Introduction
burun boşluğunda koku epiteli fare 6-10.000.000 bipolar koku duyu nöronları 1 içerir. Her koku nöron ifade 1.200 koku reseptör gen birini seçer. Koku tespiti daha sonra 4 olf koku spesifik G protein Gα üzerinden adenilat siklaz tip III (ACIII) 3 aktive bir koku reseptörü 2, bağlanma odorant başlar. siklik adenozin monofosfat (cAMP) 'de elde edilen artış açan bir nükleotid kapılı seçici olmayan katyon kanalı Ca2 + ve Na +, ve daha sonra, Ca girişine yol, (CNG) 2 + akışı, bir Ca + 2 aktif Cl açılmasına neden olan siklik - Kanal 5,6. dışarı doğru Cı Elde - akışı, yüksek hücre içi Cl kolaylaştırılır -, Na + / K + / Cl ile olası emme -, - ortak taşıyıcı NKCC1, konsantrasyon sabit Cl muhafazaCI - / HCO3 - değiştirici SLC4A1 ve belki ek henüz tespit edilmesi taşıyıcıları 6-8.
Bipolar koku nöronlar tek dalsız koku ampul doğrudan proje akson ve epitel yüzeyine uzanan ve özel bölmesi, dendritik topuzu gibi biten bir dendrit vardır. Kadar um 50-60 kadar bir uzunluğa ulaşabilir, bu topuz, 10-30 kirpikler itibaren, epitel yüzeyi 9 kaplayan mukus içine sızmak. Kanonik sinyal iletimi akışının Proteinler ağırlıklı bu kirpikler zarında lokalize edilmektedir. epitel artan duyusal yüzey Koku moleküllerini tespit etme yeteneğine güçlendirir. Nedeniyle duyusal nöronların yoğunluğunun, komşu dendritik kolları uzanan kirpikler içe. Epitelyumunun yüzeyi üzerine, koku reseptörlerinin farklı ifade eden farklı nöron gelen kirpikler rastgele karışımı içinde bu karışmasının sonucu. algılama ve hücreduyusal nöronların bir alt kümesi, sadece mevcut siliyer proteinlerin nitlerin ayırma cryosections de zordur. Halinde kriyoseksiyonlar kirpikler ortalama uzunluğundan daha tipik olarak daha ince olduğu için ek olarak, kirpikler boyunca bu proteinlerin kesin yeri, hemen hemen mümkün değildir.
Koku nöronlarda kadar uncharacterized membran proteinlerinin siliyer lokalizasyonu soruşturma etkinleştirmek için, biz kirpikler protein lokalizasyonu detaylı analizini sağlayan bir tr yüz hazırlama tekniklerini optimize. Kısaca, fare kurban ve baş orta hatta yakın bölünür. Kıkırdakçıklar burun ve frontal kemik septum maruz bırakmak için çıkarılır. astar epitel koku kısmı ile septum burun boşluğuna tüm bağlantıları keserek gevşetilir. Ringer çözeltisi ile doldurulmuş bir petri kabına septum konulduktan sonra, epitel kaplanmış bir cam slayt aktarılır und soyulur. Kısa bir fixat ardındantaşıma kırılgan doku hasarı önlemek için mümkün olduğunca nazik ise iyon adım, immün işlemleri yapılabilir. Biz klasik cryosections ve tarif tr yüz hazırlık koku kirpikler iki farklı membran proteinlerinin boyama karşılaştırarak elde çözünürlük göstermektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: Tüm hayvan prosedürleri hayvanların herhangi bir gereksiz acı kaçınarak Alman Hayvan Bakım yasalarına uygun olarak Charité veya Üniversite Kliniği Jena ele alındı.
1. hazırlanması Çözümler ve Diseksiyon İşyeri
- Çözümler
NOT: epitel diseksiyonu başlamadan önce aşağıdaki çözümleri hazırlayın.- Diseksiyon işlemi için Çözümler:
- 140 mM NaCI, 5 mM KCI, 10 mM HEPES, 2 mM CaCI2, 1 mM MgCI2 ve 10 mM glukoz konsantrasyonları ile Ringer çözeltisi (pH 7.4) içinde hazırlayın.
- - / - 2.68 mM KCI, 1.47 mM KH 2 PO 4, 136 mM NaCI, 8.1 mM Na-2 HPO 4 konsantrasyonlar çözeltisi (pH 7.4) içinde bir PBS hazırlayın.
- - / -, 0.2 mM CaCI2,% 4 sukroz ve% 4 paraformaldehid 1x PBS konsantrasyonları ile bir tespit çözeltisi (pH 7.2) ile hazırlayın. Sabitleştirici çözelti içinde sukroz kriyo artırırkesit ve pick-up cryosections arasında. -20 ° C'de saklayın.
- Boyama işlemi için çözümler
- 1x PBS konsantrasyonları ile PBS + / + çözeltisi hazırlayın - / -, 0.48 mM MgCl2, 0.9 mM CaCl2.
- 1x PBS + / + ve% 0.1 Triton X-100 konsantrasyonları ile, PBST + / + çözelti hazırlayın.
- 1x PBST ile + / + ve% 1 jelatin konsantrasyonları ile bir blokaj çözeltisi hazırlayın.
- Diseksiyon işlemi için Çözümler:
- Işyeri
- Diseksiyon işyeri için, parlak aydınlatma ile bir diseksiyon mikroskobu, yanı sıra sıvı-bloker kalem kullanın.
- Ringer çözeltisi, ve yapışkan cam lamlar ile doldurulmuş bir petri kabı, hazırlanır.
- Aşağıdaki cerrahi aletler elde: cerrahi makas keskin ve bir künt ucu, düz uç şekli ile yaylı makas, ince kavisli ucu şekli ve bir jilet ile iki forseps bir çift (olan
Burun Septumu 2. Hazırlık
- Gıda ve su ve uygun gündüz / gece döngüsü düzenli erişimi onaylı kafeslerde ev hayvanları.
- Arka ayak refleksleri test ederek% 100 izofluran ve monitör analjezi ile ıslatılmış bir kapalı hazne içeren gazlı bez anestezi gerçekleştirin. Servikal dislokasyon burun boşlukları kan neden olabildiğinden, doğrudan anestezi uygulanmış farelerin başını kesmek.
- Tüm kafatası ve burun kemiği açığa çıkarmak için deri kaldırmak ve iyice bir kağıt havlu kullanarak kalan kan ve doku silin. Alt çene ve ön dişleri çıkarın.
- Maksilla (yanal) den septum (medial) bir tarafını ayırmak için sütür hattına 1-2 mm mesafe paralel bilateral burun dorsal kemik İnsizyon. Tek bir kesim ile burun bölün. Kemik kalıntıları ve konka hala septum takılı ise, dikkatlice çıkarın tamamen septum maruzdokunmadan.
- Septum ve burun kemiği arasında, septum dorsal kenarı boyunca bir forseps ince kavisli ucu kaydırarak dorsal nazal kemiği çıkarın. , Kemik üzerinde hafif basınç uygulayın yukarı itin ve çıkarın.
- Her bir oyuğun iki septum dokulara erişime bir sağlamak için dikkatli bir şekilde baş diğer tarafında maksilla çıkarın. Büyük hayvanlar (> 28 P) hazırlanırken, koku ampuller kapsayan frontal kemik ucu çıkarın.
- Onun hafif sarı renk (Şekil 1B) tarafından koku epiteli belirleyin. sınırındaki solunum epiteli beyaz ve mikroskop altında görülebilir hareketli kirpikler hareketini gösterir. İnce bahar makasla ile koku ve solunum epiteli arasındaki sınır boyunca kesin.
- Kesim uzatın ve vomer kemik ventral bağlantıdan septum ayırın. Sonra septum ve Os etmoidit lamina cribrosa arasındaki sınır boyunca kesilmişör. septum artık tamamen kafasına bütün bağlantıları izole edilir. Şekil 1C gösterilen kesme konumlarını kullanın.
Immün için Koku Epitelinin 3. İzolasyonu
- Ringer çözeltisi ile doldurulmuş bir petri yapışkan bir cam slayt yerleştirin. Camın bir yarım Ringer çözeltisi (Şekil 1A) 'de yer alan şekilde, bir petri kenarına yerleştirin.
- Dikkatle petri koku epiteli ile etmoid kemik aktarmak için bir forseps kullanın. Forseps ipuçları ile kapma olmadan kaldırın.
- Bir forseps ile etmoid kemiğin dik plaka tut ve dikkatli septum bir taraftan epitel kaldırmak için ikinci bir birini kullanın. Epitel kalkmasına dik plaka ve epiteli arasındaki kavisli ucu kaydırın.
- Epitel Ringer soluti çevirir durumunda, siliyer tarafını belirlemek her zaman emin olunüzerine. Epitel çevirir ise, sonradan siliyer tarafı belirlemek pek mümkün değildir. Çoğunlukla, epitel içindeki silier yüzeyi ile rulo.
- Şekil 1C gösterilen kesme pozisyonları ile kayıtlı doku şeklini karşılaştırın. Sınırda bir pozisyonda epitel tut ve cam slayt üzerine çekin. Doku lezyonları önlemek için forseps ile siliyer tarafına dokunmayın.
- Septum çevirin ve diğer taraftan epitel ile işlemi tekrarlayın.
- Bir kağıt havlu ile koku epiteli iki adet etrafında cam slayt kurulayın ve bir sıvı-bloker kalemle doku çevreler.
- Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 150 ul sabitleyici çözeltisi ile doku sabitleyin. Kirpikler stabilite ve bütünlüğü ile ilgili olarak, test edilen antikorların çeşitli kısa sabitleme kez kullanmak. Bu 10 dakika kirpikler içinde sabit, ama muhtemelen bütün epitel dokusu vardır. Bu durumda, hemen s sonra mikroskop ile görselprosedürü yükümlüsünüzdür. Ancak, sabitleyici katı bireysel antikorlar için değişiklik gösterebilir.
4. Boyama Protokolü
NOT: koku alma duyu nöronlarının siliyer yapıları korumak için çok dikkatli doku tutun. Pipetleme çözüm çıkarın. Mekanik kuvvetler ince kirpikler bozabilir gibi, epiteli üzerine doğrudan herhangi bir çözüm düşürmeyin. Başka türlü belirtilmediği sürece, oda sıcaklığında bütün adımları.
- Sabitleştirici çözüm çıkarın ve PBS + / + 2 kez yıkayın.
- Bloke etme çözeltisi ile en az 1 saat süre ile epitel inkübe edin.
- Herhangi bir çökelti kaldırmak için tam hızda 5 dakika boyunca (bu çalışmada kullanılan antikorlar için 200 1) ve santrifüj çözeltisi bloke antikor eritilmesi ile primer antikor çözeltisi hazırlayın.
- 4 ° CO / K bir nemli oda içinde antikor çözeltisi ile epitel inkübe edin.
- PBS + / + için 5 dakika ile yıkayın epitel en az 3 kez.
- Tam hızda 5 dakika boyunca ve santrifüj: çözeltisi (1: 500) bloke antikor eritilmesi ile ikincil antikor çözeltisi hazırlayın.
- Bir karanlık oda içinde 1 saat süre ile ikinci antikor çözeltisi ile epitel inkübe edin.
- PBS + / + için 5 dakika ile yıkayın epitel en az 3 kez.
- Bir jilet veya kağıt havlu ile sıvı-bloker çıkarın. 5 saniye süreyle damıtılmış su ile epitel yıkayın.
- Antifade montaj reaktif doku korur.
NOT: gün içinde hızlı bir şekilde arka plan flüoresan artar; en geç 2 gün içerisinde montaj ortamda gömme sonra mikroskobik analiz nedenle tavsiye edilir. Özel bakım Doğru odak düzlemi ararken ciddi hazırlık zarar verebilir, çünkü doku sıkmak için değil alınmalıdır. Nedeniyle out-of-odak floresan, konfokal mikroskobu ile daha fazla incelenmesi tavsiye edilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Yüz hazırlıkları tr Koku epitel olan yerelleştirme cryosections analizinden sonra belirsizdir proteinlerin detaylı soruşturma izin, duyusal nöronların kirpikler proteinlerin yerelleştirme incelemek için kullanılabilir. Bu sorun, Irre benzeri protein 2 (Kirrel2) olarak Kin için boyama durumunda örnek olarak gösterilebilir. (Aynı zamanda Neph3 olarak da adlandırılır) Kirrel2 bir homofilik yapışma proteini olarak zar proteinleri ve fonksiyonların immünoglobulin (Ig) süper ailesinin bir üyesidir. Bu koku sistemi akson-rehberlik bir rol oynadığı için, ve bir faaliyet bağlı bir şekilde 10 koku nöronların bir alt kümesi olarak eksprese edildiği gösterilmiştir.
Koku epiteli ile tipik bir cryosection içinde Kirrel2 için immün aksonlar, soma ve dendritler (Şekil 2A) içinde Kirrel2 lokalizasyonu ortaya koymuştur. Tr yüz hazırlama tekniğine için yukarıda tarif edildiği gibi bütün solüsyonlar hazırlanmıştır. Bazı l rağmenAbeling dendritik kolları oluşan bir tabakanın üstünde, siliyer lokalizasyonu cryosections analizi sonra belirsiz kalmıştır görüntülenir. Bazı nöronlar ve onların koku alma topuzu etrafında boyama sergiledi, ancak tek kirpikler tespit etmek zor. Bunun aksine, yukarıda tarif edilen protokole uygun olarak gerçekleştirildi koku epitel yüz hazırlanması en açık bir şekilde Kirrel2 (Şekil 2B), siliyer göstermedi. Lekeli cryosections analizi nöronların çok daha büyük bir yüzdesi olarak ifade gösterilmesine rağmen İlginç bir şekilde, Kirrel2 yalnızca, koku nöron nispeten küçük bir alt kirpikler cinsinden ifade edildi. Ayrıca, en yüz hazırlığı sadece genel olarak siliyer boyama göstermek, ancak birçok uzun kirpikler ile nöronların sadece birkaç kısa kirpikler ile nöronlar arasında değişen siliyer ifade şekillerindeki farklılıklar ortaya vermedi. Bazı hücrelerde, Kirrel2 ancak bu düğme uzanan siliyalarda, dendritik topuzu saptandı. c ause ve bu bulgunun fonksiyonel önemi aydınlatılamamıştır gerekmektedir, ancak bu koku sisteminde protein lokalizasyonu yeni bakış açıları sağlamak için en yüz hazırlık potansiyelini göstermektedir.
Ayrıca, biz güçlü siliyer ifade 11 sergileyen koku reseptörü mOR-EG, bir immün gerçekleştirdi. reseptörü zaten cryosections siliyer tabakası (Şekil 3A) açıkça tanımlanabilir. Bununla birlikte, bu düğme başına kirpikler sayısına ya da tek tek kirpikler uzunluğu ayrıntılı özelliklerinin analizi mümkün değildir. Koku reseptörü ifade nöronlardan tr yüz hazırlığı, kirpikler kimlik kullanma (Şekil 3B, C) kolayca mümkündür. tr yüz hazırlama, farklı yaşlardaki hayvanlar ile yapılabilir. Prenatal hayvanlardan da kirpikler başarılı bir şekilde boyanmıştır (Şekil 3D) görselleştirilmiştir.
Yüz hazırlıkları En içeriği "> bu nedenle de siliyer morfolojisi ve detaylı tanınmış siliyer proteinlerin yerelleştirme analiz için uygun bir araç temsil eder.
Fare kafasının hazırlanması 1. Şekil. Diseksiyon işyerinde (A) düzenlenmesi. Petri kabı Ringer çözeltisi ile doldurulmuş ve bir yapışkan cam slayt tutar. cerrahi aletler yüz hazırlığı tr için tavsiye edilir. (B) fare başın bir yarısını çıkardıktan sonra, septum maruz kalmaktadır. septum koku epiteli (OE) ve solunum epiteli (RE) ile kaplanır. OB: koku alma ampul, V:. Bu organ (C) koku epiteli ile kaplı septum kısmını izole etmek için, ince bir makas ile ortaya çizgisinde septum kesti. s: //www.jove.com/files/ftp_upload/52299/52299fig1large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için burayı tıklayınız.
Cryosections ve yüz hazırlıkları tr Kirrel2 immün 2. Karşılaştırma Şekil. Kirrel2 immunohistokimyasal doğum sonrası gün 60 (P60) cryosection (A) Konfokal görüntüsü (maksimum projeksiyon) koku duyu nöronlarında protein lokalizasyonu ortaya koymaktadır. Tek koku topuzlar, güçlü boyama ve Kirrel2 kirpikler yerelleştirme varsayılır (yıldız), ama belirsiz gösteriyor. Bir P65 koku epiteli (B) Konfokal görüntü (maksimum projeksiyon) yüz hazırlık koku duyu nöronlarının bir alt kümesi kirpikler açık Kirrel2 boyama sergiler tr . (Ölçek bar, 10 mikron)9 / 52299fig2large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için burayı tıklayınız.
Cryosections ve yüz hazırlıkları tr MOR PM-EG immün 3. karşılaştırılması Şekil. Koku reseptörü mOR-EG için immunohistokimyasal bir P60 cryosection (A) Konfokal görüntü (maksimum projeksiyon). Silier yerelleştirme zaten algılanabilir. (B) koku reseptörü mOR-EG için immunohistokimyasal yüz hazırlık tr p65 Konfokal görüntü. Mor-EG güçlü koku duyu nöronlarının bir alt kümesi kirpikler olarak ifade edilir. Cryosections aksine, sil özellikleri uzunluğu, düğme ve kesin bir protein lokalizasyonu analiz edilebilir başına kirpikler sayısı ile ilgili. (B) 'de kutulu alanı (C) daha yüksek bir büyütme. (D) Confockoku reseptörü mOR-EG için immunohistokimyasal yüz hazırlık tr bir embriyonik gün 18 (E18) al görüntüsü. Kirpikler lekelenmesi açıkça görülebilir. (Ölçek bar, 10 mikron) Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Spring scissors | straight tip, multiple suppliers | ||
| Surgical scissors | sharp and blunt end, multiple suppliers | ||
| Fine forceps | curved tips, Dumont #7, multiple suppliers | ||
| Razor blade | extra thin, multiple suppliers | ||
| Binocular with illumination | multiple suppliers, Stemi 2000-C, Zeiss | ||
| Petri dish | multiple suppliers | ||
| Liquid-blocker pen | Science Services | N71310 | |
| Polysine coated slides | Thermo Scientific | J2800AMNZ | |
| Confocal microscope | Leica Microsystems | TCS SPE | |
| primary antibody Goat anti-Kirrel2 | R&D Systems | AF2930 | 1:200 |
| primary antibody Rabbit anti-mOR-EG | Baumgart et al., 2014 | 1:200 | |
| secondary antibodies | Life Technologies | A21206, A11057 | 1:500 |
| Mounting medium, ProLong Gold antifade reagent | Life Technologies | P36930 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 441244 | toxic, work under fume hood |
References
- Firestein, S. How the olfactory system makes sense of scents. Nature. 413 (6852), 211-218 (2001).
- Buck, L., Axel, R. A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition. Cell. 65 (1), 175-187 (1991).
- Wong, S. T., et al. Disruption of the type III adenylyl cyclase gene leads to peripheral and behavioral anosmia in transgenic mice. Neuron. 27 (3), 487-497 (2000).
- Belluscio, L., Gold, G. H., Nemes, A., Axel, R. Mice deficient in G(olf) are anosmic. Neuron. 20 (1), 69-81 (1998).
- Brunet, L. J., Gold, G. H., Ngai, J. General anosmia caused by a targeted disruption of the mouse olfactory cyclic nucleotide-gated cation channel. Neuron. 17 (4), 681-693 (1996).
- Reisert, J., Lai, J., Yau, K. W., Bradley, J. Mechanism of the excitatory Cl- response in mouse olfactory receptor neurons. Neuron. 45 (4), 553-561 (2005).
- Hengl, T., et al. Molecular components of signal amplification in olfactory sensory cilia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (13), 6052-6057 (2010).
- Smith, D. W., Thach, S., Marshall, E. L., Mendoza, M. G., Kleene, S. J. Mice lacking NKCC1 have normal olfactory sensitivity. Physiolog., & Behavior. 93 (1-2), 44-49 (2008).
- Menco, B. P.
- Serizawa, S., et al. A neuronal identity code for the odorant receptor-specific and activity-dependent axon sorting. Cell. 127 (5), 1057-1069 (2006).
- Baumgart, S., et al. Scaffolding by MUPP1 regulates odorant-mediated signaling in olfactory sensory neurons. Journal Of Cell Science. 127 (11), 2518-2527 (2014).
- Strotmann, J., Wanner, I., Krieger, J., Raming, K., Breer, H. Expression of odorant receptors in spatially restricted subsets of chemosensory neurones. Neuroreport. 3 (12), 1053-1056 (1992).
- Jenkins, P. M., McEwen, D. P., Martens, J. R. Olfactory cilia: linking sensory cilia function and human disease. Chemical Senses. 34 (5), 451-464 (2009).
- Tadenev, A. L., et al. Loss of Bardet-Biedl syndrome protein-8 (BBS8) perturbs olfactory function, protein localization, and axon targeting. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (25), 10320-10325 (2011).
