Introduction
Feridas cutâneas fetais curar rapidamente e scarlessly até o final da gestação 1. Fetal reparação ferida scarless é caracterizada pela regeneração da arquitetura do tecido normal e função. A transição de uma scarless a cicatrizes fenótipo ocorre no terceiro trimestre da gravidez em seres humanos e por volta do dia embrionário 18 (E18) em ratos 2,3. Em comparação com a de adultos, a reparação de feridas fetal é caracterizada pela rápida epitelização, a deposição de tecido conjuntivo, e a migração de fibroblasto.
Muitos estudos têm oferecido possíveis explicações para o fenômeno da cicatrização de feridas scarless durante o desenvolvimento fetal precoce. A inflamação é um componente fundamental de reparação de feridas de adultos; No entanto, as feridas do feto são caracterizadas por uma ausência de inflamação aguda 4. Se isto é uma conseqüência da imaturidade funcional do sistema imunológico durante os estágios fetais permanece obscuro. Um estudo recente sugere que as diferenças na abundância, maturity, e a função de mastócitos em E15 vs pele fetal E18 podem ser responsáveis para a transição de um fenótipo sem cicatrizes, pelo menos no rato 3. Outros estudos sustentam que as diferenças nas propriedades e abundância de macrófagos feridas fetais e adultos são responsáveis pela reforma da matriz extracelular normal (ECM) durante a reparação de feridas fetal 5.
Diferenças em fatores ambientais durante o desenvolvimento fetal e adulto também pode afetar a reparação de feridas. Longaker e seus colegas mostraram que o líquido da ferida de o feto possui altos níveis de atividade estimulante ácido hialurônico comparado a nenhum adulto na ferida fluido 6. Consequentemente, os níveis mais elevados de ácido hialurónico, um glicosaminoglicano que promove um microambiente propício à motilidade e proliferação celular, no ambiente da ferida fetal pode ser responsável pelo fenótipo scarless visto durante o desenvolvimento fetal precoce. Outras linhas de evidência apontam para o fato de que o fetaambiente l ferida é relativamente hipoxêmica e submerso no líquido amniótico estéril rico em fatores de crescimento 7. No entanto, nenhuma resposta definitiva foi fornecido para um evento crítico ou fator durante a embriogênese que dispara a transição de regeneração scarless para reparação fibrótica.
A compreensão dos mecanismos responsáveis pela cura scarless no feto necessita de um modelo preciso e reprodutível. Aqui nós detalhe um modelo reprodutível de scarless cicatrização de feridas fetal no dorso de E16.5 (scarless) e embriões E18.5 (cicatrização) do mouse. Além disso, pequenas variações deste modelo pode ser utilizado para executar uma série de outros estudos, como a análise de feridas fetais e 8,9 pele expressão gênica. Dado que as gravidezes precisamente cronometradas são críticos para recapitulação sucesso deste modelo de cicatrização fetal scarless ferida, nós também detalhe nosso protocolo para gestações de superovulação cronometrado.
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Protocol
NOTA: Todos os procedimentos descritos neste trabalho são realizados de acordo com as diretrizes estabelecidas pelo Painel Administrativo Stanford em Laboratory Animal Care (APLAC).
1. Temporário Gestações - Técnica superovulação (Figura 1)
NOTA: Precisamente cronometrar a idade gestacional de embriões de camundongos para a cirurgia fetal em E16.5 e E18.5 é de importância crítica. Nesta seção, detalhe nosso protocolo para cronometrar gestações rato usando grávida éguas soro (PMS) e gonadotrofina coriônica humana (HCG) injeções para induzir superovulação.
- Injectar camundongos fêmeas (<5 por gaiola) por via intraperitoneal (IP) com 3,0-5,0 unidades internacionais (UI) de PMS em um volume de 100 l PBS 01:00 - 15:00 para o dia 1.
- Entre as 12:00 e as 14:00 do dia 3 (quarenta e cinco a 47 horas após a injecção de PMS), injectar ratinhos fêmea IP com 3,0-5,0 UI de HCG em um volume de 100 ul de PBS.
NOTA: Os induz injeção de HCG ovulação, aproximadamente, 12 h pós-injecção. - Imediatamente após injeções de HCG, companheiro fêmeas com machos com idade entre 8-16 semanas.
ATENÇÃO: Nós normalmente colocar duas fêmeas em uma gaiola de machos individuais. - Fêmeas separados de homens na manhã do dia 4 (06:00 - 10:00) e registro como E0.5 idade fetal.
NOTA: plugs vaginais pode ser verificado neste momento; No entanto, a observação de um plug vaginal não garante a gravidez e as fêmeas podem engravidar quando nenhum plug é observado. Tendo em conta que a gravidez é normalmente observada por inspeção e / ou palpação visual em idades gestacionais E16.5 e E18.5, verificação de fichas vaginais na manhã do dia 4 não é estritamente necessário. Na nossa experiência, e, dependendo da estirpe, aproximadamente 30-50% das mulheres super-ovulado engravidar utilizando a técnica aqui descrita.
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Figura 1. Esquema de Técnica superovulação. Procedimento exibição Esquema de superovulação cronometrado gestações em camundongos. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
2. Cirurgia Fetal Murino (Dorsal o ferimento) em E16.5 e E18.5 embriões (Figura 2)
- Antes do procedimento, limpe todas as superfícies da sala de cirurgia e equipamentos com 70% de álcool isopropílico. Além disso, todos os fornecimentos esterilizar instrumentos cirúrgicos e que serão utilizados no processo de autoclavagem por eles. Algumas instituições podem permitir o uso posterior de esterilização quente talão. Por operação, use embalagens esterilizadas que incluem gaze e instrumentos cirúrgicos.
- Induzir a anestesia em mães grávidas (E16.5 idade fetal ou E18.5) sob 2,5% de mistura de isoflurano / oxigênio a 2 L por min seguido de manutenção da anestesia em 1 L por min.
- Para conempresa anesthetization adequado, garantir os reflexos profundos pedal do mouse são suprimidas e coloque o mouse na posição prona.
- Aplique uma pomada oftálmica vet como Puralube para evitar irritação nos olhos ou secura durante o procedimento.
- Prepare abdômen pela administração de uma leve aplicação de creme depilatório para não mais do que 30 segundos (Figura 2A).
- Prepare abdômen para a cirurgia asséptica com iodopovidona e álcool (Figura 2B e 2C).
- Execute linha média laparotomia sob o microscópio com tesoura microcirúrgica (Figura 2D e 2E).
- Gentilmente expor útero e feto selecionados para a cirurgia (Figura 2F).
- Lavar campo cirúrgico com água morna (38 ° C) solução salina tamponada com fosfato (PBS) utilizando uma agulha de ponta romba
NOTA: Pode ser feita dobrando cuidadosamente a ponta de uma agulha de grande calibre. (Figura 2G e 2H). - Posicionar o feto de uma maneira que permitas acesso total ao dorso.
- Passe um ponto cordão da bolsa utilizando sutura 7-0 nylon através do útero que cobre o local do ferimento dorsal pretendido (Figura 2I). Posição de fio de bolsa ao longo de uma região dorso para a esquerda ou direita da espinal medula, e em uma região da parede uterina desprovida de vasos sanguíneos grandes.
- Faça uma incisão três milímetros através da parede uterina e saco amniótico, no centro do cordão da bolsa (Figura 2J).
- Irrigar local da incisão com água morna (38 ° C) PBS.
- Com uma tesoura de microcirurgia, cortar uma única ferida excisional de espessura total, aproximadamente 1 mm de comprimento, no dorso do feto.
- Delicadamente, local da incisão secar com algodão-ponta do aplicador.
- Injectar 3 ul volume de nanquim subcutaneamente no local da ferida para marcar o local da ferida (Figura 2K).
- Lavar com água morna (38 ° C) para assegurar PBS tinta foi retido no interior do sítio da ferida.
- Já cirúrgico assistente inject quente (38 ° C) PBS através de ponta romba 10 G seringa no saco amniótico como o cordão da bolsa é fechada (Figura 2L). Retrair seringa como cadeia de fecho da bolsa se aproxima da conclusão (Figura 2 M).
- Suavemente útero voltar para dentro da cavidade abdominal (Figura 2N).
- Evert pele e peritônio.
- Já assistente cirúrgico irrigar cavidade abdominal com água morna (38 ° C) PBS.
- Fechar abdômen rapidamente por grampeamento pele e peritônio fechado (Figura 2O). O fecho de padrão é executada em duas camadas; peritoneu e da musculatura abdominal numa camada, tecido subcutâneo e pele na segunda camada. Para sacrifício imediato e colheita do feto, a nossa demonstração mostra o encerramento, em uma camada.
- Colocar o animal sob observação numa incubadora quente regulado a 37 ° C durante 30 minutos ou até que o animal recupera a consciência suficiente para manter decúbito esternal.
- Não return o animal para a companhia de outros animais até que ele está totalmente recuperado do procedimento.
- Quando acordarmos da anestesia e durante a subsequente 48 horas, administrar a injecção subcutânea de buprenorfina (0,05 mg / kg) a cada 12 horas, para a analgesia conforme necessário, com base na avaliação da dor. Administrar carprofeno (5 mg / kg) via injecção subcutânea para o alívio da dor adicional de pós-operatório, conforme necessário.
- Retorno animais na gaiola e dar-lhes comida e água ad libitum.
- Acompanhar de perto para manifestações de dor.
- 48 horas após a cirurgia, sacrificar mãe grávida com uma overdose de isoflurano e colheita feridos feto. A fim de fazer isso, ajustar a concentração de isoflurano a 5% ou superior e manter a exposição durante 1 min após a cessação da respiração. Confirme a eutanásia com luxação cervical. Colher um embrião sem ferimentos para o controle pareados por idade. Embriões tardias devem ter um método separado da eutanásia consistente com as recomendações IACUC, como decapitação, luxação cervical, ou injeção de produtos químicos.
Figura 2. Esquema de Cirurgia Murino Fetal. Etapas gerais para dorsal ferindo em E16.5 e E18.5 embriões de rato. (A) Depilação de rato abdômen. (B e C) Preparação de rato abdômen. (D) Microscópio usado para cirúrgico procedimento. (E) Midline laparotomia. (F) A exposição de útero. (G) Criação de agulha de ponta romba. (H) Irrigação do útero com soro fisiológico morno. (I) Criação de cordão da bolsa de sutura. (J) incisão através uterino de parede e 1 mm de geração ferida excisional espessura total. (K) A injecção subcutânea de nanquim. (L e M) Encerramento do cordão da bolsa de sutura. (N e O)Encerramento do abdômen. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Representative Results
Para a análise histológica, feridas cutâneas na pele dorsal de embriões de camundongos E16.5 e E18.5 devem ser colhidas 48 horas após o ferimento, fixadas em 4% PFA, e embebidos em parafina. Em modelos transgênicos fluorescentes, a criopreservação com outubro pode ser apropriado. Existem várias manchas que podem ser utilizados para visualizar arquitectura do tecido conjuntivo e celular. HE é uma mancha de duas cores que mancha núcleos azuis e estruturas eosinofílica (ie., Citoplasma e colágeno extracelular) vários tons de vermelho, rosa e laranja. Tricrômico de Mallory é uma mancha de três cores que consiste em azul de anilina, fuschin ácido e laranja G, o mais adequado para distinguir as células de tecido conjuntivo circundante.
Figura 3. Histologia de Feridas Scarless E16.5 fetal. (A) de hematoxilina e eosina reveals completa reepitelização e um ligeiro aumento no número de células inflamatórias presentes (setas). (100x; bar = 100 mm) (B) mancha Eosina mostra nanquim (setas) em torno de regeneração folículos pilosos (seta) (400x; bar = 25 . mm) (tricrômico C) de Mallory revela um padrão fine reticular colágeno dérmico com a presença de um folículo piloso (400x; bar = 25 mm). Reproduzido com permissão de Colwell et al. 10 Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Se feridas excisionais dorsais são de tamanho adequado (1 mm) e profundidade (de espessura completa), hematoxilina e eosina irá revelar que cura da pele E16.5 com formação mínima de cicatrizes, completa reepitelização, e apenas um pequeno aumento do número de doenças inflamatórias células (Figura 3A). Além disso, estes Wounds deve curar com arquitetura aproximadamente normal da pele e contêm regenerar folículos pilosos no local da lesão (setas; Figura 3B). A aplicação correcta da india tinta na ferida recém-criado deve resultar na deposição de tinta no local da lesão (cabeças de seta; Figura 3B). Finalmente, tricrômico de coloração deve revelar uma multa reticular dérmica de colágeno padrão característico da derme unscarred (Figura 3C).
Figura 4. Histologia de Feridas Scarring E18.5 fetal. (A) Coloração de Hematoxilina-eosina revela um aumento na coloração de eosina na derme no local da lesão (setas). (200x; bar = 50 pm) (B) tricromo de Mallory mostra colagénio denso dérmica (setas) (400x; barra = 25 mm). Reproduzido com permissão de Colwell et al.10
Em comparação com feridas feitas em E16.5, hematoxilina e eosina de feridas dorsais feitas em E18.5 e colhidas 48 horas após o ferimento deve revelar uma cicatriz densa com perda da arquitectura normal da pele no local da lesão (Figura 4A). Da mesma forma, trichrome coloração revela um padrão de deposição de colágeno denso desorganizado (setas; Figura 4B). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O protocolo cirúrgico aqui apresentado descreve um modelo excisional de fetal cura scarless murino publicado pela primeira vez em 2006 por nosso laboratório 10. Em adição a outros modelos estabelecidos da ferida excisional 11, modelos incisionais de cicatrização sem cicatrizes murino fetal existir como bem 12,13. As investigações sobre a cicatrização de feridas scarless fetal no macaco, cordeiro, coelho, gambá, e rato têm sido relatados 14-17. No entanto, os ratos representam um modelo ideal para explorar fetal cura scarless ferida devido ao seu custo relativamente baixo per-diem gaiola e genoma bem caracterizado. Além disso, a perda / ganho genético temporal e espacial da função pode ser alcançado durante o desenvolvimento embrionário usando murino oferecendo oportunidades sistemas transgênicos para decifrar com precisão os mecanismos de reparo scarless.
Apesar destas vantagens, os ratos apresentam alguns desafios técnicos durante a cirurgia fetal, devido ao seu pequeno tamanho. Considerando aestresse da anestesia em uma mãe grávida, deve ser tomado muito cuidado para monitorar o nível de isoflurano / oxigênio que está sendo administrado. Uma mistura de 2,5% de isoflurano / oxigénio a 2 L por min, seguido por manutenção da anestesia em 1 L por min devem ser cuidadosamente observadas. Desvios ou flutuações neste fator crítico pode afetar significativamente a morbidade. O posicionamento adequado da sutura em bolsa representa o aspecto mais desafiador tecnicamente da cirurgia. Falha em colocar este ponto corretamente irá resultar em vazamento de líquido amniótico e PBS pós-fechamento. Um volume inadequado de fluido no útero irá resultar em trauma para os embriões e pode induzir a contracção uterina prematura. Por este motivo, a reposição de fluido amniótico perdido aquando da abertura do útero é também um passo crítico neste modelo cirúrgico. Cuidados devem ser tomados para ejetar continuamente PBS quente como o cordão da bolsa é fechada. Esses fatores necessária solução de problemas significativos e enfatizamos que a atenção a estes detalhesirá aumentar a probabilidade de uma cirurgia bem sucedida. No entanto, mesmo aqueles com mãos cirúrgicas experientes devem planejar para uma taxa de morbidade de aproximadamente 40% em fetos E16.5.
Compreender fetal cura scarless ferida tem valor para a medicina translacional destinada a modulação in vivo de comportamento fibrogenic durante estágios adultos de desenvolvimento. Em comparação com a pele de um adulto, a pele fetal tem uma derme em desenvolvimento, força de tração reduzida, folículos pilosos nascentes, e diferentes componentes da MEC 2,4. Pele Fetal tem uma relação elevada de colágeno tipo III para o tipo I em comparação a pele de um adulto, menos e menos maduros mastócitos, expressão de Keratins 8 e 19, e níveis mais altos de ácido hialurônico em comparação com 4,9 pele de um adulto. Ao decifrar os mecanismos subjacentes a cura sem cicatrizes no feto, podemos começar a orientar as vias moleculares e celulares responsáveis pela fibrose no adulto para um fenótipo regenerativa. A emergência of rastreamento linhagem e outras ferramentas genéticas em camundongos abriram novos caminhos promissores para a investigação de scarless cicatrização de feridas fetal. Dadas as inerentemente altas taxas de morbidade e contração uterina precoce associada à cirurgia fetal, investigações de pele scarless fetal cicatrização de feridas in vivo exigem um modelo cirúrgico preciso e repetível. Aqui nós detalhe um modelo reprodutível de scarless cicatrização de feridas fetal no dorso de E16.5 (scarless) e embriões E18.5 (cicatrização) do mouse.
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Acknowledgments
Este trabalho foi financiado em parte por uma concessão do NIH concessão R01 GM087609 (para HPL), um presente de Ingrid Lai e Bill Shu em honra de Anthony Shu (para HPL), NIH concessão U01 HL099776 (para MTL), o Laboratório Hagey para Pediatric Regenerative Medicine e The Oak Foundation (para MTL e HPL). GGW foi apoiado pela Escola de Medicina de Stanford, o Programa de Formação de Stanford Medical Scientist, e uma bolsa de formação NIGMS GM07365. MSH foi apoiada por CIRM Clinical Fellow Training Grant TG2-01159. WXH foi apoiado pelo financiamento da Fundação Sarnoff Cardiovascular.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 7-O MONOSOF Suture | eSuture | SN-1647G | |
| Surgical Forceps | Kent Scientific | INS650916 | |
| Micro-scissors | Kent Scientific | INS600127 | |
| Autoclip 9 mm | Texas Scientific Instruments | 205060 | |
| Insulin Syringe | Thermo Fisher Scientific | 22-272-382 | |
| Black Pigment | AIMS | 242 | |
| BD Safety-Lok 3 ml Syringe | BD Biosciences | 309596 | |
| Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 10010-049 | |
| OPMI-MD Surgical Microscope | Carl Zeiss Surgical Inc | ||
| Pregnant Mares Serum (PMS) | Millipore | 367222 | |
| Human Chorionic Gonadotropin (HCG) | Sigma-Aldrich | CG10 | |
| Povidone Iodine Prep Solution | Dynarex | 1415 | |
| Nair (depilatory cream) | Church and Dwight Co. | 22600267058 |
References
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