The present article describes the methodological considerations for several non-invasive assessments of vascular function and morphology that are commonly used in medical research to assess different stages of atherosclerosis.
The endothelium is the innermost lining of the vasculature and is involved in the maintenance of vascular homeostasis. Damage to the endothelium may predispose the vessel to atherosclerosis and increase the risk for cardiovascular disease. Assessments of peripheral endothelial function are good indicators of early abnormalities in the vascular wall and correlate well with assessments of coronary endothelial function. The present manuscript details the important methodological steps necessary for the assessment of microvascular endothelial function using laser Doppler imaging with iontophoresis, large vessel endothelial function using flow-mediated dilatation, and carotid atherosclerosis using carotid artery ultrasound. A discussion on the methodological considerations for each of the techniques is also presented, and recommendations are made for future research.
Den endotel er den inderste foring af karrene og er involveret i opretholdelsen af vaskulær homeostase via reguleringen af et væld af vasoaktive processer. Forstyrrelse disse processer kan prædisponere fartøjet til åreforkalkning og øge risikoen for hjerte-kar-sygdom (CVD) 1. Perifer endotelfunktion er en god indikator for tidlige abnormiteter i den vaskulære væg 2. Endvidere har vist foranstaltninger perifer endotelfunktion at afspejle koronar endotel funktion 3-5, og som sådan betragtes som gode indikatorer for hjertekarsygdomme 6-9. Det er måske ikke overraskende i betragtning af at åreforkalkning nu er bredt værdsat at være en systemisk lidelse 10. Vurderinger af perifer endotelfunktion typisk kvantificere vasodilatorisk reaktion af fartøjet til en bestemt stimulus, med en dæmpning på den henholdende svar indikerer endotelkan måles dysfunktion 11, og i forskellige kar. Vurderinger af avancerede strukturelle ændringer i beholderen kan karakteriseres ved ultralydsundersøgelse af intima-media tykkelse.
I mikrocirkulationen, kan laser Doppler flowmetri (LDF) og Laser Doppler imaging (LDI) med iontoforese af vasodilaterende agonister give nyttige oplysninger om mikrovaskulær perfusion 12. Begge teknikker måle Doppler shift skabt af spredt lys i at bevæge røde blodlegemer. Perfusion er repræsenteret som blod flux snarere end blod flow (ml / min), med blod flux afspejler gennemsnit røde blodlegemer hastighed og koncentration. Måling af blod flux lineært forbundet med faktiske blodgennemstrømning 13. Vurderingen af LDI giver betydelige fordele i forhold til LDF, fordi i modsætning til LDF, kan LDI scanne over et stort område således tegner sig for heterogenitet i blodgennemstrømningen i huden og øge reproducerbarheden af teknikken12.
Stimulus for at øge blod flux under LDI er tilvejebragt ved iontoforese af vasodilaterende agonister acetylcholin (ACh) og natriumnitroprussid (SNP), som vurderer endotel-afhængige og endotel-uafhængige funktion henholdsvis ind i huden ved hjælp af en svag elektrisk strøm 14. Når gennem huden, ACh binder til endotelcelle muscarinreceptorer frigiver det karudvidende nitrogenoxid (NO). Anvendelsen af SNP direkte aktiverer glat muskel-cellereceptorer for at tillade maksimal vasodilation af fartøjet, og undersøgelse af glat muskulatur integritet 15. Der er en vis usikkerhed om, hvorvidt ACh-medieret dilatation indebærer nogen overhovedet, som ACh kan stimulere ikke-NO veje såsom cycloxygenase-medierede veje 12. Ikke desto mindre har vi tidligere rapporteret, at ACh og SNP svar er forringet i patientpopulationer med øget risiko for CVD 16 og at motion interventioner kendt for at forbedre Nej bioactivity også forbedre ACh-medieret blod flux hjælp LDI 17. Køretøjet til transport af stoffer ind i huden mikrokar omfatter ofte natriumchlorid eller demineraliseret vand 18,19. Mikrovaskulær endotelfunktion kan kvantificeres ved hjælp af forskellige metoder, med kutan vaskulær konduktans – et produkt af flux divideret med arterietryk, der anvendes i undersøgelser, hvor blodtrykket kan ændre sig på studiet varighed (dvs. under træning eller antihypertensiv behandling) 12. En anden almindeligt anvendt kvantificering er at beregne arealet under kurven for blod flux eller udtrykker den procentvise stigning i flux fra baseline. Det er vigtigt at bemærke, at der ikke er nogen fastlagt retningslinjer for at præsentere data, men efterforskerne bør udnytte en tilgang, der viser god reproducerbarhed.
I de store skibe, der er flow-medieret dilatation (FMD) og glyceryl-trinitrat medieret dilatation (GTN) udføres for at vurderes endotel-afhængige og endotel-uafhængige funktion henholdsvis 20. MKS udføres typisk i pulsåren, hvor en manchet anvendes for at okkludere arteriel blodgennemstrømning i 5 minutter; frigivelse af manchetten forårsager en pludselig stigning i blodgennemstrømning (reaktiv hyperæmi) gennem pulsåren resulterer i shear stress medieret dilatation af fartøjet. Baseline og post-manchetfrigivelse diameter kvantificeres ved ultralydsscanning af fartøjet med efterfølgende vurderinger af diameteren fartøjet udføres manuelt 20 eller ved hjælp af automatiseret kant afsløring software 21,22. Anvendelsen af GTN hjælper med at bestemme, om abnormiteter i vasodilatation skyldes et tab i glatte muskelceller integritet eller svækket frigivelse af NO fra endotelceller 23. MKS og GTN er udtrykt som den procentvise stigning i post-stimulus fartøj diameter i forhold til baseline diameter.
Den korrekte vurdering af mund- og klovesyge kræver en rækkevigtige overvejelser i forsøgsprotokollen 24,25. Varigheden af manchetten okklusion skal omhyggeligt timet; 5 min af manchet okklusion er tilstrækkelig til NO-medieret dilatation mens længere manchet okklusion resulterer i ikke-NO medieret dilatation 26. Ligeledes, placering af den okkluderende manchetten omkring håndleddet og distalt fra ultralydsonden overvejende påberåber NO-medieret dilatation, mens manchetten placering på overarmen og proximalt til proben kun delvis stimulerer NO 27. Det er også vigtigt at måle peak dilatation efter manchet deflation i en længere periode, da måling af peak diameter inden for de første 60 sek efter manchet deflation kan undervurdere MKS via 25-40% 28. Faktisk en periode på 180 sek vil sandsynligvis være tilstrækkeligt til at fange ægte peak diameter, med de fleste spidsværdier forekommer inden for de første 120 sek 28.
Stimulus for mund- og klovesyge indebæres produktion af forskydningsspænding, som aktiverer specifikke endotel receptorer til at frigive NO 29. Men forskydningsspænding kan også aktivere flere andre vasoaktive faktorer (hvoraf nogle kan forårsage vasokonstriktion) 30, gør det nødvendigt, at det fremkaldte forskydningsspænding stimulus afspejler vasodilation fra NO veje 26. Det er også vigtigt at tage højde for forskydningsspænding stimulus i mund- og klovsyge, med beregning af forskydningshastighed (hastighed / diameter), der tjener som en passende foranstaltning forskydningsspænding, men ikke nødvendigvis afspejler peak flow 31. De seneste fysiologiske anbefalinger tyder på, at forskydningsspændingen profil altid bør karakteriseres ved ultralyd systemer tillader samtidig måling af puls bølge hastighed og aktiv B-mode billeddannelse i duplex 25.
Vurdering af halspulsårer ved hjælp B-mode ultralyd kan give oplysninger om carotis intima-media tykkelse (CIMT), og var første described i 1986 af pignoli og kolleger 32. Vurdering af CIMT afspejler proliferation af glatte muskelceller i intima af fartøjet og er en nyttig indikator for kliniske hændelser i tidlig atherosklerose 33. Carotis ultralyd kan ofte forudsige arteriel struktur bedre end lignende teknikker (såsom magnetisk resonans-billeddannelse eller radiografiske vurderinger) 34. Desuden CIMT associerede med en række klassiske CVD risikofaktorer, herunder ældning, hypertension og dyslipidæmi 35. Ændringer i væggene af halspulsåren sædvanligvis initieres af en reduktion i NO biotilgængelighed, som fremmer inflammation inden i beholderen 36. Den fælles carotis arterie, arteria carotis interna og carotis bifurkationsbetingelser point kan anvendes til at bestemme CIMT, som hvert sted på samme måde kan forudsige kardiovaskulære hændelser 37.
I det foreliggende manuskript, vi giver detaljeret metode om vurdering af microvascular endotelfunktion (LDI med iontoforese), stort fartøj endotelfunktion (FMD og GTN) og vaskulær morfologi (CIMT). Aterosklerose er en multi-trins proces, der begynder med endotel dysfunktion og slutter med fokale atherosklerotiske læsioner i de store arterier. Begrundelsen for at vælge de ovennævnte evalueringer er, at de afspejler de forskellige stadier af åreforkalkning og bidrage til at redegøre for den heterogene karakter af karrene 38. Desuden har vi tidligere vist, at i en population af patienter med øget risiko for CVD, mikrovaskulære endotel funktion var uafhængig af store fartøj endotelfunktion 39, og funktionelle vurderinger var uafhængige af strukturelle vurderinger af karrene 40. Derfor kan overordnede vurderinger af karrene med til at dechifrere de forskellige stadier af åreforkalkning.
Den nuværende manuskript detaljer metoden af flere særskilte vurderinger af vaskulær funktion og morfologi, der kan udføres i det perifere kar. Hver vurdering giver oplysninger om de forskellige stadier af åreforkalkning, og være med til at karakterisere den vaskulære profil forskellige vaskulære områder.
Vi har tidligere rapporteret, at mikrovaskulære endotel funktion er uafhængig af store kar endotelfunktion i en population af rheumatoid arthritis patienter med øget risiko for CVD 39. Desuden vurderinger af vaskulær funktion og morfologi var også uafhængige af hinanden i den samme gruppe af patienter og hos patienter med CVD 40,41. Disse resultater kan forklares med heterogenitet funktion og struktur af endotelceller i forskellige vaskulære områder 38, samt en mulig forsinkelse for progression af funktionelle ændringer morfologiskeAbnormiteter i beholderen. En undersøgelse foretaget af Hashimoto og kolleger 42 afsløret, at flere deltagere med åreforkalkning var faldet mund- værdier, men de normale CIMT værdier. Disse resultater tyder på, at behandlingen af subklinisk aterosklerose ved hjælp af en række forskellige metoder er vigtigt at dechifrere de globale virkninger af CVD.
Betydningen af mikrovaskulaturen i sundhed og sygdom vinder stadig større opmærksomhed i den medicinske litteratur. De mikrokar danner et langt større areal end store skibe gør dem væsentlige mål for skader fra skadevoldende stimuli 43. Det er blevet antaget, at mikrokar kan være den primære kilde af inflammatoriske mediatorer, som infiltrerer endotelet i de større fartøjer, der fører til dannelse af læsioner 43. I type II diabetikere, mikrovaskulære sygdom ofte går forud store fartøj sygdom 44, og i andre populationer med øget risiko for CVD såsom rheumatoid arthritis, indgreb, der mindsker CVD-risiko forbedre mikrovaskulære, men ikke stort fartøj, endotelfunktion 45,46. Kollektivt, disse resultater tyder på, at undersøgelsen af mikrovaskulære funktion kan hjælpe med at forstå de komplekse mekanismer, der initierer åreforkalkning.
I det foreliggende arbejde, blev vurderingen af mikrovaskulære endotel funktion udføres ved hjælp af LDI med iontoforese af vasoaktive midler. Kan bruges flere andre vurderinger til at vurdere mikrovaskulære funktion, herunder nailfold capillaroscopy og venøs okklusion plethysmografi. Imidlertid er den tidligere vurdering giver oplysninger om kun mikrovaskulær morfologi, mens sidstnævnte er tidskrævende og i nogle protokoller invasive grund administration af intra-brachial vasoaktive midler 1. I modsætning hertil LDI tilbyder en enkel, tidsbesparende fremgangsmåde til måling af mikrovaskulær perfusion af huden blodkar som respons på vasoaktive midler, der administreres ikke-invasholdsvis. Målingen af hudens blodgennemstrømning har vundet udbredt accept i litteraturen på grund af sin lette tilgængelighed og stærk korrelation med etablerede CVD 12. Desuden fordel LDI forhold til andre Doppler teknikker, såsom laser-doppler-flowmetri, er, at det samtidigt kan scanne flere punkter i et givet område og kan derfor udgøre cellulære bevægelse artefakter og rumlige forskelle i blodgennemstrømningen i huden, som begge kan påvirke perfusion af fartøjet 47,48.
På trods af de åbenlyse fordele ved iontoforese, er det vigtigt at bemærke, at inducerede strøm vasodilatation (CIV) fra iontoforese kan forvirre virkningerne af vasoaktive midler, især ved katoden. Valget af køretøj for drug delivery kunne bidrage til at reducere denne effekt, med 0,5% natriumchlorid (som anvendes i den nuværende protokol) effektive til at begrænse CIV 18. Desuden brug af kamre større diameter og lav elektrisk CURhusleje (som anvendes i den nuværende protokol) alle med til at reducere CIV 18. Anvendelse af en kontrol er også blevet anbefalet 12. Biologiske og adfærdsmæssige faktorer kan også påvirke pålidelighed og gentagelsesnøjagtighed af teknikken. For eksempel har Døgnsvingninger og rygning vist sig at påvirke mikrovaskulære endotel funktion 49,50. Strenge optageforhold skal overholdes for at opnå nøjagtige resultater og fastlagte retningslinjer bør følges ved udformningen protokoller 12.
Måling af MKS og GTN-medieret dilatation giver information om endotel dysfunktion i de store blodkar, og anvendes bredt i ikke-invasiv vaskulær forskning. MKS teknik giver surrogat oplysninger om NO biotilgængelighed og er en nyttig prognostisk markør for hjertetilfælde hos forskellige kliniske populationer 7-9. I det foreliggende arbejde, protokollen fremlagt regnskab for mange af de faktorer,er nødvendige for en tilstrækkelig stimulering af NO-medieret vasodilatation 25. For eksempel blev den okkluderende manchet placeret distalt i forhold til ultralydsonden og omkring håndleddet 27, varigheden af iskæmi var 5 min 26 og tilstrækkelig tid lodes optage den "sande" peak diameter efter reaktiv hyperæmi 28. Desværre har protokollen ikke omfatter karakterisering af forskydningsspændingen profil som den automatiske kant afsløring software ikke tillod samtidig optagelse af skib diameter og puls bølge hastighed signal. Beregningen af forskydningsspænding er en integreret nøjagtig måling af mund- og klovsyge 26 og vi anbefalede, så vidt muligt, vaskulære forskergrupper bruger software, der gør det muligt for sådanne målinger skal udføres.
Vurderinger af MKS og GTN-medieret dilatation er også modtagelige for miljømæssige og biologiske variationer 24, da små ændringer i vaskulær diameter kanfremkalde store FMD / GTN svar. For eksempel er typiske MKS værdier for raske deltagere spænder fra 5-10% 51, hvilket svarer til 0,25 – 0,5 mm ændring i arterielt diameter for en arterie med en diameter på 5 mm. I betragtning af sådanne små ændringer i arteriel diameter, skal omhyggelig vægt på tekniske og biologiske faktorer, der kan påvirke målingen. Faktisk kan FMD være påvirket af en lang række biologiske og adfærdsmæssige faktorer som sympatisk aktivering 52, søvnmangel 53, koffein forbrug 54, rygning 55, antioxidant terapi 56 og tidspunkt på dagen 57. Det er derfor vigtigt at kontrollere for disse forhold ved at udnytte oplysninger fra fastlagte retningslinjer 24,25.
Vurdering af avancerede men subklinisk atherosklerose blev gjort ved hjælp af CIMT. Teknikken er blevet udnyttet i flere kliniske populationer og giver meget detaljeret om arteriel structure forhold til mere sofistikerede teknikker såsom magnetisk resonans-billeddannelse 34. Som med de andre vaskulære teknikker, måling af CIMT kræver nøje overvejelse af de tekniske faktorer, som kan påvirke målingen. Generelt bør CIMT udføres i områder fri plak i langt væg af den fælles halspulsåre. Svarende til mund- og klovsyge, måling af CIMT udføres under anvendelse af høj opløsning ultrasonography og så er meget bruger-afhængig. Rapporteret variationskoefficient (CofV) interval 2,4-18,3% 58, mens den for mund- og klovesyge er det 1-84% 59. Men selv når begge teknikker udføres af kompetente ultrasonographers med eksterne faktorer velkontrollerede, er der stadig en høj CofV 58,60,61. En af grundene til dette kan være, at analyse af vaskulære grænser udføres ved anvendelse af manuelle metoder 60,61. En sådan analyse kan reducere pålidelighed som billedbehandling artefakter såsom falske grænser, støj fra ultrasound signal, og forvridning af fartøjer kan påvirke fortolkningen af billedet 22.
Den seneste udvikling i kontinuerlig automatiseret kant-afsløring software har forbedret påvisning af karvæggen grænser 21,22. I den foreliggende undersøgelse blev via software anvendes til at måle pulsåren diameter, mens AMS blev anvendt til at detektere CIMT. Brugen af disse software reducerer operatør afhængighed, men i tilfældet med AMS, en vis grad af operatørens kontrol er stadig tilgængelig i situationer, hvor billedkvaliteten kan være dårlig 62. Laboratorier, der anvender automatiserede kant afsløring software generelt en tendens til at have lav CofV 58,63,64, derfor bør det være målet for alle vaskulære forskningslaboratorier at indarbejde automatiseret måling af vaskulære grænser for at sikre nøjagtigheden af resultaterne. Det er også god praksis at rapportere resultater af reproducerbarhed undersøgelser af specifikke protokoller, når der udgives undersøgelse resultater.
<p class = "jove_content"> Selvom vurderinger af vaskulær funktion rutinemæssigt anvendes i klinisk forskning, en begrænsning af de teknikker er, at normative værdier for LDI med iontoforese og FMD ikke eksisterer. Det er derfor vigtigt, at sund alders- og køn-matchede kontrolgrupper undersøges for at sammenligne resultaterne med den eksperimentelle gruppe. Selvom disse teknikker forbinder med dårlig prognose i en række populationer med tegn på CVD 6-9, er der stadig en mangel på undersøgelser, som har undersøgt forholdet mellem dårlig endotelfunktion og negative kardiovaskulære resultater, såsom myokardieinfarkt og slagtilfælde. Yderligere prospektive undersøgelser er nødvendige for at løse disse problemer. En anden begrænsning er brugen af menneskelige operatører til at udføre de vurderinger og udføre analysen. Dette introducerer en potentiel kilde til skævhed; dog kan dette begrænses ved blændende operatøren til resultaterne eller sikre, at læseren er forskellig fra operatøren. Deter også vigtigt at sikre, at læseren følger en standardiseret protokol for dataanalyse, således at alle data analyseres konsekvent.Sammenfattende nuværende manuskript indeholder detaljerede oplysninger om de metodiske trin, der er nødvendige for en vellykket udføre vurderinger af mikrokardannelse og store fartøj endotelfunktion samt vaskulær morfologi af den perifere cirkulation. Når det bruges sammen, vurderingerne giver global information om de forskellige stadier af åreforkalkning. Yderligere prospektive studier undersøger den potentielle diagnostiske rolle af disse teknikker er berettiget.
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to thank Dr George Balanos for his assistance in the flow-mediated dilatation technique.
Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Laser Doppler Imager | Moor Instruments, Devon, UK | moorLDI2 | |
Iontophoresis Controller | Moor Instruments, Devon, UK | MIC2 | |
Miochol-E 20mg | Novartis UK | Prescribed by physician | Acetylcholine for endothelium-dependent function |
Nitroprussiat Fides 50mg | Rottapharm Spain | Prescribed by physician | Sodium nitroprusside for endothelium-independent function |
Doppler Ultrasound | Siemens PLC, Camberley UK | Accuson Antares | |
Glyceryl Trinitrate 500 mcg | Alpharma, Barnstaple, UK | Prescribed by physician |