Introduction
L'epitelio olfattivo mouse nella cavità nasale comprende 6-10.000.000 bipolari neuroni sensoriali olfattivi 1. Ogni neurone olfattivo sceglie uno dei 1.200 geni recettore olfattivo per l'espressione. Rilevazione di odoranti inizia legandosi ad un recettore olfattivo 2, che attiva ciclasi di tipo III (ACIII) 3 tramite l'olfatto specifica proteina G Gα olf 4 odorizzante. L'aumento conseguente adenosina monofosfato ciclico (cAMP) apre una ciclica nucleotide-gated (CNG), canale cationico non selettivo che porta a afflusso di Ca 2+ e Na +, e successivamente Ca 2+ afflusso porta all'apertura di un Cl Ca 2+ attivato - Canale 5,6. La risultante partenze Cl - flusso è facilitata da un elevato intracellulare Cl - concentrazione mantenuta costante Cl - captazione, probabilmente attraverso il Na + / K + / Cl - cotransporter NKCC1, laCl - / HCO3 - scambiatore SLC4A1, e forse altri trasportatori ancora essere identificate 6-8.
Neuroni olfattivi bipolari presentano singoli, assoni non ramificati che proiettano direttamente al bulbo olfattivo, e un dendrite che si estende alla superficie dell'epitelio e termina in un vano specializzata, la manopola dendritica. Da questa manopola, 10-30 cilia, che può raggiungere una lunghezza di fino a 50-60 micron, emanare nel muco che copre la superficie epiteliale 9. Proteine della canonica cascata di trasduzione del segnale sono localizzati prevalentemente nella membrana di questi cilia. La superficie sensoriale maggiore dell'epitelio amplifica la capacità di rilevare odoranti. A causa della densità di neuroni sensoriali, cilia estendentesi da manopole dendritiche vicini mescolano. Questa compenetrazione risultati in una miscela casuale di cilia da diversi neuroni, che esprimono diversi tipi di recettori olfattivi, sulla superficie dell'epitelio. La rilevazione e la cellaassegnazione lare di proteine ciliari che sono presenti solo in un sottogruppo di neuroni sensoriali è quindi difficile in criosezioni. Inoltre, la localizzazione precisa di tali proteine lungo la cilia è appena possibile, poiché criosezioni sono tipicamente più sottile rispetto alla lunghezza media delle ciglia.
Per attivare la ricerca di localizzazione ciliare di proteine di membrana finora non caratterizzate in neuroni olfattivi, abbiamo ottimizzato una tecnica di preparazione volto en, che consente l'analisi dettagliata di localizzazione delle proteine in cilia. In breve, il mouse è sacrificato e la testa spaccata in prossimità della linea mediana. Turbinati, nasali e ossa frontali vengono rimossi per esporre il setto. Il setto con la parte olfattiva dell'epitelio rivestimento viene allentata tagliando tutte le connessioni alla cavità nasale. Dopo aver messo il setto in una capsula di Petri riempita con la soluzione di Ringer, l'epitelio è staccata und trasferito ad un vetrino rivestito. A seguito di una breve fixation passo, le procedure di colorazione può essere eseguita se la gestione è più delicata possibile per evitare danni del tessuto fragile. Dimostriamo la risoluzione ottenibile confrontando la colorazione di due diverse proteine di membrana in cilia olfattiva in criosezioni classici e nella preparazione en face descritto.
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Protocol
NOTA: Tutte le procedure di animali sono stati trattati presso la Charité o Clinica Universitaria di Jena in accordo con le leggi per la cura degli animali tedesca evitando ogni sofferenza indebita di animali.
1. Preparazione Soluzioni e Dissection Workplace
- Soluzioni
NOTA: Preparare le seguenti soluzioni prima di dissezione dell'epitelio.- Soluzioni per la procedura di dissezione:
- Preparare la soluzione di Ringer (pH 7,4) con concentrazioni di NaCl 140 mM, KCl 5 mM, HEPES 10 mM, 2 mM CaCl 2, 1 mM MgCl 2, e glucosio 10 mM.
- Preparare un PBS - / - Soluzione (pH 7.4) con concentrazioni di 2.68 mM KCl, 1.47 mM Na KH 2 PO 4, 136 mM NaCl, e 8,1 mm 2 HPO 4.
- Preparare una soluzione di fissativo (pH 7,2) con concentrazioni di 1x PBS - / -, 0.2 mM CaCl 2, 4% di saccarosio, e 4% paraformaldeide. Saccarosio nella soluzione fissativo migliora cryosezionamento e pick-up di criosezioni. Conservare a -20 ° C.
- Soluzioni per la procedura di colorazione
- Preparare un + / + soluzione PBS con concentrazioni di 1x PBS - / -, 0.48 mM MgCl 2, 0.9 mM CaCl 2.
- Preparare una PBST + / + soluzione con concentrazioni di PBS 1x + / + e 0,1% Triton X-100.
- Preparare una soluzione di saturazione con concentrazioni di 1x PBST + / + e 1% di gelatina.
- Soluzioni per la procedura di dissezione:
- Workplace
- Per il lavoro dissezione, utilizzare un microscopio da dissezione con illuminazione brillante, così come una penna liquida-bloccante.
- Preparare una capsula di Petri, riempito con soluzione di Ringer, e vetrini adesivi.
- Ottenere i seguenti strumenti chirurgici: un paio di forbici chirurgiche con una forte e una punta smussata, un paio di forbici a molla di forma punta dritto, due pinze di finissima perfetta forma ricurva e una lama di rasoio (
2. Preparazione del setto nasale
- Animali domestici in gabbia approvati regolare accesso al cibo e all'acqua e appropriato ciclo giorno / notte.
- Eseguire l'anestesia in un recipiente contenente una garza imbevuta chiuso con il 100% isoflurano e il monitor analgesia testando i riflessi del piede posteriore. Dal dislocazione cervicale può causare sangue nelle cavità nasali, decapitare direttamente topi anestetizzati.
- Togliere la pelle per esporre l'osso dell'intero cranio e il naso, e spazzare via il sangue e tessuto rimanente accuratamente con un tovagliolo di carta. Rimuovere la mandibola e denti anteriori.
- Incidere l'osso dorsale del naso bilateralmente in 1-2 mm distanza parallela alla linea di sutura per separare una parte del setto (medialmente) dal mascellare (lateralmente). Dividere il naso con un unico taglio. Se resti ossei e turbinati sono ancora attaccati al setto, rimuoverli con cura per esporre completamente il settosenza toccarlo.
- Rimuovere la dorsale osso nasale facendo scorrere la punta ricurva multa di una pinza lungo il lato dorsale del setto, tra setto e osso nasale. Applicare una leggera pressione sull'osso, spingere verso l'alto e rimuoverlo.
- Per fornire l'accesso ai due tessuti settali, uno da ciascuna cavità, rimuovere accuratamente mascella dell'altro lato della testa. Quando si prepara animali più vecchi (P> 28), rimuovere la punta dell'osso frontale che copre i bulbi olfattivi.
- Identificare l'epitelio olfattivo dal suo colore leggermente giallo (Figura 1B). L'epitelio respiratorio confinante è bianca e mostra il movimento delle ciglia mobili che può essere visto sotto il microscopio da dissezione. Tagliare lungo il confine tra epitelio olfattivo e respiratorio, con un paio di forbici di primavera belle.
- Estendere il taglio e separare il setto dalla connessione ventrale all'osso vomere. Poi tagliare lungo il confine tra il setto e la lamina cribrosa del ethmoidal Ose. Il setto è ora completamente isolato da tutti i collegamenti alla testa. Utilizzare le posizioni di taglio illustrati nella Figura 1C.
3. Isolamento del olfattivo Epithelium per Immunostaining
- Inserire un vetrino adesivo nella capsula di Petri riempita con soluzione di Ringer. Posizionarlo sul bordo della capsula di Petri, in modo che la metà del vetro risiede nella soluzione di Ringer (Figura 1A).
- Usare una pinza per trasferire accuratamente l'osso etmoide con l'epitelio olfattivo alla capsula di Petri. Sollevare senza afferrare con le punte pinze.
- Afferrare la piastra perpendicolare dell'osso etmoide con una pinza e utilizzare un secondo per rimuovere con attenzione l'epitelio da un lato del setto. Far scorrere la punta ricurva tra la piastra perpendicolari e epitelio a sbucciare la epitelio off.
- Assicurarsi sempre di identificare il lato ciliare, nel caso in cui l'epitelio lanci in soluti del Ringeron. Se l'epitelio ribalta, è difficilmente possibile identificare il lato ciliare seguito. Per lo più, l'epitelio arrotola con la superficie interna ciliare.
- Confrontare la forma del tessuto iscritti con le posizioni di taglio illustrati nella Figura 1C. Prendete l'epitelio in una posizione al confine e tirarlo sul vetrino. Non toccare il lato ciliare con le pinze per evitare lesioni del tessuto.
- Spegnere il setto e ripetere la procedura con l'epitelio dall'altro lato.
- Asciugare il vetrino attorno entrambi i pezzi di epitelio olfattivo con un tovagliolo di carta e circondare il tessuto con una penna liquido-bloccante.
- Fissare il tessuto con 150 microlitri soluzione fissativa per 10 min a RT. Per quanto riguarda la stabilità e l'integrità cilia, utilizzare tempi di fissazione brevi per una varietà di anticorpi testati. All'interno di questi 10 min cilia sono fissi, ma probabilmente non l'intero tessuto epiteliale. Così, immediata visualizzare con microscopio successivamente alle scontenenti procedura. Tuttavia, i tempi possono variare fissativo per gli anticorpi individuali.
4. Protocollo di colorazione
NOTA: Maneggiare il tessuto con molta attenzione per preservare le strutture ciliari dei neuroni sensoriali olfattivi. Rimuovere soluzioni pipettando. Non far cadere alcuna soluzione direttamente sul epitelio, come forze meccaniche potrebbero comprometterne il bene cilia. Eseguire tutti i passi a RT, se non diversamente indicato.
- Rimuovere la soluzione di fissativo e lavare 2 volte con PBS + / +.
- Incubare l'epitelio per almeno 1 ora con soluzione bloccante.
- Preparare la soluzione anticorpo primario sciogliendo l'anticorpo in soluzione bloccante (1: 200 per gli anticorpi utilizzati in questo studio) e centrifugare per 5 min a piena velocità per rimuovere eventuali precipitati.
- Incubare l'epitelio con soluzione di anticorpi in una camera umida a 4 ° CO / N.
- Lavare epitelio con PBS + / + per 5 minuti almeno 3 volte.
- Preparare la soluzione di anticorpo secondario sciogliendo l'anticorpo in soluzione bloccante (1: 500) e centrifugare per 5 min a piena velocità.
- Incubare l'epitelio con soluzione di anticorpo secondario per 1 ora in una camera oscura.
- Lavare epitelio con PBS + / + per 5 minuti almeno 3 volte.
- Rimuovere il liquido-bloccante con una lametta o un tovagliolo di carta. Lavare l'epitelio con acqua distillata per 5 s.
- Preservare il tessuto in antifade reattivo di montaggio.
NOTA: aumenta rapidamente fluorescenza di fondo in pochi giorni; analisi microscopica non più tardi di due giorni dopo l'incorporazione in mezzo di montaggio è quindi consigliato. Particolare cura deve essere presa non stringere il tessuto durante la ricerca sul piano focale corretto, in quanto può danneggiare gravemente il preparato. A causa di fluorescenza out-of-focus, si raccomanda ulteriori indagini al microscopio confocale.
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Representative Results
Epitelio olfattivo en preparazioni faccia può essere usato per studiare la localizzazione delle proteine nella cilia di neuroni sensoriali, consentendo l'indagine dettagliata di proteine la cui localizzazione è chiaro dopo l'analisi di criosezioni. Questo problema può essere esemplificato nel caso della colorazione per Kin di proteine IRRE-like 2 (Kirrel2). Kirrel2 (chiamato anche Neph3) è un membro della immunoglobuline (Ig) superfamiglia di proteine di membrana e funzioni come una proteina di adesione homophilic. E 'stato dimostrato di giocare un ruolo in assone-guida per il sistema olfattivo, e ad essere espresso in un sottogruppo di neuroni olfattivi in un'attività maniera dipendente 10.
Immunostaining per Kirrel2 in un cryosection tipico attraverso epitelio olfattivo rivela la localizzazione di Kirrel2 in assoni, dendriti e soma (Figura 2A). Tutte le soluzioni sono state preparate come descritto sopra per la tecnica di preparazione en face. Anche se alcuni lAbeling appare sulla parte superiore dello strato composto di manopole dendritiche, localizzazione ciliare rimasta incerta dopo l'analisi di criosezioni. Alcuni neuroni esposti colorazione in ed intorno a loro la manopola olfattiva, ma singoli cilia erano difficili da identificare. Al contrario, la preparazione en face dell'epitelio olfattivo eseguita secondo il protocollo sopra descritto inequivocabilmente dimostrato la localizzazione ciliare di Kirrel2 (Figura 2B). È interessante notare, Kirrel2 stata espressa solo in cilia di relativamente piccolo sottoinsieme di neuroni olfattivi, anche se l'analisi di criosezioni colorate mostrato espressione in una percentuale molto maggiore di neuroni. Inoltre, l'en preparato viso non solo dimostrare ciliare colorazione in generale, ma ha rivelato variazioni nei modelli di espressione ciliari che vanno da neuroni con molte lunghe ciglia di neuroni con solo qualche breve ciglia. In alcune cellule, Kirrel2 stato rilevato nel pomello dendritico, ma non in cilia estendono da questa manopola. Il c ausa e la rilevanza funzionale di questo dato resta da chiarire, ma illustra le potenzialità del preparato en face di fornire nuove intuizioni localizzazione delle proteine nel sistema olfattivo.
Inoltre, abbiamo effettuato un immunostaining per il recettore olfattivo MOR-EG, che espone l'espressione forte ciliare 11. Il recettore è già chiaramente identificabile strato ciliare in criosezioni (Figura 3A). Tuttavia, l'analisi delle caratteristiche dettagliate come il numero delle ciglia per pomolo o la lunghezza delle ciglia individuo non è possibile. Usando la preparazione en faccia, identificazione di cilia dai neuroni esprimono il recettore olfattivo è facilmente possibile (Figura 3B, C). L'en face preparato può essere effettuato con animali di età diverse. Anche cilia da animali prenatali erano macchiati con successo e visualizzate (Figura 3D).
content "> En preparazioni faccia pertanto rappresentano uno strumento molto adatto per analizzare la morfologia ciliare e la localizzazione di noti proteine ciliari in dettaglio.
Figura 1. Preparazione della testa del mouse. (A) Disposizione del posto di lavoro di dissezione. Capsula di Petri è riempito con soluzione di Ringer e ha conseguito un vetrino adesivo. Gli strumenti chirurgici sono raccomandati per la preparazione en face. (B) Dopo aver rimosso una metà della testa del mouse, il setto è esposto. Il setto viene rivestito con epitelio olfattivo (OE) e l'epitelio respiratorio (RE). OB: bulbo olfattivo, V:. Organo vomeronasale (C) Per isolare la parte del setto fiancheggiata da epitelio olfattivo, tagliare il setto lungo le linee dimostrato con un paio di forbici sottili. s: //www.jove.com/files/ftp_upload/52299/52299fig1large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Confronto tra Kirrel2 immunostaining in criosezioni e en preparazioni viso. (A) immagine confocale (sporgenza massima) di un giorno di vita di 60 (P60) cryosection immunostained per Kirrel2 rivela la localizzazione della proteina nei neuroni sensoriali olfattivi. Manopole olfattivi singolo spettacolo forte colorazione e Kirrel2 localizzazione in cilia si presume (asterisco), ma incerto. (B) immagine confocale (massima di proiezione) di un epitelio olfattivo P65 en preparazione face presenta chiara colorazione Kirrel2 in cilia di un sottoinsieme di neuroni sensoriali olfattivi . (Bar Scala, 10 micron)9 / 52299fig2large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Confronto di Mor-EG immunostaining in criosezioni e en preparazioni viso. (A) immagine confocale (sporgenza massima) di un cryosection P60 immunostained per il recettore olfattivo MOR-EG. Localizzazione ciliare è già rilevabile. (B) immagine confocale di un P65 en preparazione faccia immunostained per il recettore olfattivo MOR-EG. mOR-EG è fortemente espresso in cilia di un sottoinsieme di neuroni sensoriali olfattivi. In contrasto criosezioni, caratteristiche cilia relativa lunghezza, il numero delle ciglia a manopola e localizzazione esatta proteine possono essere analizzati. (C) maggiore ingrandimento della zona in scatola in (B). (D) Confocal immagine di un giorno embrionale 18 (E18) en preparazione faccia immunostained per il recettore olfattivo MOR-EG. La colorazione di ciglia può chiaramente vedere. (bar Scala, 10 micron) Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Spring scissors | straight tip, multiple suppliers | ||
| Surgical scissors | sharp and blunt end, multiple suppliers | ||
| Fine forceps | curved tips, Dumont #7, multiple suppliers | ||
| Razor blade | extra thin, multiple suppliers | ||
| Binocular with illumination | multiple suppliers, Stemi 2000-C, Zeiss | ||
| Petri dish | multiple suppliers | ||
| Liquid-blocker pen | Science Services | N71310 | |
| Polysine coated slides | Thermo Scientific | J2800AMNZ | |
| Confocal microscope | Leica Microsystems | TCS SPE | |
| primary antibody Goat anti-Kirrel2 | R&D Systems | AF2930 | 1:200 |
| primary antibody Rabbit anti-mOR-EG | Baumgart et al., 2014 | 1:200 | |
| secondary antibodies | Life Technologies | A21206, A11057 | 1:500 |
| Mounting medium, ProLong Gold antifade reagent | Life Technologies | P36930 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 441244 | toxic, work under fume hood |
References
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