Here, we present a protocol to coculture primary cells, tissue models and punch biopsies in a microfluidic multi-organ chip for up to 28 days. Human dermal microvascular endothelial cells, liver aggregates and skin biopsies were successfully combined in a common media circulation.
The ever growing amount of new substances released onto the market and the limited predictability of current in vitro test systems has led to a high need for new solutions for substance testing. Many drugs that have been removed from the market due to drug-induced liver injury released their toxic potential only after several doses of chronic testing in humans. However, a controlled microenvironment is pivotal for long-term multiple dosing experiments, as even minor alterations in extracellular conditions may greatly influence the cell physiology. We focused within our research program on the generation of a microengineered bioreactor, which can be dynamically perfused by an on-chip pump and combines at least two culture spaces for multi-organ applications. This circulatory system mimics the in vivo conditions of primary cell cultures better and assures a steadier, more quantifiable extracellular relay of signals to the cells.
For demonstration purposes, human liver equivalents, generated by aggregating differentiated HepaRG cells with human hepatic stellate cells in hanging drop plates, were cocultured with human skin punch biopsies for up to 28 days inside the microbioreactor. The use of cell culture inserts enables the skin to be cultured at an air-liquid interface, allowing topical substance exposure. The microbioreactor system is capable of supporting these cocultures at near physiologic fluid flow and volume-to-liquid ratios, ensuring stable and organotypic culture conditions. The possibility of long-term cultures enables the repeated exposure to substances. Furthermore, a vascularization of the microfluidic channel circuit using human dermal microvascular endothelial cells yields a physiologically more relevant vascular model.
当前单层或悬浮细胞培养测定为药物开发没有能够模仿人类细胞微环境,因此,导致快速去分化和功能的原代人细胞培养物的损失。需要组织模型具有较高生理相关它们接纳于临床试验之前,预测化合物的功效和安全性。最近, 体外细胞培养技术的标准已经从二维单层培养进化朝向三维的多细胞模型,旨在模仿体内组织的微环境。这些系统已经显示出对化合物1,2的作用模式的更准确的预测重大改进。此外,适应在体外培养条件下细胞的高度专业化的需求是特别令人感兴趣的。
在标准的体外条件下,各种重要的尽头TURE参数,如营养和氧气供应,去除累积的产品,和机械力作用在细胞通常不能在大多数情况下,充分进行控制。许多器官具备的物质和溶解氧生理学相关浓度梯度。然而,这些高度调节和优化的条件,在体外条件下,明确反对周围组织中的不可控的扩散梯度,导致一个非常不稳定的环境中,以及限制细胞发展3。因此,更稳定,尤其是在体外条件更加量化的需要,以保持细胞的存活和分化的多长时间。灌注系统,其中培养基成分,定期删除和取代,往往是更好的表征和可控比关于直接周围组织的静态文化。在静态条件下,细胞的分泌物扩散梯度和培养液中的营养成分可能围绕培养细胞3。周围的组织引入良好的特点中型流速使细胞的分泌物混合通过灌注丰富的媒介。这使得能够确定蜂窝微环境的产生,从而确保了稳定的细胞表型,并在整个试验持续时间4代谢酶的表达。
在多器官芯片(MOC)的最新发展为基础的系统,结合了控制介质流动的周围组织工程与生物反应器微观的中小型和细胞质量的要求带来的好处,从而导致物质的测试过程中需要的量减少。几种微流体系统用于组织培养已经描述迄今5,6。这些系统在组织内对流体的比率起到模拟生理学相关细胞串扰一个特别重要的作用。但是,由于技术的限制,例如使用外部泵和介质储层,第相比于组织体积E综合循环介质在大多数系统体积过大。该集团舒勒等人都是第一次来开发,确保在细胞培养室和体内相关组织,以流体比7,8物质的适当停留时间的系统。这是通过按比例缩放所述外部容器下降到96孔板,也代表了“其他组织”隔室来实现的。为了最大限度地减少了操作中心平台中的循环介质体积,我们集成蠕动片上的微型泵,省去了外部介质电路。这个微型泵能够在介质的流速和剪切应力速率9的可选择数操作该系统。 500微米的宽度和100μm的高度的微流控通道系统互连两个标准化组织培养空间,每一个都具有一个96孔板的单个孔的大小。坚持行业标准孔板大小S允许在透孔格式制作已经存在的组织模型的集成。此外,transwell小细胞培养插入物的垂直位置是可调的,从而使组织模型它们不仅直接暴露于流体流的培养,但也可以被提起并从底层当前屏蔽。同样地,空气 – 液体界面的文化为使用本系统时是可行的。
信息操作中心平台由聚二甲基硅氧烷(PDMS)层2毫米高,并与一个足迹75×25平方毫米 ,这是由低压等离子体氧化永久性地粘接,以形成不透流体的微流体回路的玻璃显微镜载片制造。通过标准软光刻和副本模塑9制造含有的各通道和细胞培养室的PDMS层。在这项研究中所使用的MOC的微流体设计,包括了每个芯片两个独立的微电路,各持2单元Culture车厢由通道系统100微米高的互连。这允许使用一种多器官芯片两个单独的两组织共培养物的性能。泵送频率被调整,得到40μl/ min的介质的流速。
在生理流动条件下,结合媒体的电路,这两个组织MOC设计提供在共存肝球体和皮肤穿刺活检在不同的文化空间,能力虽然。分化HepaRG细胞用在24比人类肝星状细胞(HHSteC)聚合在一起:1,以形成均匀的球状体。此比率被发现是最佳的,因为在以前的实验中观察到10,即使,肝细胞的近两倍的数量被用来相对于在体内的情况。皮肤栽培在内侧的transwell小细胞培养插管的空气 – 液体界面,从而使局部物质暴露。这些组织模型共培养了28天在MOC AYS证明该系统的全面性。此外,该芯片的微流体通道电路被充分覆盖人皮肤微血管内皮细胞(HDMEC)更紧密地模拟血管系统。
这里所描述的MOC平台代表了稳定而强大的工具,培育各种来源的组织,在动态中流动状况在长期的文化时期10,16。在本实施例中,平台被用于培养原代细胞(HDMEC),来自细胞系产生的组织等同物(肝聚集体),以及前述的共培养与组织活检。操作中心是能够维持三组织共培养长达28天的联合介质回路。以最好的作者的知识,这是第一次已经超过4周进行了多组织共同培养包括活检,原代细胞和细胞系。
一个微流体系统的主要缺点之一是小分子附着于流体回路的表面材料的亲合性。作为表面与体积之比是在微流体系统中特别高的,这样的效果变得更加明显17 </s了>。稳定HDMEC覆盖的通道的,在这里引入,可能作为生物屏障防止分子的粘附到信息操作中心。此外,它可以作为全血循环一个血液相容容器中,防止血液凝固。然而,使用全血作为介质取代是不可行的器官当量的全血管尚未实现。现有的体外组织-生成的血管作品是有前途的,引导的方式继续深造18,19。
它是众所周知的,肝细胞倾向于在静态二维体外培养条件下20随时间失去肝特异性功能。代谢酶,如细胞色素P450家族,是特别重要,如果某药物的代谢是待研究。细胞色素P450 3A4,涉及到许多外源物的生物转化酶,和细胞色素P450 7A,瓦特HICH参与胆汁酸的合成,表达在肝凝集在MOC培养超过14天。这表明代谢活性的表型的保存,允许药物代谢研究。聚集体在比静态培养物中的MOC增加白蛋白生产速率是一个额外的指征适当的培养条件。在这项研究中观察到的白蛋白生产速度是相当的,甚至高于通过微流控芯片,包括HepG2细胞21获得先前报道的价值– 23,但是,值没有达到这些人原代肝细胞培养24。此外,MOC系统,在其临时布局,不允许胆汁的单独隔离。细胞在总量偏振光形成胆小管样结构,如由MRP-2染色。然而,这些小管没有连接到一个信道的技术收集胆汁。这种非生理混合荷兰国际集团与血液隔室中的胆汁在系统的未来重新设计加以解决。
的流量特性的调整是非常重要25,特别是关于组织敏感剪切应力,如肝脏。剪应力由组织所感知的量可以用两种方式进行修改:首先,用于向下推动泵的膜的空气压力可以被降低,在系统中减少峰值剪切应力值。其次,组织可以嵌入在细胞外基质分层或在Transwell小培养插入物进行培养。后者屏蔽从底层当前的组织中的多孔膜。这些调整必须在开始MOC实验前对每个器官相当于在个人基础上进行的。以2.4赫兹的脉动操作中,例如,其对应于144次高,但仍然生理,心脏活动/分钟在人类中,所测定的剪切应力微血管电路的渠道达到约25达因/厘米2。这对应于生理剪切应力在刻度中微血管的较高端的,因此,也适用于实验,包括所述信道的内皮化。然而,由于提出的MOC系统的当前微流体布局仅由一个连接两个器官室介质电路,一泵送速度和剪切应力速率已被选择为整个系统。因此,流动特性,以各单一器官的需要精确的调整并不总是可行的。
此外,保健已采取在调节细胞的共同平台。培养细胞在MOC在组合媒体电路,因此,可用于每种组织模型中没有个别的细胞培养基,如在体外细胞培养的标准。一个最小的组合培养基配方需要事先和T定义他的细胞需要调整逐步到这个新的介质。的80%/ 20%旧到新媒体两天的调整过程中,然后用50%/ 50%,其次是20%/ 80%,并充分交换总是导致培养物在我们手中的一个合理的细胞活力和功能。
信息操作中心系统的当前微流体布局允许多达三个组织的共培养。人体中的至少十个最重要的器官的共存是必要的,以达到动态平衡。因此,提出的系统是能够预测特定组织 – 组织相互作用,而不是一种物质的真实全身反应。商务部的进一步发展,包括更多的器官腔设想。此外,该系统的有效性,是使用一组参考化合物显示。优选地,在临床试验期间(如曲格列酮)已经失败的化合物是其在MOC性能进行测试。然而,这样的复杂系统的真实有效性仍是阻碍BŸ有关的生物标志物和端点的功能评价缺乏标准化,收集有关这一点,类似系统的毒性表现更多的数据将扩大其可靠性和应用领域。
The authors have nothing to disclose.
这项工作一直由德国联邦教育与研究,GO-生物批准号:0315569。
Name of Material/ Equipment | Company | Comments/Description | |
HepaRG cells | Biopredic International | undifferentiated cells | |
HHSteC | ScienCell Research Laboratories | cells and all culture supplements | |
HepaRG Medium | Sigma-Aldrich | William's Medium E 10% FCS 100 U/ml penicillin 100 µg/ml streptomycin 5 µg/ml human insulin 2 mM L-glutamine 5 x 10-5 M hydrocortisone hemisuccinate | |
HDMEC Medium | PromoCell | Endothelial Cell Growth Medium MV2 with Supplement-Pack MV2 and 1% penicillin-streptomycin | |
Dimethyl sulfoxide | Carl Roth | add 2% to HepaRG media | |
Trypsin/EDTA | Biowest | ||
Trypsininhibitor | Carl Roth | ||
MAXYMum Recovery Tips | Corning | 1000 µl Pipet Tips Wide Bore | |
384-Well Hanging Drop Plate | 3D Biomatrix | Perfecta 3D 384-Well Hanging Drop Plate | |
Tissue culture flasks | Corning | 75 cm2 | |
Ultra-low attachment plate | Corning | 24-well | |
Transwell cell culture inserts | Corning | 96-well unit, 0.4 µm pore size | |
Deep well plates | Corning | 96-well, 1 ml | |
Biopsy punch | Stusche | 4.5 mm | |
Glass microscope slide | Menzel | footprint of 75 x 25mm | |
Polydimethylsiloxane | Dow Corning | Sylgard 184 | |
Silicon rubber additive | Wacker Chemie | Wacker Primer G790 | |
Tubes for air pressure | SMC Pneumatik GmbH | Polyurethan-Schlauch, metrisch | |
Alumin ELISA | Bethyl Laboratories | Human Albumin ELISA Quantitation Set | |
Lactate dehydrogenase assay | Stanbio Laboratory | LDH Liqui-UV kit | |
Alexa Fluor 594 acetylated LDL | Invitrogen | 1 mg/ml |