Here, we present a protocol to coculture primary cells, tissue models and punch biopsies in a microfluidic multi-organ chip for up to 28 days. Human dermal microvascular endothelial cells, liver aggregates and skin biopsies were successfully combined in a common media circulation.
The ever growing amount of new substances released onto the market and the limited predictability of current in vitro test systems has led to a high need for new solutions for substance testing. Many drugs that have been removed from the market due to drug-induced liver injury released their toxic potential only after several doses of chronic testing in humans. However, a controlled microenvironment is pivotal for long-term multiple dosing experiments, as even minor alterations in extracellular conditions may greatly influence the cell physiology. We focused within our research program on the generation of a microengineered bioreactor, which can be dynamically perfused by an on-chip pump and combines at least two culture spaces for multi-organ applications. This circulatory system mimics the in vivo conditions of primary cell cultures better and assures a steadier, more quantifiable extracellular relay of signals to the cells.
For demonstration purposes, human liver equivalents, generated by aggregating differentiated HepaRG cells with human hepatic stellate cells in hanging drop plates, were cocultured with human skin punch biopsies for up to 28 days inside the microbioreactor. The use of cell culture inserts enables the skin to be cultured at an air-liquid interface, allowing topical substance exposure. The microbioreactor system is capable of supporting these cocultures at near physiologic fluid flow and volume-to-liquid ratios, ensuring stable and organotypic culture conditions. The possibility of long-term cultures enables the repeated exposure to substances. Furthermore, a vascularization of the microfluidic channel circuit using human dermal microvascular endothelial cells yields a physiologically more relevant vascular model.
أحادي الطبقة أو تعليق الحالية فحوصات زراعة الخلايا لتطوير الأدوية تفشل في محاكاة المكروية الخلوية الإنسان، وبالتالي يؤدي إلى فقد التمايز السريع وفقدان وظائف في مزارع الخلايا البشرية الأولية. وهناك حاجة إلى نماذج الأنسجة مع ارتفاع أهمية الفسيولوجية للتنبؤ فعالية وسلامة المركبات قبل قبولهم في التجارب السريرية. في الآونة الأخيرة، ومعيار في تقنيات زراعة الخلايا في المختبر تطورت من الثقافات أحادي الطبقة ثنائية الأبعاد إلى نماذج متعددة الخلايا ثلاثية الأبعاد، وتهدف لمحاكاة في الجسم الحي الأنسجة المكروية. هذه النظم قد أظهرت بالفعل تحسينات رئيسية نحو التنبؤ أكثر دقة من طريقة عمل مركبات 1،2. وعلاوة على ذلك، والتكيف في المختبر ظروف التربية لاحتياجات متخصصة للغاية من خلايا غير ذات أهمية خاصة.
تحت مستوى في ظروف المختبر، ومجموعة متنوعة من طريق مسدود المهمالمعلمات تلح، مثل المغذيات والأكسجين العرض، وإزالة تراكم المنتجات، وقوة ميكانيكية تعمل على خلايا في كثير من الأحيان لا يمكن التحكم بدقة في معظم الحالات. تمتلك العديد من الأجهزة التدرجات تركيز ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية للمواد والأكسجين الذائب. ومع ذلك، هذه الشروط درجة عالية من التنظيم والأمثل هي في تناقض واضح مع التدرجات نشر لا يمكن السيطرة عليها في جميع أنحاء الأنسجة تحت ظروف في المختبر، مما يؤدي إلى بيئة غير مستقرة للغاية والحد من تطوير الخلوية 3. وهكذا، مطلوبة أكثر ثباتا وأكثر قابلة للقياس الكمي وخاصة في ظروف المختبر للحفاظ على الخلايا قابلة للحياة ومتباينة على مدى فترات طويلة من الزمن. أنظمة perfused ل، حيث يتم إزالة بانتظام المكونات المتوسطة واستبدال، وغالبا ما تكون أفضل السمات التي تميزت والسيطرة عليها من ثقافات ثابتة بشأن المحيطة مباشرة من الأنسجة. في ظل ظروف ثابتة، التدرجات نشر إفرازات الخلايا والعناصر الغذائية مستنبتقد تحيط الخلايا المستزرعة 3. إدخال جيدا اتسم معدلات تدفق المتوسطة في جميع أنحاء الأنسجة تسمح للإفرازات الخلية إلى المزيج مع المتوسط الغني من خلال نضح. وهذا يتيح توليد microenvironments الخلوية المحددة، وضمان النمط الظاهري الخلوية مستقر ويتفاعل التعبير انزيم طوال فترة الفحص كلها 4.
المستندة إلى التطورات الأخيرة في الأعضاء المتعددة رقاقة (وزارة التجارة) نظم تجمع بين فوائد تدفق المتوسط تسيطر حول هندسة الأنسجة مع متطلبات المتوسطة وكتلة الخلايا صغيرة من المفاعلات الحيوية الميكروسكيل، مما يؤدي إلى نقص كمية مادة اللازمة أثناء الاختبار. وقد وصفت العديد من أنظمة ميكروفلويديك لزراعة الأنسجة حتى الآن 5،6. الأنسجة إلى السائل النسب داخل هذه الأنظمة تلعب دورا حاسما وخصوصا في محاكاة الحديث المتبادل الخلوي ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية. ومع ذلك، بسبب القيود التقنية، مثل استخدام المضخات الخارجية والخزانات وسائل الاعلام، الالبريد المنتشرة عموما حجم وسائل الإعلام في معظم النظم كبير جدا بالمقارنة مع حجم الأنسجة. وكانت مجموعة من شولر وآخرون أول من وضع نظام يكفل الأوقات الإقامة المناسبة للمواد داخل مقصورات زراعة الخلايا في الجسم الحي والنسب ذات الصلة 7،8 الأنسجة إلى السائل. وقد تحقق ذلك عن طريق التوسع الخزان الخارجي وصولا الى لوحة 96-جيدا، وتمثل أيضا "الأنسجة الأخرى" المقصورة. من أجل تقليل حجم وسائل الإعلام المنتشرة ضمن منصة وزارة التجارة لدينا، نحن متكاملة لتحوي micropump على الرقاقة، مما يلغي الحاجة للدوائر وسائل الإعلام الخارجية. هذا micropump قادر على تشغيل النظام في اختيار عدد من سرعات تدفق وسائل الاعلام ومعدلات إجهاد القص 9. نظام قناة ميكروفلويديك من 500 عرض ميكرون و 100 ميكرون ارتفاع سيربط اثنين موحدة مساحات زراعة الأنسجة، ولكل منها حجم بئر واحد من لوحة 96-جيدا. التمسك أحجام معيار الصناعة لوحة جيداالصورة يسمح دمج نماذج الأنسجة الموجودة بالفعل إنتاجها في شكل transwell. وعلاوة على ذلك، الوضع الرأسي للtranswell إدراج ثقافة الخلية هو قابل للتعديل، مما يتيح زراعة نماذج الأنسجة التي لم يتم كشفها مباشرة فقط لتدفق السوائل، ولكن يمكن أيضا أن رفعت ومحمية من التيار الأساسي. وبالمثل، الثقافات واجهة الهواء السائل قابلة للتنفيذ باستخدام هذا النظام.
ملفقة منصة وزارة التجارة من ثنائي ميثيل بولي سيلوكسان (PDMS) طبقة 2 مم عالية والمجهر شريحة زجاجية مع بصمة من 75 × 25 مم 2، والتي المستعبدين بشكل دائم عن طريق انخفاض ضغط الأكسدة البلازما لتشكيل دائرة السائل ضيق ميكروفلويديك. ويتم إنتاج طبقة PDMS تحتوي على قنوات كل منها والمقصورات ثقافة الخلية عن طريق الطباعة الحجرية الناعمة القياسية وصب متماثلة 9. تصميم ميكروفلويديك من وزارة التجارة التي استخدمت خلال هذه الدراسة يتكون من اثنين من الدوائر ميكروفلويديك منفصلة لكل شريحة، كل تحتجز اثنين من خلية جمقصورات ulture مترابطة من خلال نظام القناة 100 ميكرون عالية. هذا ما سمح للأداء الفردي اثنين cocultures الأنسجة اثنين باستخدام رقاقة واحدة الأعضاء المتعددة. تم تعديل ترددات ضخ أن تسفر معدلات تدفق المتوسطة من 40 ميكرولتر / دقيقة.
هذا التصميم MOC الأنسجة اثنين توفير القدرة على coculture كروي الكبد وخزعة الجلد لكمة في الأماكن ثقافة منفصلة، وإن كان ذلك في دائرة الإعلام جنبا إلى جنب في ظل ظروف تدفق الفسيولوجية. تم تجميع خلايا متباينة HepaRG جنبا إلى جنب مع الخلايا البشرية الكبدية النجمية (HHSteC) بنسبة 24: 1 لتشكيل الأجسام الشبه الكروية متجانسة. تم العثور على هذه النسبة لتكون الأمثل، كما لوحظ في التجارب السابقة 10، على الرغم من، ما يقرب من ضعف عدد خلايا الكبد واستخدمت مقارنة مع الوضع في الجسم الحي. كان يزرع الجلد في واجهة الهواء السائل داخل ثقافة إدراج خلية transwell، وبالتالي تمكين التعرض مادة موضعي. تم cocultivated هذه النماذج الأنسجة لمدة 28 دآيس في وزارة التجارة للتدليل على شمولية هذا النظام. وعلاوة على ذلك، على حلبة قناة ميكروفلويديك من رقائق كانت مغطاة تماما مع الخلايا البطانية الاوعية الدموية الدقيقة الجلدية الإنسان (HDMEC) لمحاكاة أكثر عن كثب الأوعية الدموية.
منصة وزارة التجارة وصفها هنا تمثل أداة مستقرة وقوية لزراعة الأنسجة من أصول مختلفة في ظروف تدفق المتوسطة ديناميكية على مدى فترات الثقافة لفترات طويلة 10،16. في هذا المثال، تم استخدام منصة لزراعة الخلايا الأولية (HDMEC)، المعادل الأنسجة الناتجة عن خط الخلية (المجاميع الكبد)، وcoculture ما سبق مع خزعة الأنسجة. كانت قادرة على الحفاظ على coculture ثلاثة الأنسجة لمدة تصل إلى 28 يوما في دائرة المتوسطة مجتمعة وزارة التجارة. لأفضل لمعرفة المؤلفين، هذه هي المرة الأولى التي يتم فيها تنفيذ عملية coculture متعددة الأنسجة، بما في ذلك الخزعات، الخلايا الأولية وخطوط الخلايا أكثر من أربعة أسابيع.
واحدة من العوائق الرئيسية لنظم ميكروفلويديك هو تقارب من جزيئات صغيرة على التمسك المواد السطحية من الدائرة الموائعية. كما السطح إلى نسبة حجم مرتفع خاصة في النظم ميكروفلويديك، يصبح هذا التأثير أكثر وضوحا 17 </sتصل>. التغطية HDMEC مستقرة من القنوات، قدم هنا، قد يكون بمثابة حاجز البيولوجي منع التصاق جزيئات إلى وزارة التجارة. وعلاوة على ذلك، فإنه قد يكون بمثابة سفينة hemocompatible للدورة الدموية كله، ومنع تجلط الدم. ومع ذلك، فإن استخدام الدم الكامل كبديل المتوسط ليس ممكنا كما لم يتم التوصل إلى الأوعية الدموية الكامل للمكافئات الجهاز بعد. العمل على الأوعية الدموية للأنسجة -generated في المختبر القائم واعدة ويوجه الطريق لمزيد من الدراسات 18،19.
ومن المعروف أن خلايا الكبد تميل الى فقدان وظائف الكبد محددة على مر الزمن تحت ساكنة ثنائية الأبعاد في المختبر ظروف التربية 20. تأييض الإنزيمات، مثل P450 السيتوكروم، هي من أهمية خاصة إذا كان التمثيل الغذائي للدواء معين ليتم دراستها. السيتوكروم P450 3A4، انزيم المتعلقة أحيائي من xenobiotics كثيرة، والسيتوكروم P450 7A، ثويشارك hich في تركيب الحامض المراري، وأعرب عن في الكبد مجاميع المثقف في وزارة التجارة أكثر من 14 يوما. وهذا يدل على الحفاظ على النمط الظاهري نشط عملية الأيض، مما يسمح للدراسات التمثيل الغذائي المخدرات. زيادة الزلال معدل إنتاج الركام في وزارة التجارة مقارنة الثقافات ثابتة هو مؤشر إضافي لشروط الثقافة الكافية. وكانت معدلات إنتاج الألبومين التي لوحظت خلال هذه الدراسة للمقارنة أو حتى أعلى من القيم ذكرت سابقا التي حصلت عليها رقائق ميكروفلويديك بما في ذلك الخلايا HepG2 21-23، ومع ذلك، القيم لم تصل تلك الثقافات الأولية الكبدية الإنسان 24. وعلاوة على ذلك، فإن نظام وزارة التجارة، في تخطيطه مؤقت، لا يسمح لفصل منفصل الصفراء. خلايا في الصفراء الهياكل الشبيهة نفيق الاستقطاب وشكلت الإجمالية، كما يتضح من MRP-2 تلطيخ. ومع ذلك، لم تكن مرتبطة تلك نفيق إلى قناة الفنية جمع الصفراء. هذا المزيج غير الفسيولوجيةجي من الصفراوية مع مقصورة الدم لابد من معالجتها في إعادة تصميم المستقبلي للنظام.
تعديل خصائص التدفقات غير ذات أهمية عالية 25، وخاصة فيما يتعلق الأنسجة الحساسة للإجهاد القص، مثل الكبد. كمية من إجهاد القص ينظر إليها من قبل الأنسجة يمكن تعديل بطريقتين: أولا، ضغط الهواء تستخدم لدفع أسفل الأغشية المضخة يمكن تخفيضها، وخفض قيم إجهاد القص الذروة في النظام. ثانيا، الأنسجة يمكن أن تكون جزءا لا يتجزأ في مصفوفة طبقات الخلية أو مثقف في إدراج الثقافة transwell. هذا الأخير حماية الأنسجة من الكامنة الحالية مع غشاء مسامي. وتحتاج هذه التعديلات التي يتعين القيام بها على أساس فردي لكل ما يعادل الجهاز قبل بدء التجربة وزارة التجارة. في عملية نابض من 2.4 هرتز، على سبيل المثال، والتي تتطابق مع، نشاط القلب عالية، ولكن لا يزال الفسيولوجية من 144 نبضة / دقيقة في البشر، وإجهاد القص قياس فيقنوات الدائرة الاوعية الدموية الدقيقة تصل حوالي 25 داين / سم 2. هذا يتوافق مع إجهاد القص الفسيولوجية في نهاية أعلى من النطاق في الأوعية الدموية الدقيقة وغير، وبالتالي، تنطبق جيدا للتجارب بما في ذلك تبطنن من القنوات. لكن، وكما تخطيط ميكروفلويديك الحالي للنظام وزارة التجارة قدمت يتكون من واحد فقط الدائرة الإعلامية ربط اثنين من المقصورات الجهاز، والتي سيتم اختيارها واحدة سرعة الضخ والقص معدل الإجهاد للنظام بأكمله. ولذلك، تعديلا الدقيق لخصائص التدفقات لاحتياجات كل جهاز واحد ليس ممكنا دائما.
وعلاوة على ذلك، لابد من توخي الحذر في ضبط الخلايا إلى متوسطة المشترك. تزرع الخلايا في وزارة التجارة في دائرة الإعلام مجتمعة، وبالتالي، لا الفردية وسائل الإعلام ثقافة الخلية يمكن أن تستخدم في كل نموذج الأنسجة، كما هو المعيار لفي المختبر ثقافة الخلية. وتحتاج الحد الأدنى من صياغة وسائل الإعلام مجتمعة إلى تعريف مسبقا ورتحتاج انه الخلايا ليتم تعديل تدريجي لهذا الإعلام الجديد. إجراء تعديل 80٪ / 20٪ القديم إلى وسائل الإعلام الجديدة لمدة يومين، ثم 50٪ / 50٪ تليها 20٪ / 80٪، والتبادل الكامل أدت دائما إلى بقاء الخلية معقولة وظائف الثقافات في أيدينا.
تخطيط ميكروفلويديك الحالي للنظام وزارة التجارة يسمح للcoculture تصل إلى ثلاثة الأنسجة. وهناك حاجة إلى coculture ما لا يقل عن عشرة أهم أجهزة الجسم البشري للوصول إلى التوازن. ولذلك، فإن نظام عرض قادر على التنبؤ التفاعلات الأنسجة الأنسجة محددة، ولكن ليس استجابة النظامية الحقيقية لمادة. ومن المزمع إجراء مزيد من التطوير وزارة التجارة لتشمل المزيد من تجاويف الجهاز. وعلاوة على ذلك، من صحة هذا النظام هو ليتم عرضها باستخدام مجموعة من المركبات المرجعية. ويفضل، والمركبات التي فشلت خلال التجارب السريرية (مثل Troglitazone) هي لفحصها لأدائها في وزارة التجارة. في حين، والتحقق من صحة الحقيقي لمثل هذه النظم المعقدة لا تزال تعرقل بذ وعدم وجود توحيد المتعلقة المؤشرات الحيوية والنهاية للتقييم وظيفي، وجمع المزيد من البيانات حول أداء السمية لهذا وما شابهه من النظم توسيع موثوقيتها ومجال التطبيق.
The authors have nothing to disclose.
وقد تم تمويل هذا العمل من قبل الوزارة الاتحادية الألمانية للتعليم والبحث العلمي، GO-بيو منحة رقم 0315569.
Name of Material/ Equipment | Company | Comments/Description | |
HepaRG cells | Biopredic International | undifferentiated cells | |
HHSteC | ScienCell Research Laboratories | cells and all culture supplements | |
HepaRG Medium | Sigma-Aldrich | William's Medium E 10% FCS 100 U/ml penicillin 100 µg/ml streptomycin 5 µg/ml human insulin 2 mM L-glutamine 5 x 10-5 M hydrocortisone hemisuccinate | |
HDMEC Medium | PromoCell | Endothelial Cell Growth Medium MV2 with Supplement-Pack MV2 and 1% penicillin-streptomycin | |
Dimethyl sulfoxide | Carl Roth | add 2% to HepaRG media | |
Trypsin/EDTA | Biowest | ||
Trypsininhibitor | Carl Roth | ||
MAXYMum Recovery Tips | Corning | 1000 µl Pipet Tips Wide Bore | |
384-Well Hanging Drop Plate | 3D Biomatrix | Perfecta 3D 384-Well Hanging Drop Plate | |
Tissue culture flasks | Corning | 75 cm2 | |
Ultra-low attachment plate | Corning | 24-well | |
Transwell cell culture inserts | Corning | 96-well unit, 0.4 µm pore size | |
Deep well plates | Corning | 96-well, 1 ml | |
Biopsy punch | Stusche | 4.5 mm | |
Glass microscope slide | Menzel | footprint of 75 x 25mm | |
Polydimethylsiloxane | Dow Corning | Sylgard 184 | |
Silicon rubber additive | Wacker Chemie | Wacker Primer G790 | |
Tubes for air pressure | SMC Pneumatik GmbH | Polyurethan-Schlauch, metrisch | |
Alumin ELISA | Bethyl Laboratories | Human Albumin ELISA Quantitation Set | |
Lactate dehydrogenase assay | Stanbio Laboratory | LDH Liqui-UV kit | |
Alexa Fluor 594 acetylated LDL | Invitrogen | 1 mg/ml |