Summary

Всего горе Маркировка ресничек в Главном обонятельной системе мышей

Published: December 27, 2014
doi:

Summary

Cilia of olfactory sensory neurons contain proteins of the signal transduction cascade, but a detailed spatial analysis of their distribution is difficult in cryosections. We describe here an optimized approach for whole mount labeling and en face visualization of ciliary proteins.

Abstract

The mouse olfactory system comprises 6-10 million olfactory sensory neurons in the epithelium lining the nasal cavity. Olfactory neurons extend a single dendrite to the surface of the epithelium, ending in a structure called dendritic knob. Cilia emanate from this knob into the mucus covering the epithelial surface. The proteins of the olfactory signal transduction cascade are mainly localized in the ciliary membrane, being in direct contact with volatile substances in the environment. For a detailed understanding of olfactory signal transduction, one important aspect is the exact morphological analysis of signaling protein distribution. Using light microscopical approaches in conventional cryosections, protein localization in olfactory cilia is difficult to determine due to the density of ciliary structures. To overcome this problem, we optimized an approach for whole mount labeling of cilia, leading to improved visualization of their morphology and the distribution of signaling proteins. We demonstrate the power of this approach by comparing whole mount and conventional cryosection labeling of Kirrel2. This axon-guidance adhesion molecule is known to localize in a subset of sensory neurons and their axons in an activity-dependent manner. Whole mount cilia labeling revealed an additional and novel picture of the localization of this protein.

Introduction

Мышь обонятельный эпителий в полости носа состоит из 6-10 млн биполярных обонятельных сенсорных нейронов 1. Каждый обонятельный нейрон выбирает один из 1200 одоранта рецепторных генов для экспрессии. Обнаружение пахучих веществ начинается с одоранта связывания обонятельного рецептора 2, который затем активирует АДЕНИЛАТЦИКЛАЗЫ типа III (ACIII) 3 с помощью обоняния специфического белка G Gα олф 4. В результате рост циклического аденозинмонофосфата (цАМФ) открывает циклических нуклеотидов закрытого (CNG), неселективный катион канал, ведущий к притоку Ca 2+ и Na +, а впоследствии Ca 2+ приток приводит к открытию Са 2+ активированного Cl канал 5,6. Полученный наружу Cl поток способствует высокой внутриклеточной Cl концентрация поддерживается устойчивый Cl поглощение, вероятно, через Na + / K + / Cl котранспортера NKCC1,Cl / HCO 3 теплообменник SLC4A1, и, возможно, дополнительные еще ​​не определены перевозчики 6-8.

Биполярные обонятельные нейроны имеют одно-, неразветвленные аксоны, которые выступают непосредственно к обонятельной луковице, и дендриты, который проходит к поверхности эпителия и заканчивается в качестве специализированного отделения, дендритных ручки. С этой ручкой, 10-30 ресничек, которые могут достигать в длину до 50-60 мкм, исходят в слизи, покрывающей поверхности эпителия 9. Белки канонической каскада трансдукции сигнала в основном локализованы в мембране этих ресничек. Увеличился сенсорная поверхность эпителия усиливает способность обнаруживать отдушки. Из-за плотности сенсорных нейронов, реснички, проходящую от соседних дендритных ручки смешиваются. Это смешение приводит к случайной смеси ресничек из различных нейронов, экспрессирующих различные типы обонятельные рецепторы, на поверхности эпителия. Выявление и клетокулар распределение цилиарных белков, которые присутствуют только в подгруппе сенсорных нейронов поэтому трудно в криосрезов. Кроме того, точная локализация таких белков вдоль ресничек едва возможно, поскольку, как правило, криосрезы тоньше, чем средняя длина ресничек.

Чтобы включить расследование мерцательного локализации до сих пор не охарактеризованных мембранных белков в обонятельных нейронов, мы оптимизировали собственная методика подготовки лица, которая позволяет детальный анализ локализации белка в ресничками. Вкратце, мышь умерщвляют и глава разделена рядом с линии. Раковин, носа и лобной кости удаляют, чтобы обнажить перегородки. Перегородки с обонятельной части футеровки эпителия ослаблен за счет сокращения всех соединений в полость носа. После ввода перегородки в чашку Петри, заполненную раствором Рингера, эпителий отслаивают унд передается на предметное стекло с нанесенным покрытием. После короткого fixatионная шаг, Иммуноокрашивание процедуры могут быть выполнены, если обращение является как можно более плавными, чтобы избежать повреждения хрупкого ткани. Мы демонстрируем достижимое разрешение путем сравнения окраски двух различных мембранных белков в обонятельной ресничек в классических криосрезов и в ванной подготовки лица описаны.

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры на животных были обработаны в Шарите или университетской клинике Йены в соответствии с немецкими законами по уходу за животными, избегая каких-либо необоснованных страданий животных. 1. Подготовка решения и Препарирование на рабочем месте <…

Representative Results

Обонятельный эпителий фас препаратов может быть использован для исследования локализации белков в ресничками сенсорных нейронов, позволяя детальное исследование белков, локализация непонятно после анализа криосрезов. Эта проблема может быть проиллюстрировано в случае окрашив…

Discussion

The en face preparation technique described in this protocol provides a powerful tool for the detailed analysis of the olfactory system. So far, most studies characterizing the localization of signaling proteins use immunostainings of cryosections. They present a good overview of the olfactory epithelium, and protein expression in distinct cell types or regions can be easily identified. However, expression in olfactory cilia is sometimes hard to detect. Even if ciliary localization is obvious, cryosections offer…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was funded by the Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG (Exc257, SFB958).

Materials

Name of Material/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
Spring scissors straight tip, multiple suppliers
Surgical scissors sharp and blunt end, multiple suppliers
Fine forceps curved tips, Dumont #7, multiple suppliers
Razor blade extra thin, multiple suppliers
Binocular with illumination multiple suppliers, Stemi 2000-C, Zeiss
Petri dish multiple suppliers
Liquid-blocker pen Science Services N71310
Polysine coated slides Thermo Scientific J2800AMNZ
Confocal microscope Leica Microsystems TCS SPE
primary antibody Goat anti-Kirrel2 R&D Systems AF2930 1:200
primary antibody Rabbit anti-mOR-EG Baumgart et al., 2014 1:200
secondary antibodies Life Technologies A21206, A11057 1:500
Mounting medium, ProLong Gold antifade reagent Life Technologies P36930
Paraformaldehyde Sigma 441244 toxic, work under fume hood

References

  1. Firestein, S. How the olfactory system makes sense of scents. Nature. 413 (6852), 211-218 (2001).
  2. Buck, L., Axel, R. A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition. Cell. 65 (1), 175-187 (1991).
  3. Wong, S. T., et al. Disruption of the type III adenylyl cyclase gene leads to peripheral and behavioral anosmia in transgenic mice. Neuron. 27 (3), 487-497 (2000).
  4. Belluscio, L., Gold, G. H., Nemes, A., Axel, R. Mice deficient in G(olf) are anosmic. Neuron. 20 (1), 69-81 (1998).
  5. Brunet, L. J., Gold, G. H., Ngai, J. General anosmia caused by a targeted disruption of the mouse olfactory cyclic nucleotide-gated cation channel. Neuron. 17 (4), 681-693 (1996).
  6. Reisert, J., Lai, J., Yau, K. W., Bradley, J. Mechanism of the excitatory Cl- response in mouse olfactory receptor neurons. Neuron. 45 (4), 553-561 (2005).
  7. Hengl, T., et al. Molecular components of signal amplification in olfactory sensory cilia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (13), 6052-6057 (2010).
  8. Smith, D. W., Thach, S., Marshall, E. L., Mendoza, M. G., Kleene, S. J. Mice lacking NKCC1 have normal olfactory sensitivity. Physiolog., & Behavior. 93 (1-2), 44-49 (2008).
  9. Menco, B. P. Ultrastructural aspects of olfactory signaling. Chemical Senses. 22 (3), 295-311 (1997).
  10. Serizawa, S., et al. A neuronal identity code for the odorant receptor-specific and activity-dependent axon sorting. Cell. 127 (5), 1057-1069 (2006).
  11. Baumgart, S., et al. Scaffolding by MUPP1 regulates odorant-mediated signaling in olfactory sensory neurons. Journal Of Cell Science. 127 (11), 2518-2527 (2014).
  12. Strotmann, J., Wanner, I., Krieger, J., Raming, K., Breer, H. Expression of odorant receptors in spatially restricted subsets of chemosensory neurones. Neuroreport. 3 (12), 1053-1056 (1992).
  13. Jenkins, P. M., McEwen, D. P., Martens, J. R. Olfactory cilia: linking sensory cilia function and human disease. Chemical Senses. 34 (5), 451-464 (2009).
  14. Tadenev, A. L., et al. Loss of Bardet-Biedl syndrome protein-8 (BBS8) perturbs olfactory function, protein localization, and axon targeting. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (25), 10320-10325 (2011).

Play Video

Cite This Article
Oberland, S., Neuhaus, E. M. Whole Mount Labeling of Cilia in the Main Olfactory System of Mice. J. Vis. Exp. (94), e52299, doi:10.3791/52299 (2014).

View Video