגרים מסורתיים דג הזברה להימשך זמן רב יותר וגם כאשר הטיפול נלקח, מפעיל את הסיכון של נזק. הנה, רק החדר שלם. (C) לב גזור מדגים בוגרים Tg (myl7 dsRed) שמר על השלמות המבנית שלה לשימוש בהיסטולוגיה. אטריום (א), חדר (V), וarteriosus bulbus (BA) נראה, ומבנים קטנים עוד יותר כמו שסתום בין העליות וחדרים (AV, חץ) ומערכת יצוא (OFT, חץ) הם שלמים. (ד) </ Strong> מיקרוסקופ אלקטרונים של לב מבוגר wild-type גזור מראה כי sarcomeres להישאר שלא נפגע בתהליך לנתיחה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

בעוד שיטות ללנתח לב דג הזברה המבוגר תוארו, שיטות אלה היו זמן רב ונפוצות גרמו לפגיעה בלב במהלך נתיחה. כדי לבצע ניסויים שבם מספר רב של לבבות מבוגרים עשוי להיות נחוץ, ו / או כאשר הימנעות השפלה של רקמת לב היא חשובה עבור יישומים במורד הזרם, הזמן הנדרש תוך שימוש בטכניקות מסורתיות לנתיחה הוא מונע. באופן דומה, reproducibly קבלת לבבות ניזוק, שלמים חשובה למחקר של מבנה לב ושיטות immunohistochemical ומיקרוסקופיה. מצאנו שגם בידיו של המתחילים, לבבות גזורים 100% נמצאו מבני בשלמותה. בסך הכל, בשיטה לנתיחה לב מבוגרת שהוצגה כאן מציגה מראש בטכניקה המרחיבה את השימוש בדג הזברה מבוגרת עבור מגוון רחב של יישומים הנוכחיים ועתידיים, כוללים שימוש בפציעת לב וניסויים התחדשות.

ישנם מספר צעדים קריטיים within פרוטוקול זה. ראשית, בהתאם לניסוי שלב דג הזברה נדרש, חשוב לשטוף את לב עד כמה שניתן מתאי דם. דוגמאות לניסויים שירוויחו מהסרת תאי דם כוללים התאוששות של לב לRNA-Seq, שבו נוכחות של דם תשנה פרופילי ביטוי גנים, או לFACS מיון, שבו תאי דם עלולים להיות קשים כדי למיין מתאי שריר לב. אחרי הדגים הוא מורדמים עם Tricaine או קרח, חשוב לערוף את הדגים במהירות ולאפשר דימום להתרחש כדי לסייע להיפטר לב הדם עודף. אם לב שלם אינו נדרש לניסוי המתוכנן, זה יכול להיות מועיל כדי לחתוך את אטריום וחדר פתוח, כאשר בPBS כדי לשטוף את הדם נוסף. גם מאגר תמוגה RBC יכול לשמש במקום PBS.

שנית, כאמור לעיל, לעתים הלב יורד עם אחד מסנפירי החזה ולא להישאר צמוד לראש. לכן, למשוך את סנפירי החזהאת מתחת למיקרוסקופ, כך שיכול להיות מזוהה הלב. לבסוף, כאשר לנתח לב מסביב קרום הלב, לנסות לא לתפוס את הלב עצמו; במקום זאת, לתפוס שתי חתיכות של קרום הלב ומושך את שניהם מן הלב, שבו יש יותר שלמות מבנית מקרום הלב הפריך. בדרך זו, ניתן להימנע אפילו נזק מינימאלי ללב.

הלב צריך להיות קל לזיהוי על ידי הצורה וההתכווצויות שלה. כסיוע נוסף במציאת הלב, ניתן לנתח לב להביע חלבון פלואורסצנטי תחת מיקרוסקופ לנתח הקרינה. זה בדרך כלל לא נחוץ, אך עשוי להיות שימושי למתחילים ו / או לניתוחי לב קטן מאוד.

מגבלה אחת של טכניקה זו היא שלנתח את לב מדגים קטנים, כלומר, מתחת לגיל 3 שבועות, קשה; טכניקות אחרות תוכננו לניתוחי זחל 9. כמו כן, בזמן שהוא קל לנתח את bulbusrteriosus, אטריום, וחדר אחד מהשני, שלא ניתן לנתח את השסתום בין העליות וחדרים בכוחות עצמו. השסתום נשאר מחובר לחדר ברוב המקרים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Small tank for transporting fish Aquaneering ZHCT100
Fish net Petsmart 36-16731
250 ml glass beaker Kimble 14005-250
9 cm polystyrene Petri dish Nunc 172958
Razor blade Personna American Safety Razor Company 94-120-71
2 Dumont #5SF forceps Fine Science Tools 11252-00
Dissecting microscope Olympus SZX16
Tricaine Sigma A-5040
Plastic transfer pipette Thermo Scientific 202-20S
Gooseneck light source Dolan-Jenner Industries, Inc Fiber-Lite 180 Illuminator, 181 Dual Gooseneck System
Fluorescent light source Lumen Dynamics X-Cite 120Q optional
Micro-scissors Biomedical Research Instruments, Inc 11-1000 optional
RBC lysis buffer eBioscience 00-4333-57 optional

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Arnaout, R., et al. Zebrafish model for human long QT syndrome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, (27), 11316-11321 (2007).
  2. Chi, N. C., et al. Genetic and physiologic dissection of the vertebrate cardiac conduction system. PLoS Biology. 6, (5), 109 (2008).
  3. Poss, K. D. Getting to the heart of regeneration in zebrafish. Seminars in Cell & Developmental Biology. 18, (1), 36-45 (2007).
  4. Fang, Y., et al. Translational profiling of cardiomyocytes identifies an early Jak1/Stat3 injury response required for zebrafish heart regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, (33), 13416-13421 (2013).
  5. Manoli, M., Driever, W. Fluorescence-activated cell sorting (FACS) of fluorescently tagged cells from zebrafish larvae for RNA isolation. Cold Spring Harbor Protocols. 2012, (8), (2012).
  6. Cannon, J. E., et al. Global analysis of the haematopoietic and endothelial transcriptome during zebrafish development. Mechanisms of Development. 130, (2-3), 122-131 (2013).
  7. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nature Reviews Genetics. 10, (1), 57-63 (2009).
  8. Gupta, T., Mullins, M. C. Dissection of organs from the adult zebrafish. Journal of Visualized Experiments. 37, (2010).
  9. Singleman, C., Holtzman, N. G. Heart dissection in larval, juvenile and adult zebrafish, Danio rerio. Journal of Visualized Experiments. 55, (2011).
  10. Westerfield, M. The zebrafish book: a guide for the laboratory use of zebrafish (Brachydanio rerio. University of Oregon Press. Eugene, OR. (1993).
שחזור של לבבות למבוגרים דג הזברה עבור יישומי תפוקה גבוהה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Arnaout, R., Reischauer, S., Stainier, D. Y. R. Recovery of Adult Zebrafish Hearts for High-throughput Applications. J. Vis. Exp. (94), e52248, doi:10.3791/52248 (2014).More

Arnaout, R., Reischauer, S., Stainier, D. Y. R. Recovery of Adult Zebrafish Hearts for High-throughput Applications. J. Vis. Exp. (94), e52248, doi:10.3791/52248 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter