Cilia of olfactory sensory neurons contain proteins of the signal transduction cascade, but a detailed spatial analysis of their distribution is difficult in cryosections. We describe here an optimized approach for whole mount labeling and en face visualization of ciliary proteins.
The mouse olfactory system comprises 6-10 million olfactory sensory neurons in the epithelium lining the nasal cavity. Olfactory neurons extend a single dendrite to the surface of the epithelium, ending in a structure called dendritic knob. Cilia emanate from this knob into the mucus covering the epithelial surface. The proteins of the olfactory signal transduction cascade are mainly localized in the ciliary membrane, being in direct contact with volatile substances in the environment. For a detailed understanding of olfactory signal transduction, one important aspect is the exact morphological analysis of signaling protein distribution. Using light microscopical approaches in conventional cryosections, protein localization in olfactory cilia is difficult to determine due to the density of ciliary structures. To overcome this problem, we optimized an approach for whole mount labeling of cilia, leading to improved visualization of their morphology and the distribution of signaling proteins. We demonstrate the power of this approach by comparing whole mount and conventional cryosection labeling of Kirrel2. This axon-guidance adhesion molecule is known to localize in a subset of sensory neurons and their axons in an activity-dependent manner. Whole mount cilia labeling revealed an additional and novel picture of the localization of this protein.
नाक गुहा में माउस घ्राण उपकला 6-10,000,000 द्विध्रुवी घ्राण संवेदी न्यूरॉन्स एक शामिल हैं। प्रत्येक घ्राण न्यूरॉन अभिव्यक्ति के लिए 1200 odorant रिसेप्टर जीन की एक चुनता है। Odorants की जांच तो 4 OLF घ्राण विशिष्ट जी प्रोटीन Gα के माध्यम से adenylyl साइक्लेस प्रकार III (ACIII) 3 को सक्रिय करता है जो एक घ्राण रिसेप्टर 2, के लिए बाध्य odorant से शुरू होता है। चक्रीय adenosine monophosphate (शिविर) में वृद्धि के परिणामस्वरूप खोलता एक न्यूक्लियोटाइड-गेटेड गैर-चयनित कटियन चैनल सीए 2 + और ना +, और बाद में सीए की आमद के लिए अग्रणी (सीएनजी) 2 + तांता एक सीए 2 + सक्रिय सीएल का उद्घाटन करने के लिए सुराग चक्रीय – चैनल 5,6। जावक सीएल जिसके परिणामस्वरूप – प्रवाह एक उच्च intracellular सीएल द्वारा सुविधा है – ना + / + K / सीएल के माध्यम से होने की संभावना तेज, – – cotransporter NKCC1, एकाग्रता स्थिर सीएल द्वारा बनाए रखाCL – / HCO3 – एक्सचेंजर SLC4A1, और शायद अतिरिक्त अभी तक पहचान की जा ट्रांसपोर्टरों 6-8।
द्विध्रुवी घ्राण न्यूरॉन्स एकल, unbranched घ्राण बल्ब को सीधे परियोजना axons कि, और उपकला की सतह तक फैली हुई है और एक विशेष डिब्बे, वृक्ष के समान दस्ता के रूप में समाप्त हो जाती है कि एक डेन्ड्राइट है। ऊपर माइक्रोन 50-60 के लंबाई तक पहुँच सकते हैं जो इस घुंडी, 10-30 सिलिया, से, उपकला सतह 9 को कवर बलगम में निर्गत होना। विहित संकेत पारगमन झरना के प्रोटीन मुख्य रूप से इन सिलिया की झिल्ली में स्थानीय कर रहे हैं। उपकला की वृद्धि संवेदी सतह odorants पता लगाने की क्षमता बढ़ाता है। कारण संवेदी न्यूरॉन्स के घनत्व के लिए, पड़ोसी वृक्ष के समान knobs के विस्तार से सिलिया मिलाना। उपकला की सतह पर, घ्राण रिसेप्टर्स के विभिन्न प्रकार व्यक्त अलग न्यूरॉन्स से सिलिया के एक यादृच्छिक मिश्रण में इस खुलेपन का परिणाम है। का पता लगाने और सेलसंवेदी न्यूरॉन्स की एक सबसेट में ही मौजूद हैं, जो सिलिअरी प्रोटीन की ular आवंटन cryosections में इसलिए मुश्किल है। Cryosections सिलिया की औसत लंबाई की तुलना में आम तौर पर पतले हैं, क्योंकि इसके अलावा, सिलिया के साथ इस तरह के प्रोटीन का सटीक स्थानीयकरण, मुश्किल से ही संभव है।
घ्राण न्यूरॉन्स में अब तक uncharacterized झिल्ली प्रोटीन के सिलिअरी स्थानीयकरण की जांच सक्षम करने के लिए, हम सिलिया में प्रोटीन स्थानीयकरण के विस्तृत विश्लेषण के लिए अनुमति देता है जो एक एन चेहरा तैयारी तकनीक अनुकूलित। संक्षेप में, माउस का बलिदान और सिर midline के पास विभाजित है। Turbinates, नाक, और ललाट हड्डियों पट बेनकाब करने के लिए हटा रहे हैं। अस्तर उपकला की घ्राण भाग के साथ पट नाक गुहा को सभी कनेक्शनों को काटने से ढीला है। घंटी समाधान के साथ भरा एक पेट्री डिश में पट लगाने के बाद, उपकला एक लेपित गिलास स्लाइड के लिए स्थानांतरित कर अंड से खुली है। एक छोटी fixat के बादहैंडलिंग कमजोर ऊतक के नुकसान से बचने के लिए संभव के रूप में कोमल है अगर आयन कदम है, immunostaining प्रक्रियाओं का प्रदर्शन किया जा सकता है। हम शास्त्रीय cryosections में और वर्णित एन चेहरा तैयारी में घ्राण सिलिया में दो अलग-अलग झिल्ली प्रोटीन के धुंधला की तुलना द्वारा प्राप्त संकल्प प्रदर्शित करता है।
The en face preparation technique described in this protocol provides a powerful tool for the detailed analysis of the olfactory system. So far, most studies characterizing the localization of signaling proteins use immunostainings of cryosections. They present a good overview of the olfactory epithelium, and protein expression in distinct cell types or regions can be easily identified. However, expression in olfactory cilia is sometimes hard to detect. Even if ciliary localization is obvious, cryosections offer…
The authors have nothing to disclose.
This work was funded by the Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG (Exc257, SFB958).
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Spring scissors | straight tip, multiple suppliers | ||
Surgical scissors | sharp and blunt end, multiple suppliers | ||
Fine forceps | curved tips, Dumont #7, multiple suppliers | ||
Razor blade | extra thin, multiple suppliers | ||
Binocular with illumination | multiple suppliers, Stemi 2000-C, Zeiss | ||
Petri dish | multiple suppliers | ||
Liquid-blocker pen | Science Services | N71310 | |
Polysine coated slides | Thermo Scientific | J2800AMNZ | |
Confocal microscope | Leica Microsystems | TCS SPE | |
primary antibody Goat anti-Kirrel2 | R&D Systems | AF2930 | 1:200 |
primary antibody Rabbit anti-mOR-EG | Baumgart et al., 2014 | 1:200 | |
secondary antibodies | Life Technologies | A21206, A11057 | 1:500 |
Mounting medium, ProLong Gold antifade reagent | Life Technologies | P36930 | |
Paraformaldehyde | Sigma | 441244 | toxic, work under fume hood |