Hela Mount Märkning av Cilia i huvud Olfactory systemet Möss
Summary
Cilia of olfactory sensory neurons contain proteins of the signal transduction cascade, but a detailed spatial analysis of their distribution is difficult in cryosections. We describe here an optimized approach for whole mount labeling and en face visualization of ciliary proteins.
Abstract
The mouse olfactory system comprises 6-10 million olfactory sensory neurons in the epithelium lining the nasal cavity. Olfactory neurons extend a single dendrite to the surface of the epithelium, ending in a structure called dendritic knob. Cilia emanate from this knob into the mucus covering the epithelial surface. The proteins of the olfactory signal transduction cascade are mainly localized in the ciliary membrane, being in direct contact with volatile substances in the environment. For a detailed understanding of olfactory signal transduction, one important aspect is the exact morphological analysis of signaling protein distribution. Using light microscopical approaches in conventional cryosections, protein localization in olfactory cilia is difficult to determine due to the density of ciliary structures. To overcome this problem, we optimized an approach for whole mount labeling of cilia, leading to improved visualization of their morphology and the distribution of signaling proteins. We demonstrate the power of this approach by comparing whole mount and conventional cryosection labeling of Kirrel2. This axon-guidance adhesion molecule is known to localize in a subset of sensory neurons and their axons in an activity-dependent manner. Whole mount cilia labeling revealed an additional and novel picture of the localization of this protein.
Introduction
Musen luktepitel i näshålan innefattar 6-10.000.000 bipolära lukt sensoriska neuroner 1. Varje lukt neuron väljer en av 1.200 luktreceptorgener för uttryck. Upptäckt av odörer börjar med luktämnen bindning till en luktreceptor 2, som sedan aktiverar adenylylcyklas typ-III (ACIII) 3 via lukt specifika G-protein Ga OLF 4. Den resulterande ökningen av cykliskt adenosinmonofosfat (cAMP) öppnar en cyklisk nukleotid-gated (CNG), icke-selektiva katjon kanal som leder till inflöde av Ca2 + och Na +, och därefter Ca2 + inflöde leder till öppnandet av en Ca2 + aktiverad Cl – kanal 5,6. Den resulterande utåt Cl – flux underlättas av en hög intracellulär Cl – koncentration upprätthålls av stadig Cl – upptag, sannolikt via Na + / K + / Cl – cotransporter NKCC1, denCl – / HCO3 – växlar SLC4A1, och kanske ytterligare ännu inte identifierade transportörer 6-8.
Bipolära lukt nervceller har enkel, ogrenade axoner som skjuter direkt till luktbulben, och en dendrit som sträcker sig till ytan av epitelet och slutar som en specialiserad fack, den dendritiska ratten. Från denna knopp, 10-30 cilier, som kan nå en längd på upp till 50-60 um, utgår i slem som täcker epitelytan 9. Proteiner i den kanoniska signaltransduktion kaskad är huvudsakligen lokaliserade i membranet hos dessa cilier. Den ökade sensoriska ytan av epitelet förstärker förmågan att detektera doftämnen. På grund av tätheten av sensoriska neuroner, flimmerhår som sträcker sig från angränsande dendritiska rattar blandas. Denna sammanblandning resulterar i en slumpmässig blandning av cilier från olika neuroner, som uttrycker olika typer av luktreceptorer, på ytan av epitelet. Detektering och cellenular fördelning av ciliära proteiner som endast förekommer i en delmängd av sensoriska neuroner är därför svårt i kryosnitt. Dessutom är den exakta lokaliseringen av sådana proteiner längs cilier knappt möjligt, eftersom kryosnitt är vanligtvis tunnare än den genomsnittliga längden av cilier.
För att möjliggöra utredning av cilie lokalisering av hittills uncharacterized membranproteiner i doft nervceller, optimerad vi ett eget ansikte förberedelse teknik som tillåter en detaljerad analys av protein lokalisering i cilier. I korthet är musen avlivades och huvudet delas nära mittlinjen. Näsmusslorna, nasal och pannben tas bort för att exponera septum. Den septum med lukt delen av fodret epitel lossas genom att skära alla anslutningar till näshålan. Efter att sätta septum i en petriskål fylld med Ringers lösning, är epitelet avskalas und överförs till en belagd glasskiva. Efter en kort fixation steg, kan immunfärgning förfaranden utföras om hanteringen är så skonsamt som möjligt för att undvika skador på den bräckliga vävnaden. Vi visar uppnåe upplösningen genom att jämföra färgningen av två olika membranproteiner i lukt cilier i klassiska kryosnitt och i en face preparat som beskrivs.
Protocol
Representative Results
Discussion
The en face preparation technique described in this protocol provides a powerful tool for the detailed analysis of the olfactory system. So far, most studies characterizing the localization of signaling proteins use immunostainings of cryosections. They present a good overview of the olfactory epithelium, and protein expression in distinct cell types or regions can be easily identified. However, expression in olfactory cilia is sometimes hard to detect. Even if ciliary localization is obvious, cryosections offer…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by the Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG (Exc257, SFB958).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Spring scissors | straight tip, multiple suppliers | ||
| Surgical scissors | sharp and blunt end, multiple suppliers | ||
| Fine forceps | curved tips, Dumont #7, multiple suppliers | ||
| Razor blade | extra thin, multiple suppliers | ||
| Binocular with illumination | multiple suppliers, Stemi 2000-C, Zeiss | ||
| Petri dish | multiple suppliers | ||
| Liquid-blocker pen | Science Services | N71310 | |
| Polysine coated slides | Thermo Scientific | J2800AMNZ | |
| Confocal microscope | Leica Microsystems | TCS SPE | |
| primary antibody Goat anti-Kirrel2 | R&D Systems | AF2930 | 1:200 |
| primary antibody Rabbit anti-mOR-EG | Baumgart et al., 2014 | 1:200 | |
| secondary antibodies | Life Technologies | A21206, A11057 | 1:500 |
| Mounting medium, ProLong Gold antifade reagent | Life Technologies | P36930 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 441244 | toxic, work under fume hood |
References
- Firestein, S. How the olfactory system makes sense of scents. Nature. 413 (6852), 211-218 (2001).
- Buck, L., Axel, R. A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition. Cell. 65 (1), 175-187 (1991).
- Wong, S. T., et al. Disruption of the type III adenylyl cyclase gene leads to peripheral and behavioral anosmia in transgenic mice. Neuron. 27 (3), 487-497 (2000).
- Belluscio, L., Gold, G. H., Nemes, A., Axel, R. Mice deficient in G(olf) are anosmic. Neuron. 20 (1), 69-81 (1998).
- Brunet, L. J., Gold, G. H., Ngai, J. General anosmia caused by a targeted disruption of the mouse olfactory cyclic nucleotide-gated cation channel. Neuron. 17 (4), 681-693 (1996).
- Reisert, J., Lai, J., Yau, K. W., Bradley, J. Mechanism of the excitatory Cl- response in mouse olfactory receptor neurons. Neuron. 45 (4), 553-561 (2005).
- Hengl, T., et al. Molecular components of signal amplification in olfactory sensory cilia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (13), 6052-6057 (2010).
- Smith, D. W., Thach, S., Marshall, E. L., Mendoza, M. G., Kleene, S. J. Mice lacking NKCC1 have normal olfactory sensitivity. Physiolog., & Behavior. 93 (1-2), 44-49 (2008).
- Menco, B. P. Ultrastructural aspects of olfactory signaling. Chemical Senses. 22 (3), 295-311 (1997).
- Serizawa, S., et al. A neuronal identity code for the odorant receptor-specific and activity-dependent axon sorting. Cell. 127 (5), 1057-1069 (2006).
- Baumgart, S., et al. Scaffolding by MUPP1 regulates odorant-mediated signaling in olfactory sensory neurons. Journal Of Cell Science. 127 (11), 2518-2527 (2014).
- Strotmann, J., Wanner, I., Krieger, J., Raming, K., Breer, H. Expression of odorant receptors in spatially restricted subsets of chemosensory neurones. Neuroreport. 3 (12), 1053-1056 (1992).
- Jenkins, P. M., McEwen, D. P., Martens, J. R. Olfactory cilia: linking sensory cilia function and human disease. Chemical Senses. 34 (5), 451-464 (2009).
- Tadenev, A. L., et al. Loss of Bardet-Biedl syndrome protein-8 (BBS8) perturbs olfactory function, protein localization, and axon targeting. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (25), 10320-10325 (2011).
