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Biology

ハイスループットのアプリケーションのための大人のゼブラフィッシュハーツの回復

doi: 10.3791/52248 Published: December 12, 2014

Abstract

発達、再生、および疾患を研究するためのゼブラフィッシュモデル系の使用はRNA、DNA、およびタンパク質の細胞分離および精製のための大人の心の使用に向けて拡大している。これらのアプリケーションはすべて、調節遺伝子、代謝、および死後に始まる他の変更を避けるために、ゼブラフィッシュの心のかなりの数の急速な回復を要求する。大人のゼブラフィッシュの心も、突然変異体のさまざまな心臓の構造を研究するため、心臓の再生を研究するために必要とされる。しかし、従来のゼブラフィッシュの心臓解剖が遅いとは困難であり、退屈な大人のゼブラフィッシュの心の大規模な解剖をする、特殊なツールが必要です。伝統的な方法はまた、切開中に心臓を損傷する危険性を保有する。ここでは、高速で再現性があり、心臓のアーキテクチャを保持成体ゼブラフィッシュの心臓の解剖するための方法を記載する。さらに、この方法は、特殊なツールを必要としない、ゼブラフィッシュのために無痛である、新鮮なまたは固定された試料で行うことができ、生後1ヶ月の幼いゼブラフィッシュで行うことができる。記載されたアプローチは、心血管研究のための大人のゼブラフィッシュの使用を拡大する。

Protocol

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注:常に動物実験委員会または倫理委員会の承認は、ゼブラフィッシュを使用して、任意の実験手順を開始する前に、所定の位置にあることを確認してください。

1.試薬およびセットアップを準備

  1. 以下のソリューションを準備します。標準のゼブラフィッシュマニュアル10におけるこれらのソリューションのすべてのレシピを検索します。
    • 卵水500mlの
    • 卵、水で0.03%トリカインの200ミリリットル
    • 1×リン酸緩衝生理食塩水(PBS)100ml中
    • RBC溶解バッファー(オプション)
    • 氷上の1.5mlマイクロチューブ中の選択肢の宛先バッファ(固定液、トリゾール、PBS など
      注:彼らは皮膚に接触した場合に固定液とトリゾールは有毒である。これらの物質を取り扱う際は手袋を着用してください。
  2. 解剖のセットアップを準備します。
    1. 解剖顕微鏡上グースネック光源を配置します。解剖顕微鏡のステージ上で9センチメートルシャーレの蓋を置き、中に1×PBSの薄い層を注ぐそれ(ディッシュ自体は簡単に解剖のために深すぎるので、蓋が使用されている)。
    2. 解剖スコープの近くにカウンター上のペトリ皿自体(いない蓋)を配置し、その中に1×PBSの約15ミリリットルを注ぐ。解剖後に心臓を洗浄するために使用します。また、RBC溶解バッファーを使用しています。
    3. 置きかみそりの刃、顕微鏡の横に鉗子、microscissors(オプション)、および転送ピペットの2組。急速冷却による安楽死を選択した場合の氷のコンテナを取得します。
    4. トリカインによって安楽死を選択した場合250mlのガラスビーカーに卵水中の0.03%トリカインを200ml注ぐ。ゼブラフィッシュ死骸の処分のための小さなバイオハザードバッグを準備します。

2.ゼブラフィッシュを準備

  1. 固定魚の場合は、顕微鏡のセットアップに、PBSですすぎ、固定された魚を、持って来る。
    1. > 10分間氷で急冷することによって全体の大人のゼブラフィッシュを安楽死させる。
    2. 腹膜上の皮膚に穴を作るために鉗子を使用して、(心臓から)固定液の浸透を補助するため、その後、4℃でRTまたはO / Nで2時間修正バッファ10に4%パラホルムアルデヒドでそれらを置くために。
  2. また、新鮮な魚のために、小さな保持タンクに安楽死させ、顕微鏡のセットアップにもたらすことが魚を置く。個々の施設の魚のプロトコルと解剖魚の心のために下流の用途に応じて、トリカインで魚を麻酔または断頭前に急速に冷却することにより安楽死させる。
    1. 魚は、約5分の移動を停止するまで、氷を使用するには、氷水で魚網と場所で1魚を拾う。
    2. 鰓の動きが停止するまでまたは、トリカインを使用するために、溶液のビーカー内の魚網と場所で1魚を拾う。
  3. すぐにそのテールフィンにより安楽死させた魚をピックアップし、1×PBSで満たしたペトリ皿のカバーでその側にそれを置く。 RAZOを使用しながら、片手で胸びれを持ち上げるために鉗子を使用して、Rもう一方の手で魚を斬首するブレード、ちょうど胸びれ( 図1A)の結合を後方。顕微鏡を通して見ることによって、または単に直接顕微鏡ステージ上の魚を視覚化することによってどちらか、この手順を実行します。
    注:新鮮な安楽死魚はまだ断頭後に出血します。

図1
図1.ゼブラフィッシュの大人の心臓解剖は、ゼブラフィッシュ、解剖学的ランドマークを利用しています。 (A)は 、魚を斬首ピンセットで胸びれを持ち上げ、図のように赤の点線に沿ってシャープなきれいなカミソリの刃を使用します。(B)、魚の頭を安定魚の口のしばらく鉗子の1歯を配置するには他の歯は、目全体に位置し、腹面がアップしていると鉗子の両方の歯は、ペトリ皿の底に対して安定しているように、その後魚の頭を回す。(C)無料FORCを使用してくださいEPSは蓋(矢印)。(D)は 、このリフティングの添付ファイルをカットする、背側大動脈を管腔血液(矢印)を示すピンクのストライプと白の構造として表示されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

3.ハートを解剖

  1. 顕微鏡下で魚​​の頭を可視化。他の歯は、目( 図1B)全体で、頭部の外にある間に1鉗子で、脳を通して、魚の口の中で鉗子の1歯を配置することにより、魚の頭を安定。鉗子の両方の歯は、ペトリ皿の底に対して安定していることを確認してください。魚の頭をこのように保持し、その腹面を上向きにする必要があります。
  2. もう一方の手で、体(矢印、 図1C)に蓋の腹側添付ファイルをカットする第二鉗子を使用しています。鉗子で少しこのリフティング、Dorsalの大動脈、大動脈内腔(矢印、 図1D)の血液の赤のストライプと白の構造体としての下に表示されます。大動脈をつまんで上向きに引いて、ピンセットで背側大動脈をカット。代わりに、背側大動脈をカットするmicroscissorsを使用しています。
  3. さて、フィンのベースのボディ軟骨を含む、そのベースから胸びれを把握することが第二の鉗子を使用し、これをオフに持ち上げます。他の胸鰭を繰り返します。時折、心臓は胸びれで出てくるので、心がそれらを廃棄する前に接続されていないことを確認するこれらの作品を調べます。
    注:この時点で、心臓は(時にはそれが胸びれで外れが)まだそのまま、残りの魚の頭に接続され、表示されるはずです。心臓は、その形状、そのピンク色、および色素性心膜に囲まれた人間によって同定することができる。魚の安楽死を迅速に実行されているので、新鮮に安楽死魚の心はまだSLOを破っできるWLY。
  4. 両手が鉗子を保持し、自由であるように、最初の鉗子で魚の頭を手放す。離れて心膜から心をいじめるために両方の鉗子を使用してください。残りの心膜が引き離されている間背部大動脈の残りの部分によって心をつかみます。
    注:固定または新鮮かどうか、心が周囲の結合組織はよりもろい状態で引っ張って穏やかに堅牢である。そのため、周囲の心膜組織は、心臓が無傷で残っていると離れて解剖することができます。
  5. バイオハザードバッグ内の残りの魚の死体を捨てる。

4.ダウンストリームアプリケーションのハートを準備

  1. 鉗子を使用して、背側大動脈/動脈球の縁によって心をつかみ、1×PBSの新鮮な皿に心を置く。また、転送ピペットを使用しています。約10倍はできるだけ多くの血を洗い流すために、PBS中で前後に心を移動します。
  2. それはすべてpossibを除去することが重要である用途のためにルの血液細胞は、同一の往復運動を使用して、代わりにPBSを15mlのRBC溶解バッファーと9センチメートルシャーレに洗う。心臓の構造を維持すること( 例えば、RNAする)、心臓腔を開いて離れ、血液細胞のすすぎ容易にするために、鉗子またはmicroscissorsを使用する下流側のアプリケーションのために重要でない場合。
  3. 心腔を分離する用途では、所望の動脈球を分析するために鉗子またはmicroscissorsを使用し、心房、および互いに離間心室される。
  4. 氷の上の宛先バッファに、心臓、または別々のチャンバを転送します。
    注:一般的な目的地は、細胞解離、4%パラホルムアルデヒド、またはトリゾールための緩衝液を含む。

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Representative Results

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この方法を用いて、成体ゼブラフィッシュの心臓は、伝統的な方法8を用いて5分間かけて比較して、1分未満で解剖することができる。ハーツは、この方法を使用して解剖し、従来の方法8は心膜に盲目的に切断が必要なので、一般的にアトリウムまたは球部動脈( 図2B)の損傷または損失の原因となりながら、確実に( 図2A)は無傷である。切開した心臓は、その構造的完全性を維持し、組織学( 図2C)に適しており、電子顕微鏡( 図2D)、ならびに心臓が解離または粉砕される用途のために。私たちの手では、週の実験の過程にわたって50の心の解剖から、50の心は、構造的に無傷で得られた。我々はまた、ゼブラフィッシュ郭清を伴う経験がなかった研究室で同僚にこの技術を教えた。初心者の同僚によって解剖9心のうち9もSTRUCたturallyそのまま。この解剖法は、1ヶ月よりも古い少年のために、すべての年齢の大人のために適しています。

図2
図2.解剖の心はそのままであり、建築の整合性を維持。 (A)が 1分未満、そのまま心房(A)と成人のゼブラフィッシュの心臓では、心室(V)、および動脈球(BA)は安楽死させた魚から切除することができます。(B)従来の大人のゼブラフィッシュの心臓解剖は時間がかかると注意が取られた場合でも、損傷の危険があります。ここでは、唯一の心室が損なわれていない。(C) のTg(myl7のDsRed)成魚から切開心臓は組織学で使用するためにその構造的完全性を維持した。心房(A)、心室(V)、および動脈球(BA)が見られ、房室弁(AV、矢印)と流出路(OFT、矢印)のようなより小さな構造が損なわれている。(D)</ strong>の解剖野生型成人の心臓の電子顕微鏡は、筋節は解剖プロセスによって損傷を受けたままであることを示している。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

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Discussion

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成体ゼブラフィッシュの心臓を切開するための方法が記載されているが、これらの方法は時間がかかりました、一般に切開の間に心臓への損傷を引き起こした。成人の心臓の多数必要になることが実験を実行するために、および/または心臓組織の劣化を回避することが下流の適用のために重要である場合、従来の切開技術を使用してかなりの時間が必要である。同様に、再現可能に損傷を受けていない、そのままの心を得ることは、心臓の構造の研究のためおよび免疫組織化学および顕微鏡検査方法のために重要である。私たちも、初心者の手の中に、解剖の心の100%が構造的に無傷で回収されたことがわかった。全体的に、ここに提示成体心臓切開するための方法は、心臓損傷および再生の実験に使用するなど、現在および将来の用途、種々の成体ゼブラフィッシュの使用を拡大する技術の進歩を提示する。

ワットいくつかの重要なステップがあります。このプロトコルをithin。まず、ゼブラフィッシュの心臓が要求される実験に応じて、それは血液細胞からできるだけ心をリンスすることが重要である。血液細胞を除去することから利益を得る実験の例は、血液の存在は、遺伝子発現プロファイルを変化させる、または血液細胞、心筋細胞からソートすることは困難であるFACSソーティングのためであろうRNA-配列のための心臓の回復を含む。魚がトリカインや氷で安楽死された後、それはすぐに魚を斬首し、過剰な血液の心を取り除く手助けするために発生し、出血を許可することが重要です。無傷の心が計画実験に必要されていない場合は、アトリウムをカットし、PBS中でさらに血液をすすぐためにときに開いて心室に役立ちます。 RBC溶解緩衝液はまた、代わりにPBSを用いることもできる。

第二に、上記のように、時折心臓は胸のフィンの1よりもむしろヘッドに取り付けて滞在して外れます。したがって、胸ひれを引っ張っ顕微鏡下から心臓を同定することができるようにする。離れて心膜を囲むから心臓を切開する際に最後に、心臓自体を把握しないようにしてください。代わりに、心膜の2枚を把握し、もろい心膜よりも多くの構造的完全性があり、心臓から離れて、それらの両方を引く。このようにして、心臓にさえ最小限の損傷を回避することができる。

心臓はその形状および収縮によって容易に識別すべきである。心臓を見つけるの追加の補助として、一方が蛍光解剖顕微鏡下で蛍光タンパク質を発現する心臓を分析することができる。これは通常必要ではないですが、初心者のための、および/または非常に小さい心臓の解剖のために有用であり得る。

;この手法の1つの制限は、3週齢よりも若い、 すなわち 、小魚から心を解剖、困難なことである他の技術は、幼虫の解剖9のために設計されている。また、球部aを切開することが容易である一方互いにrteriosus、心房および心室は、それ自身の上で房室弁を解剖することは不可能である。バルブは、ほとんどの場合、心室に付着したままである。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Small tank for transporting fish Aquaneering ZHCT100
Fish net Petsmart 36-16731
250 ml glass beaker Kimble 14005-250
9 cm polystyrene Petri dish Nunc 172958
Razor blade Personna American Safety Razor Company 94-120-71
2 Dumont #5SF forceps Fine Science Tools 11252-00
Dissecting microscope Olympus SZX16
Tricaine Sigma A-5040
Plastic transfer pipette Thermo Scientific 202-20S
Gooseneck light source Dolan-Jenner Industries, Inc Fiber-Lite 180 Illuminator, 181 Dual Gooseneck System
Fluorescent light source Lumen Dynamics X-Cite 120Q optional
Micro-scissors Biomedical Research Instruments, Inc 11-1000 optional
RBC lysis buffer eBioscience 00-4333-57 optional

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References

  1. Arnaout, R., et al. Zebrafish model for human long QT syndrome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, (27), 11316-11321 (2007).
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Arnaout, R., Reischauer, S., Stainier, D. Y. R. Recovery of Adult Zebrafish Hearts for High-throughput Applications. J. Vis. Exp. (94), e52248, doi:10.3791/52248 (2014).More

Arnaout, R., Reischauer, S., Stainier, D. Y. R. Recovery of Adult Zebrafish Hearts for High-throughput Applications. J. Vis. Exp. (94), e52248, doi:10.3791/52248 (2014).

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