Introduction
Musen lukteepitelet i nesehulen består av 6-10 millioner bipolare olfactory sensoriske nevroner en. Hver lukte nevron velger en av 1200 odorant reseptor gener for uttrykk. Påvisning av odoranter starter ved odorant binding til en olfactory reseptor 2, som så aktiverer adenylylcyklase type III (ACIII) 3 via lukte spesifikke G protein Gα olf 4. Den resulterende økning i cyklisk adenosin monofosfat (cAMP) åpner en cyklisk nukleotid-gated (CNG), ikke-selektivt kation-kanal som fører til tilførsel av Ca2 + og Na +, Ca2 + og deretter tilstrømningen fører til åpning av en Ca2 + aktivert Cl - kanal 5,6. Den resulterende utad Cl - fluks lettes ved en høy intracellulær Cl - konsentrasjon opprettholdes ved jevn Cl - opptak, sannsynligvis via Na + / K + / Cl - kotransporter NKCC1, denCl - / HCO3 - leren SLC4A1, og kanskje flere som ennå ikke er identifisert transportører 6-8.
Bipolare olfaktoriske nerveceller har enkle, uforgrenede aksoner som stikker direkte til luktelappen, og en dendritt som strekker seg til overflaten av epitel og ender som en spesialisert skap, dendrittiske knotten. Fra denne knott, 10-30 cilia, som kan nå en lengde på opp til 50 til 60 um, utgår i det slim som dekker den epiteliale overflate 9. Proteiner av den kanoniske signaltransduksjon kaskade er i hovedsak lokalisert i membranen av disse cilia. Den økte sensorisk overflate av epitel forsterker evnen til å detektere odoranter. På grunn av tettheten av sensoriske nevroner, flimmerhårene som strekker seg fra nabo dendrittiske knotter blander. Denne intermingling resulterer i en tilfeldig blanding av cilia fra forskjellige nerveceller, som uttrykker forskjellige typer olfaktoriske reseptorer på overflaten av epitelet. Påvisning og cellemessig fordeling av ciliare proteiner som bare er til stede i en undergruppe av sensoriske neuroner er derfor vanskelig i frysesnitt. I tillegg er den nøyaktige lokalisering av slike proteiner langs cilia knapt mulig, siden frysesnitt er vanligvis tynnere enn den gjennomsnittlige lengde av cilia.
For å muliggjøre etterforskningen av stråle lokalisering av så langt uncharacterized membran proteiner i olfactory nevroner, vi optimalisert eget ansikt forberedelse teknikk som gjør det detaljert analyse av protein lokalisering i flimmerhårene. I korthet blir musen avlivet og hodet delt nær midtlinjen. Musling, nasal, og frontpartiet bein er fjernet for å eksponere septum. Septum med lukte del av slimhinnen epitel løsnes ved å kutte alle forbindelser til nesehulen. Etter å sette skilleveggen inn i en petriskål fylt med Ringers oppløsning, blir epitelet skrelles av und overføres til en belagt glass-slide. Etter en kort fixation skritt, kan immunofarging prosedyrer utføres hvis håndtering er så skånsom som mulig for å unngå skade på den skjøre vev. Vi demonstrere oppnåelig oppløsning ved å sammenligne farging av to ulike membranproteiner i olfactory flimmerhårene i klassisk frysesnitt og i en face forberedelse beskrevet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Alle dyr prosedyrer ble håndtert ved Charité eller universitetsklinikken i Jena i samsvar med tyske Animal Care lover unngå unødig lidelse for dyrene.
1. Klar Solutions og Dissection arbeidsplassen
- Løsninger
MERK: Forbered følgende løsninger før du starter disseksjon av Epitel.- Løsninger for disseksjon prosedyren:
- Forbered Ringers oppløsning (pH 7,4) med konsentrasjoner på 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM HEPES, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, og 10 mM glukose.
- Tilbered en PBS - / - oppløsning (pH 7,4) med konsentrasjoner på 2,68 mM KCl, 1,47 mM KH 2PO 4, 136 mM NaCl og 8,1 mM Na HPO 2 4.
- Tilbered en fikseringsoppløsning (pH 7,2) med konsentrasjoner på 1 x PBS - / -, 0,2 mM CaCl2, 4% sukrose, og 4% paraformaldehyd. Sukrose i fiksativ løsning forbedrer cryoseksjonering og henting av frysesnitt. Lagre ved -20 ° C.
- Løsninger for fargingsprosedyre
- Forberede en PBS + / + løsning med konsentrasjoner av 1x PBS - / -, 0,48 mM MgCI2, 0,9 mm CaCI2.
- Forberede en PBST + / + løsning med konsentrasjoner av 1x PBS + / + og 0,1% Triton X-100.
- Forberede en blokkering løsning med konsentrasjoner av 1x PBST + / + og 1% gelatin.
- Løsninger for disseksjon prosedyren:
- Arbeidsplass
- For disseksjon arbeidsplassen, bruk en disseksjonsmikroskop med lyse belysning, samt en væske-blocker penn.
- Forberede en petriskål, fylt med Ringers løsning, og lim glassplater.
- Få følgende kirurgiske instrumenter: et par av kirurgiske saks med en skarp og en butt spiss, et par av våren saks med rett spiss form, to pinsett med fin buet spiss form og et barberblad (
2. Utarbeidelse av nasal septum
- Hus dyr i godkjente bur med regelmessig tilgang til mat og vann og passende dag / natt syklus.
- Utføre anestesi i en lukket beholder som inneholder gasbind dynket med 100% isofluran og monitor analgesi ved å teste bakre fot på ballen. Siden halsdislokasjon kan forårsake blod i nesehulene, direkte halshogge bedøvede mus.
- Fjern skinnet å eksponere beinet av hele skallen og nese, og tørke bort den gjenværende blod og vev grundig med et papirhåndkle. Fjern den nedre kjeve og den fremre tenner.
- Langsgående snitt i ryggraden i nesen bilateralt i 1-2 mm avstand parallelt med sutur linje for å skille den ene siden av skilleveggen (medialt) fra kjeve (lateralt). Dele nesen med et enkelt snitt. Hvis beinrester og musling er fortsatt festet til septum, fjerne disse nøye for å avdekke septum heltuten å berøre den.
- Fjern dorsal nesebenet ved å skyve den fine buede tuppen av en pinsett langs ryggsiden av skilleveggen, og skilleveggen mellom nesebenet. Legge litt press på bein, dra den opp og fjerne det.
- For å gi adgang til de to septal vev, en fra hvert hulrom, fjerner kjeve til den andre siden av hodet nøye. Når du forbereder eldre dyr (P> 28), fjerne spissen av pannebenet dekker olfactory pærer.
- Identifisere olfactory epitel ved sin litt gul farge (figur 1B). Den grenser respiratorisk epitel er hvitt og viser bevegelsen av motile cilier som kan sees under disseksjonsmikroskop. Skjær langs grensen mellom olfactory og respiratorisk epitel med et par fine våren saks.
- Forlenge kutt og skille septum fra ventral tilkobling til vomer bein. Deretter skar langs grensen mellom septum og lamina cribrosa av Os ethmoidale. Septum er nå fullstendig isolert fra alle forbindelser til hodet. Bruk skjære stillingene som er vist i figur 1C.
3. Isolasjon av lukteepitelet for Farging
- Plassere et klebeglass i petriskål fylt med Ringer-løsning. Plasser den på kanten av petriskålen, slik at den ene halvparten av glasset ligger i Ringers løsning (figur 1A).
- Bruk en pinsett til å nøye overføre ethmoid bein med olfactory epitel til petriskål. Løft det uten å gripe den med tang tips.
- Grab vinkelrett plate av ethmoid ben med en tang og bruke en andre ene til fjern forsiktig epitel fra den ene siden av skilleveggen. Skyv den buede tuppen mellom vinkelrett plate og epitel å skrelle epitel av.
- Vær alltid sikker på å identifisere ciliary side, i tilfelle Epitel knipser i Ringers solutipå. Hvis Epitel flips, er det neppe mulig å identifisere ciliary side etterpå. Det meste, ruller Epitel opp med ciliary overflate på innsiden.
- Sammenligne registrert vev form med skjære stillingene som er vist i figur 1C. Ta tak i epitel i en posisjon på grensen og dra den på glass lysbilde. Ikke berør ciliary side med pinsett for å unngå skader på vev.
- Snu septum og gjenta prosedyren med epitel fra den andre siden.
- Tørk av glasset lysbilde rundt begge delene lukteepitelet med et papirhåndkle og omkranser vev med en væske-blocker penn.
- Fest vev med 150 ul fikseringsmiddel-løsning i 10 minutter ved RT. Angå cilier stabilitet og integritet, bruke korte feste ganger for en rekke testet antistoffer. Innenfor disse 10 min flimmerhårene er faste, men sannsynligvis ikke hele epitel vev. Dermed umiddelbar visualisere med mikroskop etter de sholde prosedyre. Men kanskje festing ganger variere for den enkelte antistoffer.
4. Farging Protocol
MERK: Håndter vevet veldig nøye for å bevare ciliary strukturer av olfactory sensoriske nerveceller. Fjern løsninger ved pipettering. Ikke slipp noen løsninger direkte på epitel, som mekaniske krefter kan forstyrre den fine flimmerhårene. Utføre alle trinn ved RT hvis ikke annet er oppgitt.
- Fjern det fikserløsningen og vask to ganger med PBS + / +.
- Inkuber epitelet i minst 1 time med blokkeringsløsning.
- Forbered primær antistoffoppløsning ved å oppløse antistoffet i blokkeringsoppløsning (1: 200 for antistoffene som anvendes i denne studien) og sentrifuger i 5 minutter ved full hastighet for å fjerne bunnfall.
- Inkuber epitelet med antistoffløsningen i et fuktig kammer ved 4 ° CO / N.
- Vask epitel med PBS + / + 5 min minst 3 ganger.
- Forbered sekundært antistoff-løsning ved å oppløse antistoffet i blokkeringsoppløsning (1: 500) og sentrifuger i 5 minutter ved full hastighet.
- Inkuber epitelet med sekundært antistoff-løsning i 1 time i et mørkt kammer.
- Vask epitel med PBS + / + 5 min minst 3 ganger.
- Fjern væsken-blocker med et barberblad eller papirhåndkle. Vask epitelet med destillert vann i 5 sek.
- Bevare vevet i antifade montering reagens.
MERK: Bakgrunn fluorescens øker raskt i løpet av dager; mikroskopisk analyse senest to dager etter innstøping i monteringsmedium er derfor anbefalt. Spesiell forsiktighet må utvises for ikke å presse vevet når du søker riktig fokusplanet, siden det kan forårsake alvorlig skade på forberedelse. På grunn av ut-av-fokus fluorescens, er ytterligere etterforskning med konfokalmikroskopi anbefales.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Olfaktoriske epitel en ansikts preparater kan anvendes for å undersøke lokalisering av proteiner i cilia av sensoriske neuroner, slik at den detaljerte undersøkelse av proteiner hvis lokalisering er uklart etter analyse av frysesnitt. Dette problemet kan eksemplifiseres i tilfelle av farging for Kin av IRRE-lignende protein 2 (Kirrel2). Kirrel2 (også kalt Neph3) er medlem av immunglobulin (Ig) super av membran proteiner og fungerer som en homofilist vedheft protein. Det ble vist å spille en rolle i axon-veiledning i det olfaktoriske system, og til å bli uttrykt i en undergruppe av olfaktoriske nerveceller i en aktivitet avhengig måte 10.
Farging for Kirrel2 i en typisk cryosection gjennom lukteepitelet avslørte lokalisering av Kirrel2 i axoner, soma og dendritter (Figur 2A). Alle oppløsninger ble fremstilt som beskrevet ovenfor for en face fremstillingsteknikk. Selv om noen labeling vises på toppen av lag sammensatt av de dendrittiske knotter, forble usikker etter analyse av frysesnitt ciliare lokalisering. Noen nevroner utstilt flekker i og rundt sin lukte knott, men enkeltflimmerhårene var vanskelige å identifisere. I motsetning til dette, en face fremstilling av det olfaktoriske epitel utført i henhold til den ovenfor beskrevne protokoll entydig viste ciliær lokalisering av Kirrel2 (figur 2B). Interessant, Kirrel2 ble bare uttrykt i cilia av en relativt liten del av olfaktoriske nerveceller, selv om analyse av farget frysesnitt viste ekspresjon i en mye større prosentandel av neuroner. Dessuten var det en face forberedelse ikke bare demonstrere ciliær farging generelt, men avslørte variasjoner i ciliary uttrykk mønstre som strekker seg fra nerveceller med mange lange cilier til nevroner med bare noen få korte flimmerhårene. I noen celler, ble Kirrel2 detektert i det dendritiske knotten, men ikke i flimmerhårene som rager ut fra denne bryteren. C ause og funksjonelle relevansen av dette funnet er ikke klarlagt, men det illustrerer potensialet i en face forberedelse til å gi ny innsikt i protein lokalisering i luktesystemet.
I tillegg utførte vi en immunofarging for lukte reseptor MOR-EG, som viser sterk ciliare uttrykk 11. Reseptoren er allerede klart identifiserbar i ciliary lag i frysesnitt (figur 3A). Likevel er ikke mulig analyse av de detaljerte egenskaper som antall flimmerhårene per knott eller lengden på enkelte flimmerhårene. Bruke en face forberedelse, identifisering av flimmerhårene fra nerveceller som uttrykker lukte reseptoren er lett mulig (Figur 3B, C). Den en face forberedelse kan utføres med dyr av ulike aldre. Selv cilier fra prenatal dyr ble vellykket farget og visualisert (Figur 3D).
innhold "> En ansikts preparater representerer derfor et verktøy godt egnet til å analysere Ciliary morfologi og lokalisering av kjente ciliare proteiner i detalj.
Figur 1. Utarbeidelse av musen hodet. (A) Arrangement av disseksjon arbeidsplassen. Petriskål er fylt med Ringers løsning og har en selvklebende glass lysbilde. De kirurgiske instrumentene er anbefalt for en face preparat. (B) Etter å ha fjernet den ene halvdelen av musehodet, er skilleveggen eksponert. Skilleveggen er belagt med olfaktoriske epitel (OE) og respiratorisk epitel (RE). OB: olfactory bulb, V:. Vomeronasal organ (C) for å isolere den delen av skilleveggen foret med olfaktorisk epitel, kuttet skilleveggen langs de viste linjer med et par av fine sakser. s: //www.jove.com/files/ftp_upload/52299/52299fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Sammenligning av Kirrel2 farging i frysesnitt og eget ansikt forberedelser. (A) Confocal bilde (maksimal projeksjon) av en postnatal dag 60 (P60) cryosection immunostained for Kirrel2 avslører protein lokalisering i olfactory sensoriske nerveceller. Enkelt olfactory knotter viser sterk farging og Kirrel2 lokalisering i flimmerhårene antas (stjerne), men usikker. (B) Confocal bilde (maks projeksjon) av en P65 lukteepitelet en face forberedelse viser klart Kirrel2 flekker i flimmerhårene av en undergruppe av olfactory sensoriske nevroner . (Scale barer, 10 mikrometer)9 / 52299fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Sammenligning av MOR-EG farging i frysesnitt og eget ansikt forberedelser. (A) Confocal bilde (maksimal projeksjon) av en P60 cryosection immunostained for lukte reseptor MOR-EG. Ciliær lokalisering er allerede synlig. (B) Confocal bilde av en P65 en face forberedelse immunostained for lukte reseptor MOR-EG. MOR-EG er sterkt uttrykt i flimmerhårene av en undergruppe av olfactory sensoriske nerveceller. I motsetning til frysesnitt, cilia karakteristika vedrørende lengde, antall cilia pr knott og nøyaktig lokalisering protein kan analyseres. (C) Høyere forstørrelse av eske i området (B). (D) Confocal bilde av en embryonale dag 18 (E18) en face forberedelse immunostained for lukte reseptor MOR-EG. Farging av flimmerhårene kan tydelig sees. (Scale barer, 10 mikrometer) Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Spring scissors | straight tip, multiple suppliers | ||
| Surgical scissors | sharp and blunt end, multiple suppliers | ||
| Fine forceps | curved tips, Dumont #7, multiple suppliers | ||
| Razor blade | extra thin, multiple suppliers | ||
| Binocular with illumination | multiple suppliers, Stemi 2000-C, Zeiss | ||
| Petri dish | multiple suppliers | ||
| Liquid-blocker pen | Science Services | N71310 | |
| Polysine coated slides | Thermo Scientific | J2800AMNZ | |
| Confocal microscope | Leica Microsystems | TCS SPE | |
| primary antibody Goat anti-Kirrel2 | R&D Systems | AF2930 | 1:200 |
| primary antibody Rabbit anti-mOR-EG | Baumgart et al., 2014 | 1:200 | |
| secondary antibodies | Life Technologies | A21206, A11057 | 1:500 |
| Mounting medium, ProLong Gold antifade reagent | Life Technologies | P36930 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 441244 | toxic, work under fume hood |
References
- Firestein, S. How the olfactory system makes sense of scents. Nature. 413 (6852), 211-218 (2001).
- Buck, L., Axel, R. A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition. Cell. 65 (1), 175-187 (1991).
- Wong, S. T., et al. Disruption of the type III adenylyl cyclase gene leads to peripheral and behavioral anosmia in transgenic mice. Neuron. 27 (3), 487-497 (2000).
- Belluscio, L., Gold, G. H., Nemes, A., Axel, R. Mice deficient in G(olf) are anosmic. Neuron. 20 (1), 69-81 (1998).
- Brunet, L. J., Gold, G. H., Ngai, J. General anosmia caused by a targeted disruption of the mouse olfactory cyclic nucleotide-gated cation channel. Neuron. 17 (4), 681-693 (1996).
- Reisert, J., Lai, J., Yau, K. W., Bradley, J. Mechanism of the excitatory Cl- response in mouse olfactory receptor neurons. Neuron. 45 (4), 553-561 (2005).
- Hengl, T., et al. Molecular components of signal amplification in olfactory sensory cilia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (13), 6052-6057 (2010).
- Smith, D. W., Thach, S., Marshall, E. L., Mendoza, M. G., Kleene, S. J. Mice lacking NKCC1 have normal olfactory sensitivity. Physiolog., & Behavior. 93 (1-2), 44-49 (2008).
- Menco, B. P.
- Serizawa, S., et al. A neuronal identity code for the odorant receptor-specific and activity-dependent axon sorting. Cell. 127 (5), 1057-1069 (2006).
- Baumgart, S., et al. Scaffolding by MUPP1 regulates odorant-mediated signaling in olfactory sensory neurons. Journal Of Cell Science. 127 (11), 2518-2527 (2014).
- Strotmann, J., Wanner, I., Krieger, J., Raming, K., Breer, H. Expression of odorant receptors in spatially restricted subsets of chemosensory neurones. Neuroreport. 3 (12), 1053-1056 (1992).
- Jenkins, P. M., McEwen, D. P., Martens, J. R. Olfactory cilia: linking sensory cilia function and human disease. Chemical Senses. 34 (5), 451-464 (2009).
- Tadenev, A. L., et al. Loss of Bardet-Biedl syndrome protein-8 (BBS8) perturbs olfactory function, protein localization, and axon targeting. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (25), 10320-10325 (2011).
