Neuroscience

マウスの主嗅覚系における繊毛のホールマウントのラベリング

Published: December 27, 2014 doi: 10.3791/52299

Sonja Oberland^1,2, Eva Maria Neuhaus^1,2

¹Pharmacology and Toxicology, Universitaetsklinikum Jena, ²Charite-Universitaetsmedizin Berlin

Introduction

鼻腔内マウス嗅上皮は6から10000000バイポーラ嗅細胞^1を備える。各嗅覚ニューロンは表現のために1200嗅覚受容体遺伝子のいずれかを選択します。臭気物質の検出は、その後⁴ _OLF嗅覚特定のGタンパク質Gαを経由してアデニリルシクラーゼIII型^{（ACIII）3を}活性化する嗅覚受容体^2、に結合すること、付臭剤によって開始されます。環状アデノシン一リン酸（cAMP）の結果として生じる上昇は、環状ヌクレオチド依存性（CNG）のCa ²⁺およびNa ⁺の流入につながる非選択性陽イオンチャネルを開き、続いてのCa ²⁺流入は、Ca ²⁺活性化Cl -の開口部につながる^-チャネル^5,6。外側へのCl結果^-フラックスは高い細胞内のClによって促進される^-のNa ⁺ / K ⁺ / CL経由そう取り込み、 ^{- -}共輸送体NKCC1、濃度が安定したのClによって維持のCl ^- / HCO3 ^-交換SLC4A1、そしておそらく追加のまだ同定されるトランスポーター^6-8。

バイポーラ嗅覚ニューロンは嗅球に直接投影する単一の非分枝の軸索を有し、そして上皮の表面まで延びており、特殊なコンパートメント、樹状ノブとして終了デンドライト。このノブから、最大で50〜60程度の長さに到達することができ10-30繊毛は、上皮表面^9を覆って^いる粘液に発する。カノニカルシグナル伝達カスケードのタンパク質は、主にこれらの繊毛の膜に局在している。上皮の増加感覚表面が臭気物質を検出する能力を増幅する。起因する感覚ニューロンの密度に、近隣の樹状ノブから延びる繊毛が混在。この、別のニューロンからの繊毛のランダムな混合をもたらす交絡上皮の表面上の嗅覚受容体の異なるタイプを発現する。検出とセル感覚ニューロンのサブセットにおいてのみ存在する毛様タンパク質のウラル割り当てが凍結切片では困難である。凍結切片は、通常、繊毛の長さの平均よりも薄いので、また、繊毛に沿ってこのようなタンパク質の正確な局在化は、かろうじて可能です。

嗅覚ニューロンにおけるこれまでの特徴付けされていない膜タンパク質の毛様体の局在の調査を可能にするために、我々は繊毛におけるタンパク質の局在の詳細な分析を可能にする専用顔調製技術を最適化した。簡単に言えば、マウスを犠牲にし、頭が正中線付近で分割されます。鼻甲介、鼻、および前頭骨が中隔を露出するために除去される。ライニング上皮の嗅覚部分とセプタムは、鼻腔にすべての接続を切断することによって緩められる。リンゲル液で満たされたペトリ皿にセプタムを入れた後、上皮は、コーティングされたガラススライドに移しウントを剥離する。短いfixatに続いて取り扱いが脆弱な組織の損傷を避けるために、できるだけ穏やかであればイオンステップは、免疫染色の手順を行うことができる。我々は、古典的な凍結切片にし、説明エンフェイス調製における嗅覚繊毛2つの異なる膜タンパク質の染色を比較することによって達成可能な解像度を示す。

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Protocol

注：すべての動物の手順は、動物の不当な苦しみを避けドイツの動物管理の法律と一致してシャリテまたは大学クリニックイエナで取り扱った。

1.準備ソリューションおよび解剖職場

ソリューション
注：上皮の解剖を開始する前に、以下のソリューションを準備します。
1. 解剖手続きのためのソリューション：
  1. 140 NaCl、5mMのKClを、10mMのHEPES、2mMのCaCl _2を、1mMのMgCl _2、および10mMのグルコース濃度でリンゲル液（pH7.4）を調製。
  2. 2.68のKCl、1.47 mMのKH ₂ PO _4、136mMのNaCl、および8.1のNa ₂ HPO ₄の濃度の液（pH 7.4） ^{- / -} PBS準備。
  3. ^{- / -} 、0.2mMのCaCl _2を 4％スクロース、4％パラホルムアルデヒド固定液1×PBSの濃度の液（pH7.2）を調製。固定液中のスクロースは、クライオを改善切片と凍結切片のアップを拾う。 -20℃で保管してください。
2. 染色手順のためのソリューション
  1. ^{- / -} 、0.48のMgCl _2、0.9のCaCl ₂ 1×PBSの濃度のPBS ^{+ / +}溶液を調製する。
  2. 1X PBS ^{+ / +}および0.1％トリトンX-100の濃度のPBST ^{+ / +}溶液を調製する。
  3. 1X PBST ^{+ / +}および1％ゼラチンの濃度のブロッキング溶液を準備します。
職場
1. 解剖職場の場合は、明るい照明、並びに液体ブロッカーペンで解剖顕微鏡を使用しています。
2. リンゲル液で満たされたペトリ皿、および接着剤のガラススライドを準備します。
3. 以下の手術器具を入手：シャープ1と1鈍い先端を有する外科ハサミ、ストレート先端形状と春のハサミ、細かい湾曲した先端形状とカミソリの刃を持つ2鉗子（

鼻中隔の調製

食物および水を定期的にアクセスし、適切な昼/夜サイクルに承認されたケージ内ハウス動物。
リア足の反射神経をテストすることによって、100％のイソフルラン及びモニタ鎮痛に浸したガーゼを含有する密閉容器に麻酔を行います。頸椎脱臼が鼻腔内の血液を引き起こす可能性がありますので、直接、麻酔したマウスを首を切る。
全体の頭蓋骨と鼻の骨を露出する肌を外し、徹底的にペーパータオルを使用して残りの血液や組織を拭き取る。下顎と前歯を削除します。
上顎（横方向）の隔壁（内側）の一方の側を分離するために、縫合線1〜2 mmの距離の平行な左右の鼻の背側骨を切開する。シングルカットで鼻を分割します。骨の残骸と甲介がまだ隔壁に接続されている場合、完全にセプタムを露出させるために慎重にこれらを除去するそれに触れることなく。
中隔と鼻の骨の間、中隔の背側に沿って鉗子の罰金曲がった先端部をスライドさせて、背側鼻の骨を削除します。、骨にわずかな圧力を適用し、それを押し上げて取り外します。
2中隔組織、各キャビティから1へのアクセスを提供するには、慎重に頭の反対側の上顎を削除します。高齢の動物（P> 28）を調製する場合、嗅球をカバーする前頭骨の先端を取り除く。
そのわずかに黄色（ 図1B）で嗅上皮を特定します。境界気道上皮は、白色であり、解剖顕微鏡下で見ることができ、運動性繊毛の動きを示している。細かい春のハサミで嗅覚と気道上皮の境界に沿って切断する。
カットを拡張し、鋤骨の骨への腹側の接続からセプタムを分離する。その後、中隔とOSの篩骨の篩板との間の境界に沿って切断E。セプタムは、現在は完全頭部へのすべての接続から隔離されている。 図1Cに示す切断位置を使用してください。

免疫染色のための嗅上皮3.絶縁

リンゲル液で満たされたペトリ皿に接着剤ガラススライドを置きます。ガラスの半分がリンゲル液（ 図1A）にあるように、ペトリ皿の端にそれを置きます。
慎重にペトリ皿に嗅上皮で篩骨を転送するために鉗子を使用してください。鉗子のヒントでそれをつかんでなく、それを持ち上げます。
1鉗子で篩骨の垂直プレートをつかみ、慎重に中隔の一方の側から上皮を除去するための第二1を使用しています。上皮を剥離し垂直プレートと上皮の間で曲がった先端部をスライドさせます。
上皮はリンゲルsolutiに反転させた場合に、常に毛様側を識別するようにしてください上。上皮が反転する場合は、その後、毛様側を識別することはほとんど不可能である。主に、上皮は内側毛様体表面にロールアップします。
図1Cに示す切断位置に在籍した組織形状を比較してください。国境での位置で上皮をつかみ、スライドガラス上に引き出します。組織の病変を避けるために、ピンセットで毛様側には手を触れないでください。
セプタムを回し、反対側から上皮で手順を繰り返します。
ペーパータオルで嗅上皮の両方の部分の周りにスライドガラスを乾燥させ、液体遮断ペンで組織を取り囲む。
RTで10分間、150μlの固定剤溶液を用いて組織を固定してください。繊毛の安定性と完全性については、試験した抗体の様々な短い固定時間を使用しています。これらの10分の繊毛内の固定が、おそらく全体ではなく、上皮組織されている。このため、即時のは、Sの後に顕微鏡で可視化する手順をtaining。しかし、固定液の時間は個々の抗体のために異なる場合があります。

4.染色プロトコル

注：嗅細胞の繊毛の構造を維持するために非常に慎重に組織を処理します。ピペッティングによりソリューションを削除します。機械的な力が細かい繊毛を混乱させる可能性として、上皮に直接すべてのソリューションを落とさないでください。特に明記していない場合は、RTですべての手順を実行します。

固定液を除去し、PBS ^{+ / +}で2回洗浄する。
ブロッキング溶液を少なくとも1時間、上皮をインキュベートする。
（本研究において使用される抗体200 1）及び任意の沈殿物を除去するために、最高速度で5分間遠心分離し、ブロッキング溶液中の抗体を溶解することによって一次抗体溶液を調製する。
4℃CO / Nでの加湿チャンバー内の抗体溶液との上皮をインキュベートする。
5分で少なくとも3回、PBS ^{+ / +}との上皮を洗ってください。
（1：500）をブロッキング溶液中の抗体を溶解することによって二次抗体溶液を調製し、最高速度で5分間遠心する。
暗い室内で1時間二次抗体溶液で上皮をインキュベートします。
5分で少なくとも3回、PBS ^{+ / +}との上皮を洗ってください。
かみそりの刃やペーパータオルで液体ブロッカーを削除します。 5秒間蒸留水で上皮を洗ってください。
退色防止取り付け試薬で組織を保持します。
注：急速日以内にバックグラウンド蛍光が増加する。マウンティング培地中に埋め込んだ後、遅くとも2日より顕微鏡分析は、したがって、お勧めします。特別な注意は、それが深刻な準備に損傷を与える可能性があるため、正確な焦点面を検索する際に組織を圧迫しないように注意する必要があります。ためピンボケ蛍光に、共焦点顕微鏡とのさらなる調査が推奨されます。

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Representative Results

顔製剤エン嗅上皮に局在凍結切片を分析した後には不明であるタンパク質の詳細な研究を可能にする、感覚ニューロンの繊毛のタンパク質の局在を調べるために使用することができる。この問題は、IRRE様タンパク質2（Kirrel2）の親族のための染色の場合を例示することができる。（またNeph3呼ばれる）Kirrel2は同種親和性接着タンパク質などの膜タンパク質と機能の免疫グロブリン（Ig）スーパーファミリーのメンバーである。これは、嗅覚系における軸索ガイダンスにおいて役割を果たすこと、および活動依存的に¹⁰で嗅覚ニューロンのサブセットにおいて発現されることが示された。

嗅上皮を通して典型的な凍結切片にKirrel2ための免疫染色は軸索、細胞体と樹状突起（ 図2A）でKirrel2の局在を明らかにした。 アン顔調製技術について上記したように、すべての溶液を調製した。いくつかのLもののabelingは、樹状ノブからなる層の上に表示され、毛様体局在は凍結切片の分析の後に不確実なままであった。いくつかのニューロンは、彼らの嗅覚ノブとその周辺染色を示したが、単独の繊毛は特定することが困難であった。対照的に、上述のプロトコルに従って行っ嗅上皮の顔調製専用明白Kirrel2（ 図2B）の繊毛局在化を示した。染色された凍結切片の分析は、ニューロンの非常に大きな割合で発現を示したが、興味深いことに、Kirrel2は、嗅覚ニューロンの比較的小さいサブセットの繊毛で発現させた。また、EN顔の準備は、単に一般的には毛様体染色を実証したが、多くの長い繊毛を持つニューロンからわずか数繊毛を持つ神経細胞に及ぶ毛様体発現パターンの変化を明らかにしませんでした。いくつかの細胞では、Kirrel2はなく、このノブから延びる繊毛で、樹状ノブで検出された。 ℃ auseとこの知見の機能的関連性はまだ解明されていないが、それは嗅覚系におけるタンパク質の局在化に新たな洞察を提供するために、専用の顔の準備の可能性を示している。

加えて、我々は強い繊毛表現^11を示す嗅覚受容体MOR-EG、のための免疫染色を行った。受容体は、すでに凍結切片における毛様体層（ 図3A）で明確に識別される。それにもかかわらず、そのようなノブあたりの繊毛の数や個々の繊毛の長さと詳細な特性解析は不可能である。嗅覚受容体を発現するニューロンからアン顔製剤 、繊毛の識別を使用する（ 図3B、C）が容易に可能である。 アン顔調製物は、異なる年齢の動物を用いて行うことができる。出生前の動物からのさえ繊毛は正常に染色した（ 図3D）可視化した。

顔製剤エン内容は">ので良く毛様体の形態および詳細によく知られている毛様体タンパク質の局在を分析するために適したツールを表す。

マウスの頭部の調製図。（A）解剖職場の配置。ペトリ皿は、リンゲル液を充填し、接着剤のガラススライドを保持する。外科用器具は、フェース調製専用に推奨されている。（B）は、マウス頭部の半分を除去した後、セプタムが露出している。セプタムは嗅上皮（OE）及び呼吸上皮（RE）で被覆されている。 OB：嗅球、V：。鋤鼻器官（C）嗅上皮が並ぶ中隔の一部を分離するためには、細かいハサミで実証した線に沿ってセプタムをカット。 S：//www.jove.com/files/ftp_upload/52299/52299fig1large.jpg "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

凍結切片で、 フェースの準備EN Kirrel2免疫染色の図2.比較。 Kirrel2に対して免疫染色生後60日目（P60）凍結切片の（A）共焦点画像（最大突起）が嗅細胞におけるタンパク質の局在を明らかにしている。シングル嗅覚ノブは繊毛に強い染色およびKirrel2定位（アスタリスク）を想定したが、不確実であることを示している。（B）の共焦点画像（最大突起）P65の嗅覚上皮の顔の準備専用嗅覚感覚ニューロンのサブセットの繊毛に明確なKirrel2染色を示し、。（スケールバーは10μm）9 / 52299fig2large.jpg「ターゲット= "_空白">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

凍結切片で、顔の準備EN MOR-EGの免疫染色の3の比較図。嗅覚受容体MOR-EGに対して免疫染色P60の凍結切片の（A）共焦点画像（最大投影）。毛様体の局在は既に検出可能である。（B）嗅覚受容体MOR-EGに対して免疫染色顔準備EN P65の共焦点画像。 MOR-EGを強く嗅覚感覚ニューロンのサブセットの繊毛で表されます。凍結切片を、長さに関する繊毛特性とは対照的に、ノブと正確なタンパク質局在当たり繊毛の数を分析することができる。（B）中の四角で囲まれた領域の（C）高倍率。（D）Confoc嗅覚受容体MOR-EGに対して免疫染色顔準備EN胎生18日（E18）のアル画像。繊毛の染色は、明瞭に見ることができる。（スケールバー、10μm）をこの図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

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Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Spring scissors			straight tip, multiple suppliers
Surgical scissors			sharp and blunt end, multiple suppliers
Fine forceps			curved tips, Dumont #7, multiple suppliers
Razor blade			extra thin, multiple suppliers
Binocular with illumination			multiple suppliers, Stemi 2000-C, Zeiss
Petri dish			multiple suppliers
Liquid-blocker pen	Science Services	N71310
Polysine coated slides	Thermo Scientific	J2800AMNZ
Confocal microscope	Leica Microsystems	TCS SPE
primary antibody Goat anti-Kirrel2	R&D Systems	AF2930	1:200
primary antibody Rabbit anti-mOR-EG	Baumgart et al., 2014		1:200
secondary antibodies	Life Technologies	A21206, A11057	1:500
Mounting medium, ProLong Gold antifade reagent	Life Technologies	P36930
Paraformaldehyde	Sigma	441244	toxic, work under fume hood