Introduction
Эмбриональные кожные раны быстро и scarlessly не лечить, пока в конце беременности 1. Плода шрамов заживления раны характеризуется регенерации нормальной структуры и функции ткани. Переход от шрамов на фенотип рубцов происходит в третьем триместре беременности у человека и вокруг эмбриональный день 18 (E18) у мышей 2,3. По сравнению с взрослым, плода заживления раны характеризуется быстрой эпителизации, осаждения соединительной ткани, и миграции фибробластов.
Многие исследования предложили возможные объяснения феномена шрамов заживления ран во время раннего развития плода. Воспаление является основным компонентом взрослого заживления раны; Однако, фетальные раны характеризуется отсутствием острого воспаления 4. Является ли это следствием функциональной незрелости иммунной системы в период внутриутробного этапах остается неясным. Недавнее исследование показало, что различия в численности, коврикurity и функции тучных клеток в E15 против E18 кожу плода может быть причиной для перехода от шрамов фенотипа, по крайней мере, у мышей 3. Другие исследования постулируют, что различия в свойствах и обилие плода и взрослого раны макрофагов несут ответственность за реформирование нормальной внеклеточного матрикса (ЕСМ) в период внутриутробного заживления ран 5.
Различия в экологических факторов в период внутриутробного и взрослых развития также может влиять на заживление ран. Longaker и его коллеги показали, что жидкость из раны от плода обладает высоким уровнем активности гиалуроновой кислоты, стимулирующие сравнению ни с у взрослых жидкость из раны 6. Следовательно, более высокие уровни гиалуроновой кислоты, гликозаминогликанов, что способствует микросреду, способствующую подвижности клеток и пролиферации в плода раны окружающей среды, могут быть ответственны за шрамов фенотипа видели во время раннего развития плода. Другие линий доказательств указывают на тот факт, что фетал рана окружающей среды относительно гипоксемической и погружают в стерильном амниотической жидкости, богатой факторами роста 7. Тем не менее, окончательного ответа не было предоставлено для критического случая или фактора во время эмбриогенеза, что вызывает переход от шрамов регенерацию фиброзной ремонта.
Понимание механизмов, ответственных за шрамов исцеления у плода требует точного и воспроизводимого модель. Здесь мы подробно воспроизводимая модель плода шрамов заживления ран в тыльной E16.5 (шрамов) и эмбрионов E18.5 (рубцов) мыши. Кроме того, незначительные вариации этой модели могут быть использованы для выполнения ряда дополнительных исследований, таких как анализ экспрессии генов плода ран и 8,9 кожи. Учитывая, что именно своевременная беременность имеют решающее значение для успешного рекапитуляции этого плода шрамов модели заживления раны, мы также подробно наш протокол для суперовуляции приурочен беременности.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры, описанные в этой статье, осуществляются в соответствии с руководящими принципами, установленными Административным панели Стэнфорда, на лабораторных животных (APLAC).
1. Временный Беременность - суперовуляции Техника (Рисунок 1)
ПРИМЕЧАНИЕ: Точно рассчитывая гестационный возраст эмбрионов мыши для фетальной хирургии в E16.5 и E18.5 имеет решающее значение. В этом разделе мы подробно наш протокол для синхронизации беременности мыши, используя беременных кобыл сыворотки (ПМС) и человеческий хорионический гонадотропин (ХГЧ) инъекции, чтобы побудить суперовуляции.
- Вводите самок мышей (<5 на клетку) внутрибрюшинно (IP) с 3,0-5,0 международных единиц (МЕ) ПМС в объеме 100 мкл PBS между 1:00 и 3:00 вечера на 1 день.
- Между 12:00 и 2:00 вечера 3 дня (сорок пять 47 часа после PMS инъекций), вводят самкам мышей IP с 3,0-5,0 МЕ ХГЧ в объеме 100 мкл PBS.
ПРИМЕЧАНИЕ: инъекции HCG индуцирует овуляция примерно 12 ч после инъекции. - Сразу же после HCG инъекций, приятель самок с самцами в возрасте 8-16 недель.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мы обычно помещают две женщины в клетку отдельных мужчин. - Отдельные самки от самцов на утро 4 день (6:00 - 10:00 утра) и записи как возраст плода E0.5.
ПРИМЕЧАНИЕ: Вагинальные свечи могут быть проверены в это время; Однако, наблюдение влагалища вилки не гарантирует беременность и женщины могут забеременеть, когда не наблюдается пробка. Учитывая, что беременность является, как правило, наблюдается при визуальном осмотре и / или пальпации в гестационный возраст E16.5 и E18.5, проверяя вагинальных пробок на утро 4 дня не является строго необходимым. По нашему опыту, и в зависимости от штамма, примерно 30-50% супер-овуляция женщин забеременеть с помощью методики, описанной здесь.
PG "/>
Рисунок 1. Схема для суперовуляции техники. Процедура Схематическое изображение для суперовуляции приурочен беременности у мышей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
2. Мышиный фетальной хирургии (Спинной Ранение) на E16.5 и E18.5 эмбрионов (Рисунок 2)
- Перед процедурой очистите все поверхности операционной и оборудования с 70% изопропилового спирта. Кроме того, стерилизовать все хирургические материалы и инструменты, которые будут использоваться в порядке, в автоклаве их. Некоторые учреждения могут позволить последующее использование горячей стерилизации шарик. На операцию, используйте стерильные пакеты, которые включают марлю и хирургические инструменты.
- Анестезии у беременных матерей (возраст плода E16.5 или E18.5) под 2,5% смеси ИФ / кислорода в 2 л в мин, а затем обслуживания анестезии на 1 л в мин.
- Конфирма надлежащее обезболивание, убедитесь, что глубокие водные рефлексы мыши подавляются и поместите курсор в положении лежа.
- Применить ветеринар глазной мази, такие как Puralube, чтобы предотвратить раздражение глаз или сухости во время процедуры.
- Подготовка живота путем введения применения света для удаления волос крем не более чем на 30 сек (рис 2А).
- Подготовка живота для асептического операции с повидон-йодом и спиртом (рис 2В и 2С).
- Выполните срединной лапаротомии под микроскопом, используя микрохирургические ножницы (рис 2D и 2E).
- Аккуратно выставить матки и плода, выбранный для хирургии (рис 2F).
- Промывать операционное поле с теплой (38 ° С) фосфатно-солевом буфере (PBS) с использованием тупым кончиком иглы
ПРИМЕЧАНИЕ: Можно быть тщательно изгиба кончик большого диаметра иглы. (Рис 2G и 2H). - Расположите плод таким образом, чтобы позволитьполный доступ к тыльной.
- Пройдите кошелек строку стежок, используя 7-0 нейлона шов через матку, покрывающей сайт, предназначенных спинной ранения (рис 2I). Должность кошелек строка по области спины слева или справа от спинного мозга, а в области стенки матки, лишенного крупных кровеносных сосудов.
- Сделайте 3 мм разрез через стенку матки и амниотической в центре кошелька строки (рис 2J).
- Промывать место разреза с теплой (38 ° С) PBS.
- Использование микрохирургических ножницы, вырезать отдельную всю толщину эксцизионной рану, около 1 мм в длину, в спинке плода.
- Аккуратно пятном на сайте разрез насухо хлопка наконечником аппликатора.
- Вводите 3 мкл объема тушью подкожно в месте раны, чтобы отметить расположение раны (рис 2K).
- Промыть теплой (38 ° С) PBS, чтобы обеспечить чернила были сохранены в месте раны.
- Есть Операционная медсестра Inject теплой (38 ° C) PBS через тупой наконечник 10 G шприца в амниотической как кошелек строки закрывается (рис 2L). Уберите шприц как закрытие кошелек строка близится к завершению (Рисунок 2 м).
- Осторожно вернуть матку в брюшную полость (рис 2N).
- Эверт кожи и брюшины.
- У орошения хирургического помощник брюшную полость теплой (38 ° С) PBS.
- Закрыть живот быстро сшивания кожи и брюшины закрыта (рис 2О). Стандартный затвор выполняется в два слоя; брюшины и брюшной мышцы в один слой, подкожную ткань и кожу во втором слое. Для немедленного жертвы и уборки плода, наша демонстрация показывает замыкание в одном слое.
- Место животное под наблюдением в теплом инкубаторе при 37 ° С в течение 30 мин или пока животное восстанавливает достаточную для поддержания сознания грудины лежачее положение.
- Не RETурны животное в компании других животных, пока он полностью не оправился от этой процедуры.
- После пробуждения от наркоза и в течение последующего 48 ч, вводить подкожную инъекцию бупренорфина (0,05 мг / кг) каждые 12 ч в обезболивании при необходимости на основе оценки боли. Администрирование карпрофена (5 мг / кг) с помощью подкожной инъекции для дополнительной послеоперационной боли по мере необходимости.
- Вернуться животных в клетку и дать им пищу и воду без ограничений.
- Следить за проявлениями боли.
- 48 ч после операции, пожертвовать беременная мать с передозировкой изофлуран и сбора урожая раненых плода. Для того чтобы сделать это, отрегулировать изофлуран концентрации до 5% или выше и поддерживать экспозиции в течение 1 мин после остановки дыхания. Подтвердите эвтаназию с цервикальной дислокации. Урожай в единой раны эмбриона для соответствующего возраста контролем. Поздние эмбрионы должны иметь отдельный метод эвтаназии в соответствии с рекомендациями IACUC, таких как деподушной шейки дислокации или нагнетания химических реагентов.
Рисунок 2. Схема мышиный фетальной хирургии. Общие шаги для спинного ранены в E16.5 и эмбрионов E18.5 мыши. () Депиляция мыши живота. (B и C) Получение мыши живота. (D) Микроскоп используется для хирургической Процедура. (E) срединной лапаротомии. (F) выходят из матки. (G) Создание тупым кончиком иглы. (H) Орошение матки с теплой физиологического раствора. (I) Создание кошелька струн шва. (J) разрез через маточное стеновые и 1 мм по всей толщине поколения эксцизионная рану. (K) Подкожное введение тушью. (L и M) Закрытие кошелек строки шва. (N и O)Закрытие живота. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Для гистологического анализа, кожные раны в спинной кожи E16.5 и E18.5 эмбрионов мыши следует собирают 48 ч после ранения, фиксировали в 4% PFA, и в парафин. В люминесцентных трансгенных моделей, криоконсервация с октября может быть целесообразно. Есть несколько пятен, которые могут быть использованы для визуализации клеточного и соединительной ткани архитектуру. Гематоксилин-эозином является двухцветный пятно, что пятна ядер синий и эозинофильных структуры (т.е.., Цитоплазма, и внеклеточный коллаген) различные оттенки красного, розового и оранжевого цвета. Трихромом Мэллори является трехцветный пятно, состоящее из анилина синий, кислоты fuschin и оранжевый G, лучше всего подходит для выделения клеток из окружающей соединительной ткани.
Рисунок 3. Гистология шрамов E16.5 эмбриональных ран. () Гематоксилином и эозином пятно ReVeals полная реэпителизации и умеренное увеличение количества воспалительных клеток, присутствующих (стрелки). (100x; бар = 100 мкм) (B) Eosin пятно показывает тушь (стрелки) вокруг регенерирующих волосяные фолликулы (стрелки) (400x; бар = 25 . мкм) (трихромом пятно C) Мэллори раскрывает тонкую сетчатую кожного коллагена шаблон с наличием волосяного фолликула (400x; бар = 25 мкм). Печатается с разрешения Colwell и др. 10 Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Если спинной эксцизионная раны соответствующего размера (1 мм) и глубиной (полный толщины), гематоксилином и эозином покажет, что лечит E16.5 кожи с минимальным рубцов, полная реэпителизации, и лишь небольшое увеличение числа воспалительных Клетки (3А). Кроме того, эти WounDS исцелил примерно с нормальной архитектуры кожи и содержат регенерации волосяных фолликулов в зоне повреждения (стрелки, рис 3B). Правильное применение тушью на только что созданном ране должно привести к отложению чернил на месте травмы (наконечники стрел, рисунок 3б). Наконец, трихромом окрашивание должно выявить тонкую ретикулярная кожного коллагена рельеф, характерный для Неуязвимый дермы (рис 3в).
Рисунок 4. Гистология Рубцы E18.5 эмбриональных ран. (А) гематоксилином и эозином пятно показывает увеличение окрашивания эозином в дерме на месте повреждения (стрелки). (200x; бар = 50 мкм) (В) трихромом пятна Mallory показывает плотную кожного коллагена (стрелки) (400X; бар = 25 мкм). Печатается с разрешения Colwell и др.10
По сравнению с ран, сделанных на E16.5, гематоксилином и эозином спинных ран, сделанных на E18.5 и собирают 48 ч после ранения должен выявить плотный рубец с потерей нормальной структуры кожи в месте повреждения (рис 4а). Кроме того, трихромом окрашивание показывает плотную структуру неорганизованной отложение коллагена (стрелки, рисунок 4б). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Хирургическое протокол, представленные здесь описывается эксцизионная модель плода мышиный шрамов исцеления впервые опубликованной в 2006 году нашей лаборатории 10. В дополнение к другим установленным моделей эксцизионная ранения 11, Инцизионная модели плода мыши исцеления шрамов существуют также 12,13. Исследования плода шрамов заживления ран в обезьяннике, баранины, кролика, опоссума, и крысы были зарегистрированы 14-17. Однако мыши, представляют собой идеальную модель для изучения плода исцеление шрамов раны из-за их сравнительно низкой стоимостью, суточные клетку и хорошо характеризуется генома. Кроме того, временная и пространственная генетическая потеря / прибыль функции может быть достигнуто в ходе эмбрионального развития с помощью мышиных возможности трансгенные систем, в которых точно расшифровать механизмы шрамов ремонта.
Несмотря на эти преимущества, мыши Приведем некоторые технические проблемы во время фетальной хирургии из-за их малого размера. Учитываястресс анестезии на беременной матери, большое внимание должно быть принято, чтобы контролировать уровень ИФ / кислорода, вводимого. Смесь 2,5% изофлуран / кислорода в 2 л в минуту с последующим обслуживания анестезии на 1 л в минуту должны быть тщательно соблюдены. Отклонения или колебания в этом критический фактор может существенно повлиять заболеваемости. Правильное размещение кисетный шов представляет собой наиболее технически сложным аспектом операции. Отказ поставить этот стежок правильно приведет к утечке амниотической жидкости и PBS после закрытия. Недостаточное количество жидкости в полость матки может привести к травме в эмбрионов и может вызвать преждевременное сокращение матки. По этой причине, замена амниотической жидкости, теряемой при открытии матки также важным шагом в этом хирургического модели. Необходимо соблюдать осторожность, чтобы непрерывно извлекать тепло PBS, а кошелек строка закрыта. Эти факторы необходимо значительное поиск и устранение неисправностей мы подчеркиваем, что внимание на эти деталиувеличит вероятность успешной операции. Тем не менее, даже те, с опытными хирургических центрах должны планировать заболеваемости примерно 40% в E16.5 эмбрионов.
Понимание плода исцеление шрамов раны имеет значение для поступательного медицины, направленной на модуляции в естественных условиях фиброгенной поведения во взрослом стадиях развития. По сравнению с взрослой кожи, кожу плода имеет развивающимся дермы, уменьшается прочность на растяжение, зарождающиеся волосяных фолликулов, а также различные компоненты ECM 2,4. Кожу плода имеет повышенный коэффициент коллагена типа III для типа I в сравнении с взрослой кожи, меньше и менее зрелых тучных клеток, экспрессии кератинов 8 и 19, и более высокие уровни гиалуроновой кислоты по сравнению с взрослой 4,9 кожи. По расшифровке механизмов, лежащих в основе шрамов исцеления у плода, мы можем начать управлять молекулярные и клеточные пути, ответственные за фиброза у взрослых к регенеративным фенотипа. Появление оF Lineage отслеживания и другие генетические инструменты на мышах открыли новые перспективные направления для исследования плода шрамов заживления ран. Учитывая изначально высокие темпы заболеваемости и преждевременной матки сокращения связанных с фетальной хирургии, исследования плода шрамов кожи заживление ран в естественных условиях требуют точного и воспроизводимого хирургического модель. Здесь мы подробно воспроизводимая модель плода шрамов заживления ран в тыльной E16.5 (шрамов) и эмбрионов E18.5 (рубцов) мыши.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Эта работа была частично поддержана грантом NIH грант R01 GM087609 (до HPL), подарок от Ингрид Лай и Билл Шу в честь Энтони Шу (до HPL), NIH грант U01 HL099776 (до MTL), в Hagey лаборатории Детская регенеративной медицины и Oak Foundation (в MTL и HPL). GGW была поддержана Стэнфордской школы медицины, программы обучения Стэнфордского ученый-медик, и NIGMS субсидия на обучение GM07365. MSH была поддержана CIRM Клиническая сотрудник субсидия на обучение TG2-01159. WXH была поддержана финансирование из Сарнов сердечно-сосудистой фонда.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 7-O MONOSOF Suture | eSuture | SN-1647G | |
| Surgical Forceps | Kent Scientific | INS650916 | |
| Micro-scissors | Kent Scientific | INS600127 | |
| Autoclip 9 mm | Texas Scientific Instruments | 205060 | |
| Insulin Syringe | Thermo Fisher Scientific | 22-272-382 | |
| Black Pigment | AIMS | 242 | |
| BD Safety-Lok 3 ml Syringe | BD Biosciences | 309596 | |
| Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 10010-049 | |
| OPMI-MD Surgical Microscope | Carl Zeiss Surgical Inc | ||
| Pregnant Mares Serum (PMS) | Millipore | 367222 | |
| Human Chorionic Gonadotropin (HCG) | Sigma-Aldrich | CG10 | |
| Povidone Iodine Prep Solution | Dynarex | 1415 | |
| Nair (depilatory cream) | Church and Dwight Co. | 22600267058 |
References
- Larson, B. J., Longaker, M. T., Lorenz, H. P. Scarless fetal wound healing: a basic science review. Plastic and reconstructive surgery. 126, 1172-1180 (2010).
- Wilgus, T. A. Regenerative healing in fetal skin: a review of the literature. Ostomy/wound management. 53, 16-31 (2007).
- Wulff, B. C., et al. Mast cells contribute to scar formation during fetal wound healing. The Journal of investigative dermatology. 132, 458-465 (2012).
- Lorenz, H. P., Adzick, N. S. Scarless skin wound repair in the fetus. The Western journal of medicine. 159, 350-355 (1993).
- Longaker, M. T., et al. Wound healing in the fetus. Possible role for inflammatory macrophages and transforming growth factor-beta isoforms. Wound repair and regeneration : official publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 2, 104-112 (1994).
- Longaker, M. T., et al. Studies in fetal wound healing. IV. Hyaluronic acid-stimulating activity distinguishes fetal wound fluid from adult wound fluid. Annals of surgery. 210, 667-672 (1989).
- Colombo, J. A., Napp, M., Depaoli, J. R., Puissant, V. Trophic influences of human and rat amniotic fluid on neural tube-derived rat fetal cells. International journal of developmental neuroscience : the official journal of the International Society for Developmental Neuroscience. 11, 347-355 (1993).
- Colwell, A. S., Longaker, M. T., Peter Lorenz, H. Identification of differentially regulated genes in fetal wounds during regenerative repair. Wound repair and regeneration : official publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 16, 450-459 (2008).
- Hu, M. S., et al. Gene expression in fetal murine keratinocytes and fibroblasts. The Journal of surgical research. , (2014).
- Colwell, A. S., Krummel, T. M., Longaker, M. T., Lorenz, H. P. An in vivo mouse excisional wound model of scarless healing. Plastic and reconstructive surgery. 117, 2292-2296 (2006).
- Wilgus, T. A., et al. The impact of cyclooxygenase-2 mediated inflammation on scarless fetal wound healing. The American journal of pathology. 165, 753-761 (2004).
- Iocono, J. A., Ehrlich, H. P., Keefer, K. A., Krummel, T. M. Hyaluronan induces scarless repair in mouse limb organ culture. Journal of pediatric surgery. 33, 564-567 (1998).
- Chopra, V., Blewett, C. J., Krummel, T. M. Transition from fetal to adult repair occurring in mouse forelimbs maintained in organ culture. Wound repair and regeneration : official publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 5, 47-51 (1997).
- Adzick, N. S., Longaker, M. T. Animal models for the study of fetal tissue repair. The Journal of surgical research. 5, 47-51 (1991).
- Block, M. Wound healing in the new-born opossum (Didelphis virginianam). Nature. 187, 340-341 (1960).
- Longaker, M. T., Dodson, T. B., Kaban, L. B. A rabbit model for fetal cleft lip repair. Journal of oral and maxillofacial surgery : official journal of the American Association of Oral and Maxillofacial Surgeons. 48, 714-719 (1990).
- Longaker, M. T., et al. A model for fetal cleft lip repair in lambs. Plastic and reconstructive surgery. 90, 750-756 (1992).
