Summary

एक<em> इन विट्रो</em> एंजाइमी परख गैलियम (तृतीय) और एच द्वारा ट्रांसक्रिप्शन निषेध उपाय<sub> 3</sub> 5,10,15-Tris (pentafluorophenyl) corroles

Published: March 18, 2015
doi:

Summary

गैलियम (तृतीय) 5,10,15- (Tris) pentafluorophenylcorrole और उसके Freebase अनुरूप कम micromolar सेल cytotoxicity दिखा रहे हैं। इस पांडुलिपि corroles द्वारा प्रतिलेखन निषेध का आकलन करने के क्रम में, यूवी विज़ स्पेक्ट्रोस्कोपी के साथ एक आरएनए प्रतिलेखन प्रतिक्रिया, एक ethidium ब्रोमाइड दाग जेल के साथ इमेजिंग शाही सेना, और बढ़ाता शाही सेना का वर्णन करता है और कैंसर विरोधी उम्मीदवार गुणों का मूल्यांकन करने के लिए एक सरल तरीका दर्शाता है।

Abstract

कीमोथेरेपी अक्सर कई दुष्प्रभाव और सीमित लक्ष्य-निर्धारण के साथ व्यापक स्पेक्ट्रम साइटोटोक्सिक एजेंट शामिल है। Corroles chelated धातु और कार्य समूहों की पहचान के आधार पर विशेष सेल लाइनों में अंतर cytostatic और साइटोटोक्सिक गुण, कि प्रदर्शन tetrapyrrolic macrocycles के एक वर्ग के हैं। विशेष सेल लाइनों के प्रति क्रियाशील corroles की अद्वितीय व्यवहार लक्षित कीमोथेरेपी की संभावना का परिचय।

कई विरोधी दवाओं आरएनए प्रतिलेखन को बाधित करने के लिए अपनी क्षमता से मूल्यांकन कर रहे हैं। यहाँ हम जानते हैं और संभावित अवरोधकों की मौजूदगी में आरएनए प्रतिलेखन के लिए एक कदम दर कदम प्रोटोकॉल उपस्थित थे। जेल वैद्युतकणसंचलन और यूवी विज़ स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा प्रतिलेखन प्रतिक्रिया की शाही सेना के उत्पादों के मूल्यांकन कार्रवाई के अपने तंत्र के बारे में अधिक परख करने के लिए संशोधन के साथ, संभावित कैंसर विरोधी दवा उम्मीदवारों की inhibitive संपत्तियों के बारे में जानकारी प्रदान करता है और।

थोड़ाcorrole cytotoxicity की कार्रवाई की आणविक तंत्र के बारे में जाना जाता है। गैलियम (तृतीय) 5,10,15- (Tris) pentafluorophenylcorrole (गा (tpfc)) और Freebase एनालॉग 5,10,15- (Tris) pentafluorophenylcorrole (tpfc): इस प्रयोग में, हम दो corrole यौगिकों पर विचार करें। एक शाही सेना प्रतिलेखन परख corroles की inhibitive संपत्तियों की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। पांच प्रतिलेखन प्रतिक्रियाओं तैयार थे: क्रमश: 0.01, की [टेम्पलेट डीएनए आधार] अनुपात, और एक अनुपचारित नियंत्रण: एक [जटिल] पर Actinomycin डी, triptolide, गा (tpfc), tpfc के साथ इलाज डीएनए।

प्रतिलेखन प्रतिक्रियाओं agarose जेल वैद्युतकणसंचलन और यूवी विज़ स्पेक्ट्रोस्कोपी का उपयोग कर चार घंटे के बाद विश्लेषण किया गया। गा (tpfc), Actinomycin डी, और triptolide द्वारा स्पष्ट निषेध नहीं है।

यह आरएनए प्रतिलेखन परख, या comple के साथ डीएनए या पोलीमर्स incubating द्वारा कैंसर विरोधी जटिल, डीएनए, या पोलीमर्स एंजाइम की सांद्रता अलग से अधिक यंत्रवत विस्तार प्रदान करने के लिए संशोधित किया जा सकता हैपूर्व शाही सेना प्रतिलेखन के लिए XES; इन संशोधनों के डीएनए या एंजाइम शामिल निषेध तंत्र के बीच अंतर होता है। आरएनए प्रतिलेखन परिसरों नीचा परीक्षण है कि क्या या आरएनए hydrolyze के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है के बाद परिसर में जोड़ना। यह परख भी अतिरिक्त कैंसर विरोधी उम्मीदवारों का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

Introduction

कीमोथेरेपी अक्सर अवांछित दुष्प्रभाव और सीमित लक्ष्य-निर्धारण के साथ व्यापक स्पेक्ट्रम साइटोटोक्सिक एजेंट शामिल है, अभी तक कैंसर जीव विज्ञान का अधिक से अधिक समझ के साथ, उच्च कैंसर को लक्षित प्रभावकारिता और कम साइड इफेक्ट के साथ कैंसर विरोधी एजेंट के लिए एक बढ़ती मांग है। एक मानव कैंसर की कोशिकाओं को अक्सर बन अस्तित्व के लिए एक भी सक्रिय या overexpressed ओंकोजीन पर निर्भर है। इस प्रकार दो, कई विरोधी दवाओं आरएनए प्रतिलेखन को बाधित करने के लिए अपनी क्षमता से मूल्यांकन कर रहे हैं। इन बदलने जीनों की अभिव्यक्ति है कि ब्लॉक उपचार कैंसर की कोशिकाओं को नष्ट करने में प्रभावी रहे हैं और कोशिका मृत्यु पैदा होती हैं। सामान्य कोशिकाओं संगत कर रहे हैं की तुलना में तीन बदल कोशिकाओं आरएनए प्रतिलेखन में अवरोधों को और अधिक संवेदनशील होते हैं। चुनिंदा बाधित करने के लिए उम्मीद कर रहे हैं प्रतिलेखन रोकना है कि चार विरोधी दवाओं कैंसर कोशिका को जीवित रखने के लिए जरूरी हैं, जो ओंकोजीन की अभिव्यक्ति। 5 नतीजतन, आरएनए प्रतिलेखन मैंnhibition संभावित कैंसर विरोधी दवा उम्मीदवारों की पहचान करने और कार्रवाई के अपने तंत्र के बारे में अधिक जानने के लिए एक उपयोगी तरीका है। इस प्रोटोकॉल गा (tpfc) कीमोथेरेपी दवाओं Actinomycin डी और triptolide रूप में एक ही आदेश पर आरएनए प्रतिलेखन रोकता यह दर्शाता है कि; इसी तरह की तुलना अन्य औषध के विरोधी उम्मीदवारों के साथ इस प्रोटोकॉल का उपयोग किया जा सकता है। Actinomycin डी सामान्यतः गर्भावधि trophoblastic कैंसर, वृषण कैंसर, Wilm के ट्यूमर, rhabdomyosacoma इलाज के लिए इस्तेमाल एक आरएनए प्रतिलेखन अवरोध करनेवाला है, और इविंग सारकोमा 6। यह पहली बार 1964.Triptolide में एफडीए द्वारा इन विट्रो में और 30 साल के लिए विभिन्न ट्यूमर असर पशु मॉडल में जांच की गई है कि एक चयनात्मक प्रतिलेखन अवरोध करनेवाला है अनुमोदित किया गया था के बाद से Actinomycin डी लगभग पचास वर्षों के लिए कैंसर के उपचार में इस्तेमाल किया गया है। 7

corroles की amphiphilic macrocyclic प्रकृति इस तरह के छोटे अणुओं या जीवविज्ञान के रूप में अन्य दवा वर्गों से अधिक महत्वपूर्ण लाभ प्रदान करता हैएस। 8-14 macrocyclic चरित्र इस तरह के बड़े अणुओं के लिए उम्मीद की तुलना में अधिक है कि सेलुलर पारगम्यता के लिए अनुमति देता है, और वे इस तरह के प्रोटीन के रूप में उन macromolecular सतहों के साथ बातचीत करने के लिए काफी बड़े हैं। 8 Corroles biomolecules के साथ तंग noncovalent परिसरों के लिए फार्म में जाना जाता है और दवाओं। corrole ढांचे के निहित cytotoxicity के अलावा 10, हम दिखा दिया एजेंटों के लिए एक वाहक अणु, विशेष रूप से डीएनए intercalating anthracycline दवा डॉक्सोरूबिसिन के रूप में एक sulfonated corrole कार्य करता है। Sulfonated corrole डॉक्सोरूबिसिन साथ coadministered गया था, डॉक्सोरूबिसिन के आईसी 50 में एक तीन गुना वृद्धि ड्यू-145 कोशिकाओं के लिए मनाया गया। 9 corrole ढांचा स्थिर है और क्रियाशील करते हैं, अद्वितीय absorbance के पारियों से गुजरना है कि निहित absorbance के और प्रतिदीप्ति गुण है कि लक्षण वर्णन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। पाड़ के 10 functionalization स्वाभाविक affec नहीं करताचुनिंदा काफी हद तक अपनी जैविक गुणों को बदल सकते हैं corrole के ढांचे को संशोधित करने, एक sulfonated corrole साथ देखा के रूप में, corrole, 9-15 की photophysical गुण टी लेकिन। 16 हम पहले सात मानव कैंसर कोशिका लाइनों के खिलाफ छह metallocorroles मूल्यांकन किया है। परिणाम मानव कैंसर की कोशिकाओं की ओर विषाक्तता विशिष्ट धातु आयन, साथ ही कार्यात्मक समूह प्रतिस्थापन पर निर्भर है कि संकेत मिलता है। उदाहरण के लिए, sulfonated गैलियम corroles उच्च सेलुलर तेज अनुभवी और मस्तिष्क मेटास्टेटिक प्रोस्टेट कैंसर की कोशिकाओं (ड्यू-145) के नाभिक में चुनिंदा प्रवेश कर; के लिए की तुलना में यह अन्य सेल लाइनों के नाभिक में घुसना नहीं करता है, हालांकि एक ही corrole, स्तन के लिए अधिक से अधिक cytotoxicity दर्शाती (एमडीए MB-231), मेलेनोमा (एस-एमईएल-28), और डिम्बग्रंथि (OVCAR-3) कैंसर कोशिकाओं प्रोस्टेट कैंसर। 9

प्रारंभिक सेल आधारित assays इन यौगिकों विरोधी कैंसर चिकित्सकीय एजेंटों, Furth जो योग्यता के आधार के रूप में वादा है कि शो का संकेतकार्रवाई के तंत्र में ईआर जांच। ट्रांसक्रिप्शन निषेध कुछ organometallic परिसरों 17-27 के साथ मनाया जाता है और हम corrole परिवार की साइटोटोक्सिक व्यवहार के लिए एक संभव तंत्र के रूप में इस प्रक्रिया की जांच करने की मांग की है। यह प्रतिलेखन परख जीवित कोशिकाओं में इन अणुओं के प्रभाव के बारे में अधिक विस्तृत जानकारी के लिए नेतृत्व करेंगे जो प्रतिलेखन निषेध, आकलन करने के लिए एक, सरल, सस्ती और सुगम तरीका प्रदान करता है।

इधर, गैलियम का प्रतिलेखन निषेध (तृतीय) 5,10,15- (Tris) pentafluorophenylcorrole (गा (tpfc)) और उसके Freebase एनालॉग 5,10,15- (Tris) pentafluorophenylcorrole (tpfc) (चित्रा 1) का परीक्षण कर रहे हैं। कुछ संक्रमण धातु परिसरों के विपरीत, गैलियम (तृतीय) रेडॉक्स निष्क्रिय है और इसलिए सीधे रेडॉक्स आधारित चयापचय मार्ग की रेडॉक्स प्रक्रिया में शामिल नहीं है। 28 भले ही, गैलियम (तृतीय) साइटोटोक्सिक गुणों को प्रदर्शित करता है और चिकित्सीय उद्देश्यों के लिए जांच की गई है। गैलियम प्लैटिनम के बाद कैंसर विरोधी चिकित्सा विज्ञान के लिए दूसरा सबसे होनहार धातु है और कई अध्ययन और जांच आया है; नाइट्रेट और क्लोराइड गैलियम लवण hepatoma, लिंफोमा, मूत्राशय के कैंसर, और अन्य बीमारियों के खिलाफ क्लिनिकल परीक्षण में मूल्यांकन किया गया है। 29-34 गैलियम (तृतीय) कैंसर विरोधी corrole अध्ययन के लिए इसलिए आदर्श है। प्रारंभिक डेटा (चित्रा 2 देखें) गा (tpfc) और tpfc विभिन्न कैंसर कोशिका लाइनों के साथ कम सैनिक 50, अधिक से अधिक सेल प्रसार के 50% को बाधित करने के लिए आवश्यक दवा एकाग्रता, दिखाने; यह उनकी inhibitive गुण निर्धारित करने के लिए इन दो यौगिकों पर आगे के प्रयोगों की वैधता की पुष्टि की। हम आम विरोधी दवाओं Actinomycin डी और triptolide के साथ इन यौगिकों की तुलना करें। Actinomycin डी intercalates डीएनए, आरएनए बढ़ाव को रोकता है, और picomolar सांद्रता में कुछ सेल लाइन में apoptosis लाती 6,35-37 Triptolide ट्यूमर के विकास को बाधित करने के लिए दिखाया गया है। यह मानव XPB / ERCC3, एक सबयूनिट ओ को बांधताएफ प्रतिलेखन कारक TFIIH, शाही सेना पोलीमरेज़ द्वितीय गतिविधि के निषेध के लिए अग्रणी। 6-7,38-40

यह आमतौर पर corroles साइटोटोक्सिक गुण है कि प्रदर्शन के नाम से जाना जाता है, functionalization से उत्पन्न होने वाली विभिन्न तंत्र के बारे में कम जानकारी मौजूद है। आरएनए प्रतिलेखन के Corrole निषेध Biomacromolecules के साथ उनकी बातचीत पर अधिक से अधिक जानकारी की पेशकश करेगा। ऐसे dirhodium के रूप में डीएनए के लिए बाध्य करने के लिए जाना जाता है अन्य परिसरों, (द्वितीय, द्वितीय) परिसरों, क्रोमियम (तृतीय) परिसरों, दयाता (द्वितीय) polypyridyl परिसरों, रोडियाम (तृतीय) परिसरों, और विभिन्न अन्य लोगों के, 18, ​​आरएनए प्रतिलेखन assays के लिए किए गए 27 Biomacromolecules के साथ उनकी बातचीत का अधिक से अधिक समझ में जिसके परिणामस्वरूप। यह सतही और व्यापक रूप से उपलब्ध प्रयोग भी एक दिया अणु की cytotoxicity संपत्तियों का आकलन और चाहे यह गुण आगे जैविक परीक्षण निर्धारित करने के लिए एक अच्छा प्रारंभिक परीक्षा है। आरएनए प्रतिलेखन परख भी ऐसे varyin के रूप में कई संशोधनों के लिए अनुमति देता हैछ इस्तेमाल किया यौगिक या एंजाइमों की मात्रा; ऊष्मायन अवधि, प्रतिक्रिया समय और नमूना समय बिंदुओं बदलती; और इस प्रकार संभावित डेटा की एक बड़ी राशि उपलब्ध कराने, हित के अन्य चर के बीच डीएनए टेम्पलेट लंबाई और अनुक्रम, बदलती। घटकों खरीदा है और व्यक्तिगत रूप से तैयार किया जा सकता है, हालांकि यह प्रतिलेखन परख, भी प्रदान की सभी आवश्यक प्रतिक्रिया घटकों के साथ सस्ती किट के रूप में आसानी से उपलब्ध है। इन प्रयोगों में, हम उच्च उपज के लिए जाना जाता है एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट का उपयोग करें। 41

Agarose जेल वैद्युतकणसंचलन और यूवी विज़ स्पेक्ट्रोस्कोपी: प्रतिलेखन निषेध का आकलन करने के लिए, हम दो तरीकों का उपयोग करें। Agarose जेल वैद्युतकणसंचलन, अलग होने की पहचान है, और सफ़ाई 0.5- 25 केबी डीएनए और आरएनए के टुकड़े करने के लिए एक सरल और प्रभावी तरीका है। 42 यूवी विज़ स्पेक्ट्रोस्कोपी एकाग्रता और आरएनए की शुद्धता निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। 43

Protocol

नोट: शाही सेना के साथ काम करना डीएनए और आरएनए नीचा कि DNase और RNase एंजाइमों द्वारा संक्रमण से बचने के लिए एक साफ काम के माहौल को बनाए रखने। कि पिपेट सुझाव और ट्यूबों DNase और RNase मुक्त कर रहे हैं सुनिश्चित करें। यह …

Representative Results

Agarose जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा मूल्यांकन आरएनए प्रतिलेखन गुणात्मक Agarose जेल वैद्युतकणसंचलन छवि को लिखित आरएनए प्रयोग किया जाता है। Ethidium ब्रोमाइड शाही सेना के 46 इजाजत दी इमेजिंग (λ ?…

Discussion

यह परख गा (tpfc) के अलावा के नाम से जाना जाता डीएनए बाध्यकारी विरोधी परिसरों Actinomycin डी और triptolide को तुलनात्मक रूप आरएनए प्रतिलेखन रोकता यह दर्शाता है कि। गा (tpfc) (सैनिक 50 = 58.1-154.7 माइक्रोन) की साइटोटोक्सिक व्यवहा?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

हम ईमानदारी से जेल वैद्युतकणसंचलन के साथ मदद के लिए डॉ सिंडी एन चिऊ धन्यवाद, और डीएनए और प्रतिबंध एंजाइम के अपने उदार दान के लिए एंडी झोउ और माइकल Grodick। हम कृतज्ञता उपकरण और सामग्री को उदार पहुँच के लिए प्रोफेसर जे हीथ और प्रोफेसर डी Prober स्वीकार करते हैं। हम उपयोगी सुझाव के लिए डॉ कर्ण Sorasaenee धन्यवाद। हम वीडियो में योजनाबद्ध सिंहावलोकन में इस्तेमाल चित्रण बनाने के लिए मैरी एच तांग धन्यवाद। अनुदान जॉनसन एंड जॉनसन और यूएससी Y86786 द्वारा प्रदान की गई थी।

Materials

Name of Material/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
Actinomycin D Sigma-Aldrich A1410 Store at 2-8 °C , protect from light
Triptolide Sigma-Aldrich T3652 Store at 2-8 °C , protect from light
nuclease-free H2 Life Technologies AM9938
MEGAscript T7 Transcription Kit Life Technologies AM1334 Store at –20 °C 
Ethidium Bromide Sigma-Aldrich E7637 CAUTION: For proper handling procedures of ethidium bromide, please see: http://www.sciencelab.com/msds.php?msdsId=9927667
Tris Acetate Sigma-Aldrich T6025
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich EDS
UltraPure Agarose Life Technologies 16500-100
mini Quick Spin RNA Columns Roche Life Science 11814427001 Store at 2-8 °C , do not freeze
1 kb DNA Ladder New England Biolabs N3232S Store at –20 °C 

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Tang, G. Y., Pribisko, M. A., Henning, R. K., Lim, P., Termini, J., Gray, H. B., Grubbs, R. H. An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by Gallium(III) and H3 5,10,15-tris(pentafluorophenyl)corroles. J. Vis. Exp. (97), e52355, doi:10.3791/52355 (2015).

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